大庆市粮食质量检验监测站
摘要：真菌毒素是是危害粮食和食品的一种物质，它由真菌产生，是食物和粮食发生霉变的原因。有些真菌毒素会对人和动植物产生巨大的影响，造成疾病。小麦粉是我们最常见的一种主食原料，所以小麦粉中真菌毒素的含量受到了很多人的关注。同时原来的办法准确率不高，错在偏差。如果利用色谱检查，已知有毒有害的真菌毒素众多，每一种毒素都要进行重复测定严重影响了检测的速度和成本，本文采用液质联用同位素内标的方法测定小麦粉的7种真菌毒素，大大的增加了检测得效率，同时保障了测定的准确性，是值得推广的一种方法。
关键词：小麦粉；同位素测量；真菌毒素
真菌毒素是一种有真菌在代谢产生的一种排泄废物，通常具有毒性。目前越有近500种的真菌毒素的分子结构已经被确认。经过研究发现，真菌毒素是有机物霉变的重要因素，是降低粮食品质、降低营养价值的元凶之一，有些真菌的毒素被证实对人类有着严重的毒副作用。有可能引起人体组织的癌变、疾病等。对人体造成巨大的损害。也是造成人和动物急性腹泻的罪归祸首之一。对于真菌毒素的监测工作比较通用的方式就使用相应的酶联的方法，这种方法操作简单，也无需相应的器材，但是监测的准确率不高，经常出现监测不准确的显现。所以本文采用的方法是采用同位素色谱的方式来检测小麦粉中真菌毒素的含量和数量，这种办法虽然需要用的一些精密仪器，但是方案可靠，同时受干扰能力强，本文采用乙腈为提取液采用多功能净化柱，利用同位素法测定了实验用途小麦粉中含有的7种毒素。
1、材料与方法
仪器与试剂日本岛津LCM5-8040三重四级杆质谱仪，LabSolutions色谱工作站；MilliQDirect8超纯水机；eppendorF5424台式高速离心机；iKAMS3涡旋振荡器；eppendorF定量可调移液器；0rganomationN-EVNP24氮吹仪；RomerMycoSep226多功能净化住。
1.1试剂制备
乙睛为LCMS级；乙酸铰、氨水为分析纯；超纯水；标准物质：玉米赤霉烯酮（ZEN）、雪腐镰刀菌烯醇（NM、脱氧雪腐镰刀菌烯醇（bON）、隐蔽型脱氧雪腐镰刀菌烯醇CDeepoxy-D0N）、镰刀菌烯酮（FusX）、15一乙酞脱氧雪腐镰刀菌烯醇（15-ADON），3一乙酞脱氧雪腐镰刀菌烯醇C3-ADON），浓度为100μg/ml，U-[15C13-]-脱氧雪腐镰刀菌烯醇，浓度为25.9μg/ml，U-[13C18-]-〕一玉米赤霉烯酮，浓度为25.1}，g加1，以上标准物质均购于Sigma-Aldrich公司。
1.2同位素实验测定含量的方法
1.2.1液相色谱条件WatexsACQUTIYUPLCBEHC18×2.1100mm，1.7μ不锈钢色谱柱；柱温：40℃；进样体积：5闪；流速：0.3ml/min；流动相：A为0.20%氨水，B为乙睛，梯度洗脱程序：4min，5%一20%的B流动相；维持2.5min；6.5一7min，20%一100%的B流动相；维持1min；8一8.5min，100%一5%的B流动相；维持3.5min；
1.2.2质谱条件离子源：电喷雾离子源ES工（）；离子源接口电压：-3.5kV；雾化气流量：氮气3.0L加in；干燥气流量：15L加in；碰撞气：氢气；脱溶剂管温度：250℃；加热模块温度：400℃扫描模式：多反应监测MRM；驻留时问：30ms；延迟时问：1ms；
1.2.3标准溶液的配制分别吸取6种标准溶液100}，l，用乙睛-l0mmol乙酸铰水溶液（（20：80，v肋定容到10ml，制备成6种标准物质浓度为1000ng/ml的标准使用液。分别吸取U-[15C13-]-脱氧雪腐镰刀菌烯醇标准物质0.9652m1，U-[13C18-]-玉米赤霉烯酮标准物质0.9960m1，用乙睛-l0mmol乙酸铰水溶液定容到100m1，得内标物质浓度均为250ng/ml。
1.2.4样品制备称取2.00g精确到0.01样品于50m1离心管中，加入l0ml乙睛+水溶液（C84：
16，V油，再分别加入浓度为250ng加1的U一[13C18J一玉米赤霉烯酮和UU-[15C13-]-脱氧雪腐镰刀菌烯醇内标各200}，1，漩涡lmin，超声l0min。以5000rpm的转速离心10min，取上清液过Mycosep226柱净化，准确吸取5m1净化液于玻璃试管中，在50℃下氮气吹干。再用乙睛-10mmo址乙酸铰水溶液定容至1ml；涡旋1min，过0.22μm微孔滤膜后上机测定。
2结果
2.1液相色谱条件的优化2.1.1色谱柱的选择流量对LC血S有重要影响，实验比较了WatexsACQUITYUPLCBEHC，8C2.1×100mm，1.7μm）和Shim-packXR-ODS（3.0×50mm，2.2μm）色谱柱对目标物的分离效果，在相同的流速下前者分离效果较好，所以其为本实验用的分析柱。
2.1.2流动相的优化由于真菌毒素易溶于乙睛，本实验采用乙睛为强洗脱溶剂，当采用水—乙睛为流动相时，离子化效率差，考虑到在负离子模式下进行检测，加入0.20%氨水，离子化效率明显提高。故本实验采用0.20%氨水—乙睛梯度洗脱。
2.2质谱条件的优化
2.2.1母离子的优化将各真菌毒素配成1μ/ml的单标，不接色谱柱，根据各化合物分了的化学电离性质，分别在ESI（-）和ESI（+）模式下进行Q3Scan，确定各毒素的母离子质量数。各真菌毒素与同位素内标在ESI（-）模式下的离子化效率明显高于ESI（+）模式。
2.2.2子离子的选择以及如何实现良好的撞能优化。实现优化好要用实验的的母离子，将1μg/ml的真菌毒素进同位素标记，在不使用色谱的状况下，对子离子进行电压Q1，Q3电压以及能量的优化，保障实验的质量。优化过后相应度较高的为定性子离子，响应程度差的为定性子离子。
2.3对于实验样本的优化是为了提高检测的灵敏度以及离子的选择度，降低小麦粉中基质对真菌离子的干扰作用。所以实验中还要对提取液的基质进行降低色素因子、蛋白质因子、脂肪等物质的操作。另外要注意排除玉米赤霉烯酮的影响，要对其进行相应的净化工作。本实验的目的是同时检测多种真菌毒素，因此要同时检测小麦粉中7中真菌毒素，采用MycoSep226多功能净化柱对小麦粉净化后，进行检验。同时要满足化合物满足实验中同位素色谱检测的要求。
2.4方法学试验
2.4.1回收率和曲线。去一定量的同位素混标溶液和内标的溶液。用乙腈溶液和乙酸铵溶液稀释含有真菌毒素的溶液2ngml至500ng/ml的试验标准相应的溶液系列，每份溶液均含有同位素25ng/ml，以玉米玉米赤霉烯酮为实验的基准，计算出相应的其他真菌毒素的同位素内标，根据方式计算出相应的参数。
取得实验用小麦粉样品，加入三个溶度的7种真菌毒素混合标准液中，按照1.2.4的方法制成相应溶液，进行测定同位素含量，反复测算6次的结果，同时在于标准液的结果进行计算相应的偏差计算出毒素的回收率数值，结果显示在实验中各个化合物的线性关系较好，有关系数r大于标准的0.9996，可以证明该方法的适用范围广泛，回收率较好，能够满足多种物质同时检测的目标。
2.4.2实际样品检测为了考察7种真菌毒素对小麦粉的污染程度，我们随机抽取了的小麦粉样品204件，其中雪腐镰刀菌烯醇检出率为93.1%，脱氧雪腐镰刀菌烯醇检出率为100%，隐蔽型脱氧雪腐镰刀菌烯醇检出率为97.50%，镰刀菌烯酮未检出，15一乙酞脱氧雪腐镰刀菌烯醇检出率为3.4%，3一乙酞脱氧雪腐镰刀菌烯醇检出率为68.1%，玉米赤霉烯酮检出率为8.30%。
3结论
该实验采用的是同为素的方法测定了小麦粉中存在7种真菌毒素的确实存在。这种方式是采用乙腈作为试验的的提取溶剂，采用净化柱对溶液进行净化，使用四级杆式三重液质和多种方式进行同位素的监测，来证明小麦粉中确实存在7种真菌毒素。这种同位素测定方式流程简单，效果明显，易于观察。适合同时对小麦粉中多种毒素进行检测，减少每一种毒素都要重新检测的步骤，大大减少了检测费用。
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