苗佩宏[1]2004年在《hTERT蛋白表达及其模拟表位筛选》文中指出端粒是真核细胞线性染色体末端特殊的DNA蛋白质结构，其长度的维持即正常的端粒功能依赖于端粒酶的激活，由于端粒酶的表达与肿瘤的密切相关使得端粒和端粒酶成为很有潜能的研究靶点。因此，有可能通过对端粒及端粒酶的结构和功能的探索寻找到理想的抗肿瘤以及衰老相关性疾病的有效治疗方法。 目前，组成人端粒酶复合物的3个主要成分已被鉴定，其中最重要的一种组分是人端粒酶催化亚基(hTERT)，研究表明：hTERT是人端粒酶复合物的核心成分之一，其基因表达状态是细胞调控端粒酶活性的主要环节。hTERT在大部分恶性肿瘤细胞中表达，在正常组织中不表达，hTERT的表达与端粒酶活性密切相关，是端粒酶的催化亚基和酶活性的限速决定因子。hTERT属于逆转录酶家族的成员，包含7个保守的逆转录酶基序(RT motifs)和一个端粒酶特异的基序(T motif)，它们是端粒酶发挥作用的必要条件。这些结果提示hTERT在细胞中的表达是决定端粒酶活性的主要因素，因此研究hTERT基因表达的调控机制并设计针对hTERT的小分子抑制剂是揭示端粒酶为开发靶点的一个关键步骤，可能对衰老、肿瘤发生等重大生物学问题的解决产生深远的影响。 噬菌体表面展示技术是一种对多肽功能非常有效的筛选技术，它将外源蛋白分子或多肽的基因克隆到丝状噬菌体基因组中，与噬菌体外膜蛋白融合表达，展示在噬菌体颗粒的表面。由于外源蛋白或多肽的基因型和表型统一在同一噬菌体颗粒内，因此，通过表型筛选就可以获得它的编码基因，所以说，噬菌体展示技术为筛选小分子活性物质提供了重要的技术支持。 本研究通过端粒酶逆转录功能区融合蛋白的表达，抗端粒酶催化亚基抗体的制备，并以此纯化抗体为靶分子筛选噬菌体线性十二肽库，从而获得模拟端粒酶逆转录功能区表位的短肽序列，为研究开发端粒酶逆转录酶的小分子抑制剂奠定基础，包括以下叁个方面：一、用基因工程的方法表达出包含所有基序的端粒酶催化亚基: 自行设计引物，以pLPC一hTERT为模板扩增出长为1 3 1 obP的基因片段，此片段包括端粒酶发挥逆转录功能所需的全部8个基序。将PCR扩增的此片段克隆至带有6个连续组氨酸标签的原核表达载体pET一32a中，IPTG诱导表达后，用SDS一PAGE和W七stem一Blot检测确定表达出端粒酶逆转录功能区融合蛋白。以SM尿素溶解以包涵体形式存在的目的蛋白，然后用金属鳌合层析柱通过Ni与组氨酸的鳌合作用纯化融合蛋白并对之进行复性，获得具有生物活性的hTERT蛋白。二、制备鼠抗hTERT多克隆抗体: 用端粒酶逆转录功能区融合蛋白常规免疫昆明鼠制备鼠抗hTERT多克隆抗体，经SPG柱纯化后，Dot一ELISA鉴定此抗体与hTERT融合蛋白的结合，ELISA检测多克隆抗体的效价。结果表明制备的抗体能够特异地与hTERT蛋白结合，获得的鼠抗hTERT多抗血清效价达到l:64000，符合下一步作为靶分子筛选肤库的要求。叁、模拟端粒酶逆转录功能区表位的筛选: 以纯化的鼠抗hTERT多抗和正常鼠IgG为靶，差减筛选噬菌体线性12肤库，获得模拟hTERT表位的短肤序列，所得阳性克隆通过夹心ELISA、抗hTERT多抗特异性阻断实验、竞争抑制实验表明能够模拟hTERT的表位，搜索FASTA，BLAsT数据库，所获得的11个不同序列富含组氨酸(最高达41.6%)及亲水氨基酸(最高达91.67%)，但它们没有共同的保守基序，且与己知序列无相似性，与hTERT序列亦无同源性，可能模拟的是hTERT的非线性表位，也为今后研制针对hTERT的小分抑制剂提供了实验依据。
苗佩宏, 刘北一, 郑山根, 庞建新, 徐江平[2]2004年在《人端粒酶逆转录酶功能区表位的筛选与鉴定》文中研究说明目的筛选并鉴定人端粒酶逆转录酶(hTERT)功能区表位。方法应用差减筛选法,以抗hTERT多克隆抗体为靶筛选噬菌体12肽库,通过夹心ELISA、抗hTERT多抗特异性阻断实验、竞争抑制实验鉴定阳性噬菌体克隆并测序。结果经3轮筛选,从随机挑取的24个噬菌体克隆中有13个克隆特异地与抗hTERT多抗结合,而不与正常小鼠IgG结合,其中11个克隆的氨基酸序列富含组氨酸(最高达41.6%)及亲水氨基酸(最高达91.67%)。结论得到11个序列不同的hTERT表位,为研制针对hTERT的小分子抑制剂提供了实验依据。
佚名[3]2004年在《国家自然科学基金委员会生命科学部2004年度资助自由申请科学基金项目一览表》文中指出项 目 名 称申请者姓名单 位 名 称1 微生物学学科 (104项)粘细菌的种属分子分类及菌株分子鉴别技术吴志红山东大学野生稻内生固氮菌系统发育及分子遗传研究谭志远华南农业大学中国鸡皮衣科地衣分类学研究赵遵田山东师范大学拟盘多毛孢属及邻近属分子系统学研究
段玲欣[4]2009年在《旋毛虫与Sp2/0骨髓瘤细胞相关抗原基因抗肿瘤效应研究》文中研究指明为筛选旋毛虫与Sp2/0骨髓瘤细胞相关抗原基因,观察其抗肿瘤效果,以探讨其抗肿瘤机制,本研究首先构建了旋毛虫cDNA表达文库,用抗Sp2/0骨髓瘤细胞的多克隆抗体对文库进行筛选,获得旋毛虫与Sp2/0骨髓瘤细胞相关抗原基因,利用5’-RACE技术进行末端快速扩增获得全长后,将该基因在真核表达载体中表达。应用斑点杂交技术对相关抗原基因进行定位,并进行小鼠抗肿瘤试验。实验结果表明,成功构建了旋毛虫肌幼虫cDNA表达文库,文库容量为1.9×106pfu/mL,重组率为97.5%,扩增后文库滴度为1.6×109pfu/mL。经过3轮筛选,获得一个旋毛虫肌幼虫相关抗原基因片段,通过5’-RACE扩增该基因全长,测序结果显示TS2全长为569bp,含有一大小为411bp的开放阅读框。将其命名为TS2。登陆NCBI进行Blast比对发现该基因为核糖体蛋白S24基因,与DNA修复、细胞发育调控和细胞分化有关。ELM服务器分析结构域,表明此序列蛋白质含有4个精氨酸二元转移酶切割位点,1个羧基肽酰胺化位点和1个氨基葡聚糖附着位点。核酸疫苗重组质粒pVAX1-TS2转染Hela细胞,PCR和Western blotting检测结果表明目的基因在其中得到正确转录和表达,表达蛋白具有反应原性。应用核酸疫苗重组质粒免疫小鼠进行的体内抗肿瘤试验表明,试验组小鼠产生了特异的细胞免疫应答,CD3+、CD4+T淋巴细胞均进行了有效增殖。试验组和对照组肿瘤体积和重量的统计学分析比较表明,旋毛虫核酸疫苗重组质粒的抑瘤效果明显高于对照组。
曹伟军[5]2008年在《hTERT启动子调控的CD：UPRT/5-FC融合自杀基因系统对人胃癌细胞靶向杀伤作用的研究》文中提出背景与目的:胃癌是最常见的恶性肿瘤之一。在世界范围内,胃癌是第四大最常见恶性肿瘤,居恶性肿瘤死亡原因的第二位。虽然早期胃癌术后5年生存率可达95%以上,但大多数患者在就诊时己经处于进展期。进展期胃癌由于手术切除率低,放化疗毒副作用大,肿瘤多药耐药等问题,其疗效仍难以令人满意,所以寻找一种新的治疗方法成为目前胃癌研究的一个重要课题。随着肿瘤分子生物学技术及基因工程的发展,基因治疗为恶性肿瘤提供了一种新的治疗手段,其中自杀基因治疗因毒副作用小和强大的旁观者效应备受关注。自杀基因治疗(suicide gene therapy)是将能编码某种特殊酶的基因导入肿瘤细胞,使无毒的前药代谢为细胞毒性活性代谢产物,从而引起肿瘤细胞死亡,并通过旁观者效应杀伤其周围细胞。胞嘧啶脱氨酶:尿嘧啶磷酸核糖转移酶/5-氟胞嘧啶(cytosine deaminase:uracilphosphoribosyltransferase/5-Fluorocytosine,CD:UPRT/5-FC)融合自杀基因系统由CD/5-FC自杀基因系统发展而来。CD基因产物将无毒的5-FC转变为有细胞毒性的5-氟尿嘧啶(5-Fluorouracil,5-FU)从而发挥抗瘤作用。但是CD/5-FC系统在有些肿瘤的治疗中效果不理想,这些细胞表现出对5-FU的一定程度的耐药。尿嘧啶磷酸核糖转移酶(uracil phosphoribosyltransferase,UPRT)是来源于细菌等微生物中的一种嘧啶补救酶,能直接催化5-FU转化为5-FUMP,从而显着提高5-FU的疗效,并可逆转肿瘤细胞对5-FU的继发耐药。CD:UPRT/5-FC系统在结肠癌、前列腺癌、卵巢癌中均取得显着疗效,在胰腺癌的治疗中的效果不理想,其对胃癌的治疗效果未见报道。靶向性问题是目前基因治疗的关键问题之一,达到基因治疗靶向性的常用策略之一是靶向性转录,即利用肿瘤或组织特异性启动子作为顺式作用元件,调控下游目的基因转录,从而使目的基因仅在特定的细胞中表达,达到靶向治疗的目的。目前常用的启动子有癌胚抗原(CEA)启动子、甲胎蛋白(AFP)启动子、MUC1启动子等,但是它们有些在胃癌中的阳性率较低,有些在胃癌中的转录活性较弱,从而限制了它们在胃癌基因治疗中的应用。端粒酶是一种广谱的肿瘤标志物,它可以通过在真核细胞染色体的端粒上添加特殊的序列(端粒重复序列)来延长和稳定端粒,在细胞永生化及恶性肿瘤的发生发展过程中起重要作用。85%以上的人类肿瘤细胞具有端粒酶活性,而绝大多数正常体细胞无端粒酶活性。人端粒酶逆转录酶(human telomerase reverse transcriptase,hTERT)是端粒酶的催化亚单位,是端粒酶活性的主要决定因素。研究表明,hTERT的表达调控主要发生在转录水平,因此hTERT启动子可作为顺式作用元件调控下游基因在端粒酶阳性的肿瘤细胞中特异性的表达。本研究的目的是探讨hTERT启动子调控的CD:UPRT/5-FC融合自杀基因系统体内外靶向杀伤胃癌细胞的可能性及方法,为胃癌的基因治疗提供新的思路。方法:1、以HeLa细胞基因组DNA为模板,用PCR法克隆hTERT核心启动子,克隆入荧光素酶报告基因载体pGL3-Basic,构建成hTERT-pGL3Basic荧光素酶报告基因重组载体。应用脂质体转染法将hTERT-pGL3Basic转染人胃癌细胞SGC7901和正常人成纤维细胞HLF,检测hTERT启动子在这两株细胞中的转录活性。2、利用基因重组技术构建hTERT启动子调控的CD:UPRT自杀基因表达载体hTERT-CD:UPRT。将hTERT-CD:UPRT和由CMV启动子调控的pcDNA3.1-CD:UPRT分别转染SGC7901细胞和HLF细胞,筛选稳定表达细胞株,用RT-PCR和Western blot方法检测CD基因的表达,用MTT法检测5-FC对转染细胞的杀伤作用及旁观者效应,用流式细胞术测定细胞凋亡率。3、用SGC7901细胞构建裸鼠胃癌皮下移植瘤模型,用脂质体包裹法局部转导hTERT-CD:UPRT,观察移植瘤的生长抑制情况。观察30天后,瘤组织做常规病理检查和免疫组化观察CD基因的表达。结果:1、成功克隆hTERT核心启动子;荧光素酶活性检测显示,hTERT启动子在SGC7901细胞中的转录活性为阳性对照pGL3-Control的(21.5±2.2)%,而在HLF细胞中的活性仅为阳性对照的(0.4±0.1)%。2、成功构建hTERT启动子调控的CD:UPRT自杀基因表达载体,转染hTERT-CD:UPRT的SGC7901细胞在mRNA和蛋白质水平均可检测到CD的表达,5-FC对其有明显的杀伤作用,流式细胞术显示细胞凋亡率明显增高;转染hTERT-CD:UPRT的HLF细胞未检测到CD的表达,5-FC对其无明显的杀伤作用。而转染pcDNA3.1-CD:UPRT的SGC7901细胞和HLF细胞在mRNA和蛋白质水平均可检测到CD的表达,5-FC对其都有明显的杀伤作用,流式细胞术显示细胞凋亡率均明显增高。旁观者效应实验显示当转染hTERT-CDUPRT的SGC7901占总细胞数的10%时,细胞存活率仅48.4%。3、动物实验表明,A组(瘤内注射hTERT-CD:UPRT+腹腔注射5-FC组)移植瘤的生长受到显着抑制,第30天肿瘤体积为(1.10±0.13)cm~3,B组(瘤内注射hTERT-CD:UPRT+腹腔注射PBS组)和C组(单纯腹腔注射PBS组)的肿瘤体积分别为(2.72±0.35)cm~3和(2.67±0.30)cm~3。病理结果显示A组大量肿瘤细胞稀疏分散,有大片坏死红染区,部分肿瘤细胞核固缩、核碎裂;B组和C组则见大量肿瘤细胞排列紧密,细胞核大深染,核分裂像多见。免疫组化染色显示A组和B组肿瘤组织有明显CD蛋白表达;C组肿瘤组织免疫组化染色呈阴性。结论:1、hTERT启动子在人胃癌细胞SGC7901中有较强的转录活性,在端粒酶阴性的正常人成纤维细胞中仅有背景活性。2、hTERT启动子调控的CD:UPRT/5-FC融合自杀基因系统能在体内外靶向性杀伤胃癌细胞SGC7901,为胃癌的基因治疗提供了新的思路。
郑华[6]2010年在《筛选肺腺癌相关血清自身抗体标志物》文中认为背景与目的:肺腺癌是肺癌中发病率最高的一种病理类型,大部分肺腺癌患者确诊时已为晚期,失去了最佳治疗时机。寻找出肿瘤标志物使其在早期发现肺癌是目前亟待解决的问题。本研究联合T7噬菌体展示技术(Phage display)和重组cDNA表达文库血清学分析(Serological analysis of recombinant cDNA expression library, SEREX)技术筛选肺腺癌相关抗原,以检测血清中肺腺癌相关自身抗体标志物。方法:用10例肺腺癌和10例健康对照血清池(Pooled sera)对已构建好的肺腺癌T7噬菌体展示cDNA文库进行4轮生物淘选(Biopanning),用另20例肺腺癌血清池对4轮淘选后文库进行SEREX筛选。将筛选出来的阳性克隆克隆用96针手动阵列点样仪(96 Solid Pin Multi-Blot Replicator)点在硝酸纤维素膜上形成8×12阵列,并与40份单个血清(26例肺腺癌和14例健康对照)反应,通过聚类分析(Cluster Analysis)建立自身抗体检测模型。对模型中克隆进行测序,在GeneBank数据库中进行同源性比较。用193例单个血清(87例肺腺癌、77例健康对照和29例肺结核血清)进行模型验证。对结果进行判别分析(Discriminant Analysis)及交互校验(Leave-one-out cross validation)及其他统计分析。结果:共筛选约22,000个噬菌体克隆,挑选出90个阳性克隆。建立了19个克隆组成的自身抗体检测模型,通过验证模型确定了几组自身抗体标志物。1为诊断性自身抗体标志物;2为肺腺癌与健康对照和肺结核鉴别的自身抗体标志物;3为鉴别肺腺癌与肺结核的自身抗体标志物,这叁组标志物的敏感性、特异性均大于80.0%。在诊断性自身抗体标志物中,有些自身抗体与性别、淋巴结转移及T分期相关,当与CEA比较时,敏感性比CEA高,特异性比CEA稍差,与CEA联合检测时,敏感性不变,特异性略有增高。在19个克隆中,没有一个展示肽段来源于人类正确的读码框,其中8个来源于移位的读码框,2个来源于插反了的序列,2个序列不是CDS,2个没有匹配的mRNA,还有5个是预测的miscRNA。结论:联合T7噬菌体展示技术和SEREX技术筛选了肺腺癌相关抗原,并且其相关自身抗体为有效的诊断与鉴别诊断的标志物,可以用于肺腺癌的筛查。
佚名[7]2004年在《《解放军医学杂志》2004年(第29卷)主题词索引》文中提出(按汉语拼音字母顺序排列 )数字和字母cDNA微阵列技术 IL 8在强直性脊柱炎活动期的表达与意义 (李天旺等 ) 2 9(6 ) :4 79CTLA4 CTLA4Ig基因修饰的骨髓基质细胞抑制淋巴细胞活化的实验研究 (梁后杰等 ) 2 9(7) :5
佚名[8]2002年在《作者索引》文中研究表明(按汉语拼音字母顺序排列,索引论文前3位作者)AAdrian W Gelb Development 0f anaesthesiology (15):1 345一1346艾玉峰应用带蒂皮瓣、肌皮瓣修复小腿骨外露、骨髓炎创面 (2):183 组织工程骨复合骨
陈婷[9]2007年在《肝素酶HLA-A2.1限制性CTL表位的预测、鉴定及其抗肿瘤的免疫效应研究》文中研究说明[背景和目的]生物治疗是继手术、放疗和化疗之后临床治疗恶性肿瘤的第四种治疗模式。随着对机体抗肿瘤免疫机制的深入研究，人们已经认识到诱发体内细胞毒T淋巴细胞(Cytotic T Lymphocyte，CTL)发挥抗瘤作用的并不是整个肿瘤抗原分子，而是与MHC分子结合的短肽即CTL表位(epitopes)，因此，寻找特异性肿瘤抗原及其相应的CTL表位成为肿瘤免疫治疗的关键。树突状细胞(Dendritic cells,DC)作为体内最强大的抗原提呈细胞，是免疫应答过程的始动者和调节者。负载CTL表位的DC疫苗因其免疫原性好、副作用小、便于应用等优势而成为目前抗肿瘤治疗研究的一个热点。肝素酶(Heparanase，Hpa)是近年来新发现的一个肿瘤转移相关基因，在正常组织中仅低表达于淋巴细胞和骨髓等免疫组织，但在几乎所有的转移性恶性肿瘤细胞中普遍存在，而且表达的水平与肿瘤的转移、TMN分期等临床预后不良指标明显相关，肝素酶已成为中晚期肿瘤治疗的一个良好靶位。那么肝素酶能否作为一种肿瘤相关抗原用于肿瘤的免疫治疗?我们过去的研究表明，肝素酶全长基因负载的DC体外可以诱导肝素酶特异性CTL，对肝素酶阳性且MHC相匹配的胃癌细胞具有杀伤作用，而对肝素酶阳性但MHC不相匹配的胃癌细胞不具有杀伤效应，提示肝素酶氨基酸全长序列中一定存在能诱导特异性CTL反应的抗原表位。本研究的目的在于寻找存在于肝素酶全长序列中的能够有效激发机体抗肿瘤效应的CTL表位。鉴于HLA-A2．1是中国人群中最为常见的HLAⅠ类分子的型别，阳性率高达50％，因此鉴定肿瘤转移相关抗原Hpa的HLA-A2．1限制性CTL表位将会对中国人群中肝素酶表达阳性的恶性肿瘤提供免疫治疗的基础。[方法]1、采用超基序和量化基序相结合的方法对肝素酶的HLA-A2．1限制性CTL表位进行预测，并用分子模拟技术模拟表位肽与MHC分子结合的空间构象，分析结合参数以进一步提高预测的准确性，然后从结果中选取得分较高的5条肝素酶表位肽进行合成、纯化、分子量鉴定，利用T_2细胞的特点对合成的候选肽与HLA-A2．1分子的进行亲和力分析；采用标准~(51)Cr释放实验检测上述肝素酶表位肽负载DC后诱导的肝素酶特异性CTL对KATO-Ⅲ胃癌细胞的免疫杀伤效应，从而筛选出能够有效激活CTL反应的肝素酶抗原表位。2、采用密度梯度离心法分离并得到人外周血单个核细胞，利用rhGM-CSF、rhIL-4及rhTNF-α诱导扩增人成熟树突状细胞，并从形态学、细胞表面CD分子进行鉴定；用上述筛选的候选肽负载DC诱导产生特异性CTL，采用标准~(51)Cr释放实验检测肝素酶特异性CTL对KATO-Ⅲ胃癌细胞(Hpa~+，HLA-A2．1~+)、U-2OS骨肉瘤细胞(Hpa~+，HLA-A2．1~+)、SW480结肠癌细胞(Hpa~+，HLA-A2．1~+)、MCF-7乳腺癌细胞(Hpa~-，HLA-A2．1~+)、HepG2肝癌细胞(Hpa~+，HLA-A2．1~-)以及转染了肝素酶全长基因的MCF-7／Hpa乳腺癌细胞(Hpa~+，HLA-A2．1~+)和转染了HLA-A2．1基因的HepG2／HLA-A2．1肝癌细胞(Hpa~+，HLA-A2．1~+)的免疫杀伤效应；采用HLA-A2．1单克隆抗体封闭上述靶细胞的HLA-A2．1位点，或以CD8单克隆抗体封闭效应细胞的CD8位点，再用肝素酶表位特异性CTL杀伤KATO-Ⅲ胃癌细胞，以研究筛选的肝素酶表位是否受HLA-A2．1限制以及CTL效应细胞的来源；采用标准~(51)Cr释放实验研究肝素酶特异性CTL对自体淋巴细胞的免疫杀伤活性，以确定其可能存在的毒副作用；采用ELISPOT技术检测肝素酶特异的效应细胞IFN-γ释放情况。3、将上述筛选的肝素酶候选表位负载C57BL／6-Tg(HLA-A2．1)1Enge／J小鼠骨髓来源的DC(mDC)后，免疫小鼠叁次，取其脾淋巴细胞作为效应细胞，采用~(51)Cr释放实验检测肝素酶特异性CTL对KATO-Ⅲ、U2OS、SW480、MCF-7、MCF-7／Hpa、HepG2、HepG2／HLA-A2．1细胞以及自体淋巴细胞和mDC的杀伤效应；ELISPOT技术检测肝素酶特异的效应细胞IFN-γ释放情况。[结果]1、采用超基序和量化基序方法联合预测出5条得分最高肝素酶表位肽：Hpa(525-533)(PAFSYSFFV)、Hpa(353-361)(PLLSDTFAA)、Hpa(277-285)(KMLKSFLKA)、Hpa(400-408)(PLPDYWLSL)、Hpa(405-413)(WLSLLFKKL)；T_2细胞亲和力分析发现预测的5条多肽均能与T_2细胞有效结合；采用标准~(51)Cr释放实验检测上述肝素酶表位肽负载DC后诱导的肝素酶特异性CTL对KATO-Ⅲ胃癌细胞的免疫杀伤效应，结果表明，Hpa(525-533)、Hpa(277-285)、Hpa(405-413)诱导的CTL对KATO-Ⅲ胃癌细胞具有明显的杀伤效应，而Hpa(353-361)和Hpa(400-408)诱导的CTL对KATO-Ⅲ胃癌细胞的杀伤效应与阴性肽相同，提示Hpa(525-533)、Hpa(277-285)、Hpa(405-413)可能是肝素酶特异性抗原表位。2、采用密度梯度离心法分离HLA-A2．1阳性健康志愿者外周血中的单个核细胞(PBMC)，用重组人细胞因子GM-CSF、IL-4及TNF-α联合诱导扩增，经形态学观察以及采用流式细胞术对细胞表面CD分子进行鉴定，成功制备了PBMC来源的成熟DC；采用标准~(51)Cr释放实验检测Hpa(525-533)、Hpa(277-285)、Hpa(405-413)表位负载DC后诱导的肝素酶特异性CTL对不同来源肿瘤细胞的免疫杀伤效应，结果表明，肝素酶特异性CTL对肝素酶阳性且HLA-A2．1阳性的KATO-Ⅲ、U2OS和SW480细胞具有明显的杀伤效应，而对肝素酶阴性但HLA-A2．1阳性的MCF-7细胞和肝素酶阳性但HLA-A2．1阴性的HepG2细胞均不具有杀伤效应，但对转染了肝素酶全长基因的MCF-7细胞(MCF-7／Hpa)和转染了HLA-A2．1全长基因的HepG2细胞(HepG2／HLA-A2．1)重新产生明显的免疫杀伤效应，提示肝素酶抗原表位诱导的CTL反应是肝素酶特异、且受HLA-A2．1限制；用HLA-A2．1和CD8分子的单抗分别封闭靶细胞表面的HLA-A2．1位点和效应细胞表面的CD分子后再进行杀伤实验，结果表明肝素酶特异性CTL对封闭了HLA-A2．1的KATO-Ⅲ细胞无明显杀伤效应，封闭了CD8的效应细胞对KATO-Ⅲ细胞亦无明显杀伤效应，进一步提示这种杀伤效应是HLA-A2．1限制，CTL效应细胞来源于CD8阳性的T淋巴细胞；采用标准~(51)Cr释放实验验检测上述肝素酶抗原表位诱导的肝素酶特异性CTL对自体淋巴细胞的免疫杀伤效应，结果表明肝素酶特异性CTL对自体淋巴细胞无明显杀伤效应，提示肝素酶多肽疫苗的安全性(表1)；采用ELISPOT技术检测肝素酶特异性效应细胞IFN-γ的分泌能力，结果表明，肝素酶抗原表位能促进效应细胞IFN-γ的分泌。3、用上述肝素酶表位肽负载C57BL／6-Tg(HLA-A2．1)1Enge／J小鼠骨髓来源的DC(mDC)，然后免疫小鼠叁次，取其脾淋巴细胞作为效应细胞，以不同来源的多种肿瘤细胞作为靶细胞，用~(51)Cr释放法检测杀伤效应，实验结果表明，肝素酶表位特异性的CTL对肝素酶阳性且HLA-2阳性的KATO-Ⅲ、U2OS和SW480细胞具有明显的杀伤效应，而对肝素酶阴性但HLA-A2．1阳性的MCF-7细胞和肝素酶阳性但HLA-A2．1阴性的HepG2细胞均不具有杀伤效应，但对感染了肝素酶全长基因的重组腺病毒(rAd-Hpa)的MCF-7乳腺癌细胞(MCF-7／rAd-Hpa)和转染HLA-A2．1的HepG2／HLA-A2．1细胞亦重新产生明显的杀伤效应，对自体淋巴细胞和mDC亦无明显杀伤效应(表1)。ELISPOT技术检测肝素酶抗原表位能有效促进肝素酶特异性效应细胞分泌IFN-γ。[结论]1、采用超基序和量化基序法并通过体外杀伤实验从肝素酶的全长氨基酸序列中筛选出了3条HLA-A2．1限制的CTL表位，即Hpa(525-533)(PAFSYSFFV)、Hpa(277-285)(KMLKSFLKA)、Hpa(405-413)(WLSLLFKKL)，以上肝素酶抗原表位与德国学者的报道不同。2、从体外及动物实验二方面证实肝素酶抗原表位Hpa(525-533)、Hpa(277-285)、Hpa(405-413)可以诱导产生肝素酶特异性CTL，对肝素酶阳性且HLA-A2．1相匹配的肿瘤细胞具有很强的免疫杀伤活性，对肝素酶阴性或HLA-A2．1阴性的肿瘤细胞不具有杀伤效应，但对转染了肝素酶或HLA-A2．1的肿瘤细胞具有杀伤效应，提示肝素酶抗原表位诱导的CTL反应是肝素酶特异且受HLA-A2．1限制，肝素酶特异性CTL主要来源于CD8阳性T淋巴细胞。3、从体外及动物实验二方面证实肝素酶特异性CTL对自体淋巴细胞和／或DC无明显的免疫杀伤活性，提示肝素酶多肽疫苗临床应用的安全性。4、从体外及动物实验二方面证实肝素酶抗原表位Hpa(525-533)、Hpa(277-285)、Hpa(405-413)负载的DC可以促进效应细胞IFN-γ释放。以上研究表明，人肝素酶特异性抗原表位[Hpa(525-533)、Hpa(277-285)、Hpa(405-413)]不仅能激发机体特异性的抗肿瘤效应，而且还能诱导一个非特异性抗肿瘤的良性循环，这种肝素酶多肽疫苗具有广谱、高效、特异、安全的优点，为肝素酶表位多肽疫苗的临床应用提供了理论依据。
参考文献：
[1]. hTERT蛋白表达及其模拟表位筛选[D]. 苗佩宏. 第一军医大学. 2004
[2]. 人端粒酶逆转录酶功能区表位的筛选与鉴定[J]. 苗佩宏, 刘北一, 郑山根, 庞建新, 徐江平. 第一军医大学学报. 2004
[3]. 国家自然科学基金委员会生命科学部2004年度资助自由申请科学基金项目一览表[J]. 佚名. 生命科学. 2004
[4]. 旋毛虫与Sp2/0骨髓瘤细胞相关抗原基因抗肿瘤效应研究[D]. 段玲欣. 吉林大学. 2009
[5]. hTERT启动子调控的CD：UPRT/5-FC融合自杀基因系统对人胃癌细胞靶向杀伤作用的研究[D]. 曹伟军. 中南大学. 2008
[6]. 筛选肺腺癌相关血清自身抗体标志物[D]. 郑华. 北京市结核病胸部肿瘤研究所. 2010
[7]. 《解放军医学杂志》2004年(第29卷)主题词索引[J]. 佚名. 解放军医学杂志. 2004
[8]. 作者索引[J]. 佚名. 第四军医大学学报. 2002
[9]. 肝素酶HLA-A2.1限制性CTL表位的预测、鉴定及其抗肿瘤的免疫效应研究[D]. 陈婷. 第叁军医大学. 2007
标签：肿瘤学论文; 端粒酶论文; 启动子论文; 特异性论文; 肿瘤免疫论文; 细胞免疫论文; 基因合成论文; 肺腺癌论文; 噬菌体论文; 肿瘤细胞论文; 癌症论文;