褐藻胶裂解酶产酶菌株的优选及褐藻寡糖的研究

论文摘要

我国海藻养殖面积广阔,褐藻资源尤其丰富,褐藻胶的年产量一直居于世界首位。褐藻胶分子量大,聚合度高,粘度大,吸收利用度差等特性,限制了其应用范围。因褐藻胶降解产物褐藻寡糖在医药方面具有降血压、降血糖、免疫调节和抗肿瘤等多种生物学活性,其开发利用受到了各国研究学者越来越多的关注。基于寡糖的多功能性,海带多糖的降解及其海带多糖降解菌株或降解酶的筛选是至关重要的。本文首先对高效海带降解菌群的微生物多样性及其褐藻多糖降解酶系进行研究,并筛选获得一株高产褐藻胶裂解酶的菌株Vibrio sp.B4,对其进行发酵条件优化和酶学性质研究,进一步利用其降解褐藻酸钠制备褐藻寡糖,对其降解产物进行分析,为海洋寡糖类创新药物的研究与开发提供前期资料。本文利用高通量测序技术对一组高效海带降解菌群进行宏基因组学分析,研究其微生物多样性及褐藻多糖降解酶系。结果表明,测序数据经过质量控制后共获得36552330条reads,预测得到105145条基因序列,比对显示此高效海带降解菌群中有75.41%的厚壁菌门（Firmicutes）细菌,优势菌属包括Lachnoclostridium、芽孢杆菌属（Bacillus）、类芽孢杆菌属（Paenibacillus）、解硫胺素芽孢杆菌属（Aneurinibacillus）、短芽孢杆菌属（Brevibacillus）。数据显示有4526个基因编码蛋白质具有海带多糖降解相关酶活性,其中糖苷水解酶（glycoside hydrolase,GH）基因数量占比最大（1520）,碳水化合物结合模块（carbohydrate binding module,CBM）（764）、碳水化合物酯酶（carbohydrate esterase,CE）基因（706）和糖基转移酶（glycosyl transferase,GT）（693）比重次之,多糖裂合酶（polysaccharide lyase,PL）基因（107）和辅助氧化还原酶基因（auxiliary activity,AA）（126）数量较少。在不同的GH基因家族,归属于GH109、GH13、GH18和GH43家族的基因较多。此外还发现了少量的纤维小体组分蛋白基因。宏基因组学解析发现海带降解菌群中有丰富的褐藻胶裂解酶、纤维素酶、果胶酶、淀粉酶酶系产酶菌,为进一步开发人工高效褐藻降解菌群及褐藻多糖降解酶提供参考。本文为探索开发高效褐藻胶裂解酶,以褐藻酸钠为唯一碳源筛选培养基,从海带降解菌群、海螺、鲍鱼内脏中共筛选出褐藻胶裂解酶产酶菌株7株;其中鲍鱼内脏来源的弧菌属细菌Vibrio sp.B4酶活较高,且利用电镜观察结果为非典型弧菌。Vibrio sp.B4在筛选平板上呈乳黄色,圆形微凸,不透明,表面湿润光滑,边缘整齐,革兰氏染色阴性,近球状或椭圆状,有鞭毛。对Vibrio sp.B4产褐藻胶裂解酶的发酵条件和发酵培养基进一步优化,获得发酵培养基的最适碳源为褐藻酸钠10 g/L,最适氮源为硫酸铵10 g/L,最适发酵条件为温度30℃,接种量1%,培养基初始pH 6.0。同时对酶活曲线进行测定,菌株在12 h后开始进入稳定生长期,酶活力达到最高值。在单因素实验的基础上,通过Plackett-Burman（PB）筛选出3个影响产酶活力的显著因素:硫酸铵浓度、pH、接种量。通过响应面进一步分析优化,得到最佳的发酵培养基为褐藻酸钠10 g/L,硫酸铵10.91 g/L,NaCl 10 g/L,KH2PO4 1.0 g/L,MgSO4?7H2O 0.5 g/L,CaCl2 0.2 g/L,FeSO4?7H2O 0.02 g/L,最佳发酵条件为温度30℃,接种量1.1%,起始pH 6.07,转速150 rpm。在最佳培养条件下,褐藻胶裂解酶活力可达19.09 U/mL,比基础培养条件下提高了3.67倍。该菌经过产酶发酵条件的优化,酶活力得到较大幅度的提高,且其发酵产酶时间短,可为褐藻胶裂解酶的进一步研究及应用提供参考。将Vibrio sp.B4生产的褐藻胶裂解酶命名为AL-B4,使用阴离子交换色谱、凝胶排阻色谱等方法对其进行分离纯化,采用SDS-PAGE电泳检测获得纯酶的单一条带;然后对酶AL-B4的酶学性质进行初步分析,结果显示酶AL-B4的最适作用温度40℃,最适作用pH为8.0,酶在pH 6.0-8.0范围内以及35℃以下稳定;金属离子Al3+、Zn2+及SDS、EDTA对酶活有较强抑制作用,Cu2+离子使酶AL-B4几乎无活性;Na+、Co2+、Fe3+对酶活有促进作用,且Mn2+对酶AL-B4有较强促进作用,而K+、Ca2+、Mg2+、Ba2+对酶活没有太大影响;氯化钠可以大幅度提高该酶的活性,在氯化钠浓度为0.75 mol/L-1.5 mol/L时酶活最大;在底物特异性研究中,该褐藻胶裂解酶可以同时降解甘露糖醛酸和古罗糖醛酸。利用获得的酶AL-B4酶解褐藻酸钠溶液,以超滤除去大分子蛋白等杂质后,冷冻干燥得到褐藻寡糖,将褐藻寡糖进行TLC、HPLC、LC-MS分析。TLC鉴定酶解获得的褐藻寡糖主要是六个组分,进一步经HPLC、LC-MS分析,结果为单糖至六糖。通过对降解产物的研究,为褐藻胶裂解酶的商业化应用提供了重要的研究基础,也为褐藻寡糖的酶法制备提供了良好的酶源。

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摘要

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引言

第一部分海带降解菌群微生物多样性及其褐藻多糖降解酶系分析

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

1.2 海带降解菌群采集与保存

1.3 海带降解菌群宏基因组分析样品的制备

1.4 海带降解菌群宏基因组DNA的提取

1.5 海带降解菌群宏基因组测序

1.6 海带降解菌群宏基因组测序结果分析

2 结果

2.1 海带降解菌群宏基因组DNA的提取

2.2 海带降解菌群宏基因组测序产出数据

2.3 海带降解菌群Non-Redundant数据库注释分析

2.3.1 海带降解菌群基于门级别注释结果

2.3.2 海带降解菌群基于属和种级别注释结果

2.4 海带降解菌群CAZyme数据库比对结果

3 讨论

4 小结

第二部分褐藻胶裂解酶产酶菌株的筛选鉴定

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

1.2 褐藻胶裂解酶产酶菌株的分离筛选

1.3 16S rDNA鉴定

1.4 革兰氏染色

2 结果

2.1 褐藻胶裂解酶产生菌的筛选

2.2 菌株分子鉴定及发育分析

2.3 菌种显微观察及形态特征

3 讨论

4 小结

第三部分 Vibrio sp.B4 产褐藻胶裂解酶发酵条件优化

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

1.2 酶活性测定方法

1.2.1 葡萄糖醛酸标准曲线的绘制

1.2.2 褐藻胶裂解酶活性测定方法

1.3 单因素发酵条件优化

1.4 Plackett-Burman实验

1.5 Box-Behnken实验

2 结果

2.1 葡萄糖醛酸标准曲线

2.2 单因素发酵条件优化实验结果分析

2.2.1 不同氮源及浓度对产酶的影响

2.2.2 不同碳源及浓度对产酶的影响

2.2.3 培养温度对产酶的影响

2.2.4 接种量对产酶的影响

2.2.5 转速对产酶的影响

2.2.6 初始pH对产酶的影响

2.2.7 菌株B4产酶时间曲线

2.3 Plackett-Burman实验结果分析

2.4 响应面分析法优化发酵条件结果分析

2.5 产酶结果验证

3 讨论

4 小结

第四部分褐藻胶裂解酶的分离纯化及酶学性质研究

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

1.2 粗酶液制备

1.3 酶活测定方法

1.4 BCA蛋白浓度测定方法

1.5 阴离子交换色谱分离

1.6 凝胶排阻色谱分离

1.7 聚丙烯酰胺凝胶（SDS-PAGE）电泳

1.8 褐藻胶裂解酶AL-B4酶学性质研究

1.8.1 酶的最适温度

1.8.2 酶的最适pH

1.8.3 pH对酶稳定性的影响

1.8.4 温度对酶稳定性的影响

1.8.5 不同金属离子及SDS、EDTA对酶活性的影响

1.8.6 氯化钠浓度对酶的影响

1.8.7 底物特异性

2 结果

2.1 牛血清蛋白标准曲线

2.2 阴离子交换色谱分离

2.3 Superdex?7510/300GL柱色谱分离

2.4 聚丙烯酰胺凝胶（SDS-PAGE）电泳

2.5 褐藻胶裂解酶AL-B4的酶学性质

2.5.1 酶的最适温度

2.5.2 酶的最适pH

2.5.3 pH对酶稳定性的影响

2.5.4 温度对酶稳定性的影响

2.5.5 不同金属离子及SDS、EDTA对酶活的影响

2.5.6 氯化钠浓度对酶活性的影响

2.5.7 底物特异性

3 讨论

4 小结

第五部分褐藻寡糖的生物法制备及分析

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

1.2 褐藻寡糖制备过程

1.3 褐藻寡糖薄层色谱（TLC）分析及还原糖含量测定

1.4 褐藻寡糖聚合度分析

1.4.1 褐藻寡糖高效液相色谱（HPLC）分析

1.4.2 褐藻寡糖液质联用（LC-MS）分析

2 结果

2.1 褐藻寡糖制备

2.2 褐藻寡糖TLC分析及还原糖含量测定

2.3 褐藻寡糖聚合度分析

2.3.1 褐藻寡糖HPLC分析

2.3.2 褐藻寡糖LC-MS分析

3 讨论

4 小结

结论

参考文献

综述

综述参考文献

攻读学位期间的研究成果

致谢

文章来源

类型: 硕士论文

作者: 周敏

导师: 高华,冷凯良

关键词: 褐藻胶,褐藻胶裂解酶,褐藻寡糖,发酵优化,酶学性质

来源: 青岛大学

年度: 2019

分类: 基础科学,农业科技

专业: 生物学,水产和渔业

单位: 青岛大学

分类号: S917.3;Q93

DOI: 10.27262/d.cnki.gqdau.2019.001616

总页数: 81

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