丁明星[1]2003年在《卵巢上皮肿瘤VEGF-C表达及肿瘤转移的研究》文中研究表明研究背景 肿瘤转移是影响卵巢上皮癌患者预后的重要因素之一。肿瘤细胞的转移依赖于新生淋巴管生成(lymphangiogenesis)和血管生成(angiogenesis)。VEGF-C是VEGF家族成员之一，能结合并激活VEGFR-3和VEGFR-2，参与淋巴管和血管生成，在肿瘤的淋巴转移中起重要作用。 VEGFR-3属VEGF酪氨酸激酶受体家族成员，主要局限于淋巴管内皮细胞表达，是淋巴管内皮细胞特异的分子标志物。CD 31/PECAM-1，在内皮细胞表达，是血管和淋巴管内皮细胞标记物。目前，VEGF-C在前列腺癌、食管鳞癌和胃癌等多种肿瘤的表达及其与淋巴转移的关系，已引起学者的广泛关注。然而，VEGF-C表达与卵巢上皮肿瘤淋巴管和血管生成以及淋巴转移的研究鲜见报道。 研究目的和内容 也 浙江大学硕士学位论文 研究目的：探讨卵巢上皮肿瘤 VE诽－C、VEGFR刁和 CD3在新生淋巴管和血管的生成及肿瘤转移中的作用，揭示肿瘤淋巴转移的机制。 研究内容：（l）研究卵巢上皮癌、交界性和良性卵巢肿瘤VEGF．C、VE GF R．3和CD3表达。（2）研究卵巢上皮癌VE GF．C、VEO。R．3和 CD3表达与肿瘤转移的关系。研究方法 （l）应用原位杂交法，检测 30例卵巢上皮癌、9例交界性肿瘤和 26例良性肿瘤组织 VEGFC InRNA的表达。 （2）应用免疫组织化学法，检测卵巢上皮癌、交界性肿瘤和良性肿瘤组织 VEGF－C mRNA和蛋白表达、VEGFR－3及 CD 31的表达。 （3）应用图像分析方法，计数VEGFRl阳性脉管数（VEGFR上positive vessds）和 MVDVD。研究结果 门）卵巢上皮肿瘤组织中VEGF－C mRNA和蛋白的表达 卵巢上皮癌 VEGFC mRNA和蛋白表达位于癌细胞的胞浆。30例卵巢上皮癌中，分别有门和门例标本的癌细胞检测到 VEGFC InRNA和蛋白阳性表达，阳性率分别为 43．33％和 56．67％，h者均显着高于交界性肿瘤（Prt．05），良性肿瘤则表达阴性。 （2）卵巢上皮肿瘤组织 VEGFR3和 CD31的表达 VEGFR－3阳性表达定位在肿瘤周围间质的淋巴管内皮细胞：＊D31表达位于卵巢肿瘤周围及内部间质的血管和淋巴管内皮细胞。卵巢上皮癌VEGFR3阳性脉管数和 MVD显着高于交界性肿瘤和良性肿瘤owt005或P＜0刀1X 卵巢交界性肿瘤的 VEGFR－3阳性脉管数和 MVD高于良性肿瘤，但差异无统计学意义（P n 0．05）。 4 凡 浙江大学硕土学位论文 （3）卵巢上皮癌组织的 VEGF－C表达、VEGFR3阳性脉管数、MVD与临床病理学指标的关系在卵巢上皮癌组织中，有淋巴结转移患者VEGF．C表达、VEGFR3阳性脉管数和 MVD较无淋巴结转移患者增高，有统计学差异（P＜005）；临床分期＊～N期患者 VEGF－C高表达，VEGFR．3阳性脉管数和 MVD高于 I～11期患者。卵巢上皮癌组织的不同组织学类型、组织学分级和年龄间，VEGF－C表达、VEGFR－3阳性脉管数和MVD的差异无统计学意义（P e 0刀5）。 （4）卵巢上皮癌组织中VEGF－C表达、WGFR－3阳性脉管数和MVD的关系 卵巢上皮癌组织中，VEGF－C阳性表达患者的VEGFR－3阳性脉管数和 MVD均显着高于阴性表达患者（Pwt005）。卵巢上皮癌组织中VE G下R－3阳性脉管数和＊VD呈正相关（，O．叩9，P＝O．009）。4．结论 研究提示VEGF－C促进了肿瘤诱导的淋巴管生成和血管生成，在卵巢上皮癌的淋巴转移中起重要作用。检测卵巢上皮肿瘤中VEGF－C、VEGFR．3和 CD3表达对进一步了解肿瘤的生物学行为和判断其预后有一定的价值。
李慧文[2]2004年在《VEGF-C和VEGFR-3在舌癌中的表达及其和肿瘤淋巴转移的关系》文中提出目的：检测血管内皮生长因子C（vascular endothelial growth factor-C, VEGF-C）和它的受体VEGFR-3在舌癌中的表达，了解其和肿瘤淋巴转移及肿瘤组织学分期，以及患者年龄、性别的关系。方法：采用免疫组化SABC(Streptoavidin bioton complextion)法，DAB(diaminobenzidine)显色法检测62例舌鳞癌组织中VEGF-C 和VEGFR-3的表达及定位。标本来源于山西医科大学第一医院病理科和山西省肿瘤医院病理科2000年9月至2003年9月手术切除石蜡标本。所有标本术前未经任何放、化疗。详细病理资料参阅医院病理档案室，记录患者的年龄、性别、肿瘤临床分期。用抗CD34单克隆抗体检测内皮细胞总数。由不知情的2名调查者计数，在低倍镜下（40或100倍）找到血管密度最高的区域，选定6个视野后在200倍下计数，取6个视野的平均值，2名调查者的均数为内皮细胞总数。以肿瘤细胞胞浆颗粒棕黄色染色，数量占肿瘤细胞总数(5%为VEGF-C肿瘤细胞染色阳性， (50%为VEGF-C染色强阳性。VEGFR-3染色内皮细胞（胞浆颗粒棕黄色染色）占内皮细胞总数(5%为VEGFR-3染色阳性，(50%为染色强阳性。结果：62例舌癌中，24例VEGF-C染色阳性，阳性率38.7%。且发现肿瘤细胞中VEGF-C的表达和内皮细胞中VEGFR-3的表达有显着相关性，形态学研究证实，此内皮细胞为淋巴管内皮细胞，这些淋巴管主要位于肿瘤周围， 在肿瘤和正常组织交界区即肿瘤浸润区表达尤其丰富。而肿瘤细胞不仅VEGF-C呈阳性表达，且VEGFR-3在肿瘤细胞胞浆中亦呈阳性表达。临床病理研究证实，VEGF-C的表达和肿瘤淋巴转移密切相关。而与患者的年龄、性别，组织学分期无关。结论：VEGF-C主要由肿瘤细胞产生，VEGF-C以旁分泌的模式可能通过表达在淋巴管内皮细胞上的VEGFR-3来诱导舌癌间质淋巴管的增生。舌癌肿瘤细胞可能还通过分泌VEGF-C来诱导表达VEGFR-3肿瘤细胞自身的增殖，证明在舌癌肿瘤细胞中，可能还存在自分泌的生长模式。在这样的微环境下，肿瘤细胞通过增加的肿瘤细胞和淋巴管接触点而能容易地侵入淋巴管，到达淋巴结，并在那增殖，形成肿瘤淋巴转移。
宋亮[3]2012年在《趋化因子受体CXCR4、CCR7与食管鳞癌生物学行为的临床研究》文中指出研究背景中国是食管鳞癌高发国家,目前外科手术是胸中段食管鳞癌的主要治疗手段,但手术效果并不理想,5年生存率约为30%～50%,一半以上的患者在手术后2-3年内出现肿瘤复发,主要的复发模式为局部区域复发,其中颈部、锁骨上及纵隔淋巴结转移占较大比例。尽管目前在食管鳞癌早期诊断及综合治疗方面取得了一定的进步,食管癌的转移及复发仍是临床治疗所面对的最大难题,直接影响着患者的生存预后。所以研究食管鳞癌转移的分子生物学机制,对指导食管癌患者选择治疗方案和判定预后具有重要的临床价值。肿瘤的转移是恶性肿瘤最重要的生物学特性之一,是一个多步骤、多因素参与的极其复杂的过程,但其具体机制尚未明确。研究证实,肿瘤的转移不是随意的,而是具有选择性的,即器官转移特异性。1889年Peget提出的“种子—土壤’学说(the "seed and soil" hypothesis)认为,肿瘤的转移是特定的肿瘤细胞(种子)在适宜其生长的器官环境(土壤)中生长发展的结果。1928年Ewing的“解剖或机械”理论(the anatomical or mechanical theory)以器官的血液、淋巴引流方向解释转移的发生。而后来在肿瘤特异性转移的研究中出现了新的概念：“归巢”理论(the homing theory);该理论认为,肿瘤细胞转移到特定器官是由于不同器官通过趋化作用捕获或吸引特定类型肿瘤细胞而使肿瘤细胞“归巢”的结果。近年来,化学趋化因子受体—配体信号轴的研究发现为“归巢”理论提供了有利的证据。趋化因子是细胞因子超家族中一类具有化学趋化作用的分泌型小分子蛋白,由70～125个氨基酸组成,分子量8～15kD不等。迄今为止至少已发现50余种趋化因子及20余种受体。根据其N末端4个保守半胱氨酸(Cys)残基的前两个半胱氨酸残基的位置,可将趋化因子分为4个亚家族—CXC、CC、C、 CXC亚家族。趋化因子受体是一类介导趋化因子行使功能的GTP蛋白耦联的跨膜受体,通常表达于免疫细胞、内皮细胞等细胞膜上；7个跨膜区将分子分成细胞外自由的N端、3个细胞外环和C端几个部分。趋化因子与细胞表面的特异性受体结合后可参与多种生理和病理过程,如细胞生长、发育、分化、凋亡、组织损伤、肿瘤的生长和转移等。2001年Muller A首次提出了肿瘤细胞可以利用趋化因子及其受体的特异性结合实现器官特异性转移,研究发现乳腺癌细胞高表达趋化因子受体CXCR4和CCR7,而CXCR4的配体CXCL12多表达于乳腺癌的特异转移部位肺、肝脏、骨髓等,而CCR7的配体CCL21则多表达于淋巴结组织,从而导致了乳腺癌细胞的定向转移。越来越多的研究表明,趋化因子CXCL12/CXCR4信号轴在肿瘤的器官特异性转移中与趋化因子受体CCR7及其配体在肿瘤淋巴结转移中均发挥着愈加重要的作用。目前,国内外对趋化因子与食管鳞癌生物学的研究仍较为少见。本课题应用免疫组化检测、Western blot及RT-PCR叁种方法联合检测趋化因子受体CXCR4与食管鳞癌生物学行为及预后的相关性研究；应用RT-PCR、免疫组化及Western blot叁种方法联合检测趋化因子受体CCR7与VEGF-C在食管鳞癌患者癌组织及转移淋巴结中的表达情况,意在探索食管癌淋巴结转移的可能机制。目的食管鳞癌淋巴结转移的发生与食管癌细胞的趋化迁移及肿瘤淋巴管生成关系密切。本文旨在于探讨趋化因子受体CXCR4表达与胸中段食管鳞癌生物学行为及预后的相关性,以及趋化因子受体CCR7及VEGF-C的表达对食管癌淋巴结转移潜能的影响。方法临床收集2003年6月-2006年6月间山东大学附属省立医院完全切除、临床资料完整的184例胸中段食管鳞癌患者纳入回顾性研究。本组病例无手术前放／化疗者。采用经右胸和上腹部二切口食管癌切除、胃食管右胸顶吻合术(Ivor-Lewis手术)吻合者132例；采用经左胸食管癌切除、胃食管主动脉弓上水平(弓上吻合)吻合者52例。同时收集2009年4月至2009年12月间在山东大学附属省立医院胸外科施行食管癌完全切除加系统淋巴结清扫的60例胸中段食管鳞患者的标本,包括食管癌组织、淋巴结组织及随即选取的20例癌旁正常食管组织。应用免疫组化方法检测184例胸中段食管鳞癌患者标本中CXCR4蛋白的表达情况,随访患者,应用Kaplan-Meier法计算生存率,绘制生存曲线,Log-rank检验比较生存差别,Cox多因素回归分析判定食管癌患者预后的独立危险因素。对60例胸中段食管鳞患者的标本应用RT-PCR和Western blot方法检测标本中CXCR4表达,应用χ2检验比较CXCR4表达情况的差异,判定CXCR4表达与食管鳞癌浸润转移的关系。应用RT-PCR方法检测60例胸中段食管鳞癌患者标本中CCR7mRNA及VEGF-C mRNA的表达；应用免疫组化与Western blot方法检测CCR7及VEGF-C蛋白的表达情况,D2-40标记淋巴管内皮细胞以计数淋巴管密度(LVD)。应用χ2检验比较CCR7及VEGF-C表达情况的差异,u检验比较LVD的差异情况,应用Spearman等级相关对CCR7和VEGF-C的表达进行相关性分析,应用Logistic多因素回归分析判定影响食管癌淋巴结转移潜能的独立相关危险因素。结果1.184例患者肿瘤组织中Ⅰ期、Ⅱ期和Ⅲ期患者CXCR4表达率分别为30.0%,69.6%和82.3%,差异有统计学意义(χ2=12.219,P=0.002)；T1、T2和T3患者CXCR4表达率分别为33.3%、64.7%和78.5%,CXCR4表达率差异有统计学意义(χ2=12.713,P=0.002)。有、无淋巴结转移患者CXCR4表达率分别为82.7%和63.1%,两组CXCR4表达率差异有统计学意义(χ2=8.600,P=0.003)。有、无CXCR4表达患者的5年生存率为26.5%和65.4%,两组差异有统计学意义(P=0.000)。T2患者中,有、无CXCR4表达在者5年生存率分别为36.4%和66.7%,两组差异没有统计学意义(P=0.075)；T3患者中,有、无CXCR4表达组的5年生存率分别为22.1%和57.7%,两组差异有统计学意义(P=0.006)。pN0患者中,有、无CXCR4表达患者5年生存率分别为38.5%和71.1%,两组差异有统计学意义(P=0.005)；pNl患者中,有、无CXCR4表达组5年生存率分别为14.9%和50.0%,两组差异有统计学意义(P=0.048)。Cox回归分析结果显示,肿瘤浸润、淋巴结转移和CXCR4蛋白表达是食管癌患者术后独立的预后危险因素。在60例患者的食管癌组织中,RT-PCR方法检测有44例(73.3%)CXCR4mRNA,其表达与食管鳞癌的肿瘤浸润及淋巴结转移明显相关；Western blot方法方法检测有42例(70.0%)CXCR4蛋白表达阳性,其表达也与食管鳞癌的肿瘤浸润及淋巴结转移明显相关。2.在60例患者的食管鳞癌组织中,RT-PCR方法检测有46例(76.7%)CCR7mRNA及33例(55.0%)VEGF-C mRNA表达阳性,免疫组化方法检测有43例(71.7%)CCR7蛋白及29例(48.3%)VEGF-C蛋白表达阳性,Western blot万法检测有44例(73.3%)CCR7蛋白及31例(51.6%)VEGF-C蛋白表达阳性。CCR7及VEGF-C在食管癌组织中的表达均与淋巴结转移状态明显相关(P<0.05),而CCR7与VEGF-C的共同表达较单一表达与淋巴结转移状态有更为显着的相关性(P<0.05)。食管鳞癌组织中LVD较正常食管组织中明显增高(P<0.05),且与CCR7、VEGF-C的表达及食管癌淋巴结转移状态显着相关(P<0.05)。29例有转移的淋巴结中CCR7、VEGF-C mRNA的表达率为86.2%、69.0%,分别高于无转移的淋巴结(22.6%、19.3%),并与食管癌组织具有高度同源性。叁种方法检测CCR7及VEGF-C在食管鳞癌中的表达明显高于正常食管组织(P=0.000)。Spearman等级相关分析表明,在食管鳞癌组织中CCR7表达与VEGF-C表达呈显着正相关。Logistic多因素回归分析结果显示：食管鳞癌组织中CCR7阳性表达(OR=12.044, P=0.012), VEGF-C阳性表达(OR=5.976,P=0.015)及肿瘤浸润(OR=0.110,P=0.012)是影响胸中段食管鳞癌患者淋巴结转移潜能的独立危险因素。结论CXCR4在食管鳞癌组织表达随肿瘤的浸润和淋巴结转移而明显增高,CXCR4表达的胸中段食管鳞癌患者预后不良,CXCR4表达是判定食管鳞癌患者预后不良的一种指标。CCR7及VEGF-C在食管鳞癌患者的食管癌组织及淋巴结转移灶中均表达明显增高,并与食管癌淋巴结转移状态密切相关；CCR7的表达与VEGF-C的表达成明显正相关；CCR7与VEGF-C的共同表达可能促进了食管鳞癌淋巴结转移,亦可作为预测食管鳞癌患者淋巴结转移潜能的调控基因。
郭权威[4]2013年在《Annexin-1与VEGF-C在食管鳞癌中的表达和意义》文中认为背景与目的食管恶性肿瘤是影响人类健康的常见的消化系统恶性肿瘤,全世界每年新发病例人数约为48万例,死亡病例约40万例。地域不同,食管癌的发病率也不相同,大部分病例分布于发展中国家。我国作为食管恶性肿瘤高发的国家之一,每年的新发病例约25万例,主要分布在河南、山西和河北叁省交界的太行山区域、苏北地区、潮汕地区,另外还有四川盆地的川北地区等。在食管癌各种病理类型中,鳞状细胞癌约占95%以上。食管癌流行病学统计结果显示,食管癌的发生与患者的年龄、性别、种族、遗传因素、饮食习惯、生活环境、地理环境及职业等均有着密切关联。随着分子生物学的不断发展,研究发现食管癌的发生发展受抑癌基因和促癌基因表达异常有关,是多种因素长期相互作用的结果。膜联蛋白-1(Annexin-1)是膜联蛋白(Annexin)家族中最具特征性的成员之一,也是目前研究得比较透彻的膜联蛋白。Annexin-1也就是人们常说的质皮素1(lipocortin-1)、ANXA-1、calpactin-1、内结合素(endonex in)或p35,它是第一个被克隆出来的Annexin家族成员。Annexin-1的编码基因位于人类染色体9pl2-q21.2上,含有13个外显子和12个内含子,Annexin-1的cDNA含有1041bp的开放阅读框(open reading frame, ORF),翻译的Annexin-1蛋白质由346个氨基酸组成,分子量为37kDa。Annexin-1是一个多功能蛋白,在体内广泛参与多种重要的生物活动,如抗炎作用,诱导细胞分化,细胞的粘附和迁移,细胞的增殖及凋亡,信号的传导等。血管内皮生长因子C(Vascular endothelial growth factor C,VEGF-C)是血管内皮生长因子家族的新成员,于1996年由Joukov V等从前列腺癌细胞培养液中发现,能够与受体VEGFR-3(flt-4)结合,然后在体内产生信号传导,诱导血管及淋巴管的新生。VEGF-C基因位于人类染色体4q34上,通过克隆前列腺癌细胞系PC-3细胞cDNA文库后,再对该文库进行筛选可得到其cDNA序列。VEGF-C基因包含2400bp,翻译出的蛋白质VEGF-C含有386个氨基酸残基,分子量为42.9kDa。VEGF-C蛋白是一个二聚体,由分子量为29kD和31kD的两条多肽链组成,可作用于内皮细胞在胶原凝胶中移动。VEGF-C作为第一个被发现的淋巴管生成因子,被认为是特异性的作用于淋巴管内皮细胞的生长因子,并且与肿瘤区域淋巴结转移密切相关。目前对Annexin-1和VEGF-C在食管鳞状细胞癌(食管鳞癌)组织中表达的相关性研究国内尚未见报道,它们与食管鳞癌的发生发展及浸润转移之间的关系尚不清楚。本实验对食管鳞癌中Annexin-1和VEGF-C蛋白表达水平进行检测,探讨两者在食管鳞癌的发生发展过程中的作用机制,以及它们与食管鳞癌各临床病理特征的关系,同时分析两者之间的相关性,为指导食管鳞癌的早期诊断和临床治疗探索新的方法。材料与方法1.标本收集2011年7月至2012年7月郑州大学第二附属医院胸外科手术切除的食管鳞状细胞癌(esophageal squamous cell carcinoma,ESCC)标本和癌旁正常食管组织的标本。总共获得样标本80组,各个标本临床资料完整,术前均未接受放疗和化疗。2.研究方法所有标本均依次经固定、石蜡包埋、切片,然后应用SP免疫组化法进行染色,按试剂盒的说明书进行操作。3.免疫组化结果的判定Annexin-1蛋白阳性表达主要位于细胞膜和细胞质,呈棕黄色；VEGF-C蛋白阳性表达主要位于胞质,为棕黄色颗粒样物质。每例标本于40×10倍镜下随机选取10个视野,每个视野计数100个细胞,按阳性细胞所占的百分率和着色深度进行结果判定。A：阳性细胞百分数<25%为0分,25%～为1分,50%-为2分,≥75%为3分；B：染色强度无染色为0分,淡黄色为1分,黄色为2分,深黄色为3分。A+B≥3分为阳性。4.统计学处理采用SPSS17.0软件,应用分类资料的想x2检验对两组组织中Annexin-1和VEGF-C蛋白表达的差异及食管鳞癌组织中Annexin-1和VEGF-C蛋白的表达与临床病理特征的关系进行统计学分析,应用Spearman相关分析两种蛋白在食管鳞癌组织中表达的关联性,以α=0.05为检验水准。结果1.Annexin-1在癌旁正常食管组织、ESCC中的表达以及与临床病理特征的关系Annexin-1蛋白在ESCC中的阳性表达率为38.75%(31/80),低于癌旁正常食管组织83.75%(67/80),二者差异有统计学意义(x2=34.128,P=0.000)。Annexin-1在ESCC中的阳性率,年龄≤55岁组为35.71%(10/28),>55岁组为41.18%(21/52),P=0.683：男性组为40.00%(20/50),女性组为36.67%(11/30),P=0.767；高分化组为45.45%(15/33),中分化组为35.71%(10/28),低分化组为31.58%(6/19),P=0.564；侵润深度未超出粘膜下层组为50.00%(4/8)、侵润肌层组为45.00%(9/20),侵润至外膜及以外组的阳性率为34.62%(18/52),P=0.568；有淋巴结转移组为42.86%(18/42),无淋巴结转移组为34.21%(13/38),P=0.428。2. VEGF-C在癌旁正常食管组织、ESCC中的表达以及与临床病理特征的关系VEGF-C蛋白在ESCC中的阳性表达率为71.25%(57/80),高于癌旁正常食管组织的46.25%(37/80),二者差异有统计学意义(x2=10.316,P=0.001)。VEGF-C在ESCC中的阳性率,≤55岁组为60.71%(17/28),>55岁组为76.92%(40/52),P=0.127；男性组为78.00%(39/50),女性组为60.00%(18/30),P=0.085；高分化组为72.73%(24/33),中分化组为71.43%(20/28),低分化组为68.42%(13/19),P=0.947；侵润深度未超出粘膜下层组为62.50%(5/8),侵润肌层组为70.00%(14/20),侵润至外膜及以外组为73.08%(38/52),p=0.819；有淋巴结转移组为95.24%(40/42),无淋巴结转移组为44.74%(17/38),P=0.000。3. Annexin-1和VEGF-C在ESCC织中的表达的关系在ESCC中,Annexin-1及VEGF-C表达均为阳性有9例,同时为阴性的仅有1例,Annexin-1表达阴性VEGF-C表达阳性的有48例,而Annexin-1表达阳性VEGF-C表达阴性的有22例。对两者进行Spearman相关分析,二者表达的呈负相关关系(r=-0.596,P=0.000)。结论1. Annexin-1和VEGF-C表达水平异常与食管鳞癌的发生发展有关。2. Annexin-1的表达水平与食管鳞癌患者的年龄、性别、分化程度、侵润深度及淋巴结转移均无关。3. VEGF-C的表达水平与食管鳞癌患者淋巴结的转移相关,与患者的年龄、性别、分化程度及侵润深度无关。4. Annexin-1与VEGF-C在食管鳞癌组织中的表达水平在统计学上存在负相关。
郑玉平[5]2014年在《食管鳞癌细胞及VEGF-C siRNA对淋巴管内皮细胞增殖及成环能力的影响》文中研究指明研究背景食管癌是当今世界上严重危害人类生命与健康的恶性肿瘤之一,我国的食管癌的发病率高居世界首位,尤其是在太行山脉附近的省份明显高发。淋巴道转移是食管癌早期转移的重要途径,同时也是恶性肿瘤术后转移复发的主要原因。淋巴管内皮细胞作为淋巴管最基本的单元,是食管癌淋巴道转移的重要界面。不同分化程度的食管癌的转移力和侵袭力是不同的,促进其相关淋巴管的生成能力也是不同的。淋巴管内皮细胞的调控因子有多种,其中血管内皮生长因子VEGF-C是目前公认的淋巴管生成的主要调控因子,可以与淋巴管内皮细胞表面的VEGFR-3结合,诱导VEGFR-3发生酪氨酸激酶磷酸化,促进恶性肿瘤内淋巴管生成,从而导致肿瘤细胞侵入周围淋巴结及远处扩散。而Endostatin是一种很强的血管生成抑制因子,能够抑制淋巴管生长因子VEGF-C的作用,在体外强烈的抑制淋巴管内皮细胞的增殖和游走,并明显地抑制肿瘤的生长和转移,还可以诱导淋巴管内皮细胞的凋亡,从而抑制了肿瘤的淋巴道转移。本课题采用不同分化程度的食管鳞癌细胞的培养上清液叁维培养食管鳞癌相关淋巴管内皮细胞,观察其对食管鳞癌相关淋巴管内皮细胞增殖及成环能力的影响；构建针对VEGF-C的慢病毒载体或pSINsi-U6-siRNA真核表达载体及应用endostatin分别处理不同分化程度的食管鳞癌细胞后,取其培养上清液再处理食管鳞癌相关淋巴管内皮细胞,观察对食管鳞癌相关淋巴管内皮细胞体外成环能力及增殖的影响,探讨肿瘤源性微淋巴管内皮细胞与食管鳞癌细胞间的相互作用及其可能机制,为进一步探讨食管癌淋巴道转移机制及其阻断研究提供理论依据。目的研究不同分化程度的食管鳞癌细胞系细胞对肿瘤微淋巴管内皮细胞体外成环及增殖的影响；研究VEGF-CsiRNA真核表达载体及endostatin对食管鳞癌相关淋巴管内皮细胞体外成管能力及增殖的影响。方法1.采用免疫细胞化学及Western Blot方法检测食管癌相关淋巴管内皮细胞中VEGFR-3、LYVE-1、Podoplanin.Prox-1蛋白的表达；采用原位杂交方法检测食管癌相关淋巴管内皮细胞VEGFR-3、LYVE-1、 Podoplanin. Prox-1mRNA的表达；2.培养高分化食管鳞癌EC9706细胞及低分化食管鳞癌KYSE150细胞,收集其无血清培养基上清,作为食管癌相关淋巴管内皮细胞的条件培养基；分组叁维培养食管癌相关微淋巴管内皮细胞：E1组加入EC9706条件培养基,E2组加入KYSE150条件培养基,K组不更换培养基。计数叁组细胞形成的管样结构。消化各组细胞,采用CCK-8方法检测细胞增殖情况。3.构建慢病毒载体和真核表达载体,进行侵／转染效率评价,选择最优方式。针对人源VEGF-C设计3条干扰序列SG0SG1、SG2,并筛选出最佳干扰序列。4.内皮素抑制试验：用不同浓度的endostatin处理EC9706细胞和KYSE150细胞,采用CCK-8方法选取最佳抑制浓度。5.将EC9706细胞和KYSE150细胞进行细胞转染和endostatin处理,并制备条件培养基。分组如下：空白对照组：未转染的食管癌细胞的条件培养基。阴性对照组：转染阴性质粒的食管癌细胞的条件培养基。SG1组：转染SGl质粒的食管癌细胞的条件培养基。SG2组：转染SG2质粒的食管癌细胞的条件培养基。内皮抑素组：最佳浓度内皮抑素处理的食管癌细胞的条件培养基。阴性+内皮抑素组：转染空质粒后又经最佳浓度内皮抑素处理的食管癌细胞的条件培养基。SG1+内抑皮素组：转染SG1后又经最佳浓度内皮抑素处理的食管癌细胞的条件培养基。SG2+内抑皮素组：转染SG2后又经最佳浓度内皮抑素处理的食管癌细胞的条件培养基6.按照上述分组叁维培养食管癌相关微淋巴管内皮细胞并计数各组细胞形成的管样结构。消化各组细胞,运用CCK-8方法检测细胞增殖情况。7.统计学处理：应用SPSS17.0软件处理,计量资料进行单因素方差分析,多组均数间的两两比较采用LSD-t法,检验水准a=0.05。结果1.免疫细胞化学、Western Blot及原位杂交检查结果显示：VEGFR-3. LYVE-1、Podoplanin、Prox-1蛋白及mRNA在食管癌相关淋巴管内皮细胞中均有表达。2.叁维培养结果显示：在每一个时间点上,食管癌相关淋巴管内皮细胞成环的数目E1组>E2组>K组,差异有统计学意义(P均<0.05)；随着时间的延长,E1组和E2组的成环数均有不同程度的减少。3.CCK-8法检测结果：叁组细胞的增值情况为E1组>E2组>K组,差异有统计学意义(P<0.05)。4.侵／转染效率评价结果：KYSE150细胞侵染效率为90%以上,转染效率为70%左右,可以进行下游实验；EC9706细胞侵染效率约为30%左右,转染效率约为50%左右,达不到下游实验要求。在此,选择质粒转染进行后续试验。5.质粒筛选结果：转染后,EC9706和KYSE150细胞中SGl和SG2中VEGF-C蛋白的表达量明显低于其他各组,即SG1和SG2的抑制效果均优于其他组。6.叁维培养结果：6.1EC9706细胞收取条件培养基进行叁维培养的各组细胞的成环结果中,空白对照组>阴性对照组>内皮抑素组>阴性+内皮抑素组>SG2组>SG1组>SG2+内皮抑素组>SG1+内皮抑素组,其中两对照组之间比较,SG1+内皮抑素组和SG2+内皮抑素组比较差异没有统计学意义(P>0.05),SG1组、SG2组、内皮抑素组、阴性+内皮抑素组分别两两比较差异没有统计学意义(P>0.05)。余各组两两比较,差异均有统计学意义(P<0.05)。6.2KYSE150细胞收取条件培养基进行叁维培养的各组细胞的成环结果中,总体上比较,阴性对照组>空白对照组>NC+内皮抑素组>内皮抑素组>SG2组>SG1组>SG1+内皮抑素组>SG2+内皮抑素组,其中两对照组之间比较,SG1+内皮抑素组和SG2+内皮抑素组比较差异没有统计学意义(P>0.05)；SG1组、SG2组、内皮抑素组、NC+内皮抑素组分别两两比较差异没有统计学意义(P>0.05)；余各组两两比较,差异均有统计学意义(P<0.05)。6.3将EC9706细胞收取条件培养基进行叁维培养的各组和KYSE150细胞收取条件培养基进行叁维培养的各组进行比较,经过处理后的KYSE150细胞的条件培养基培养的食管癌相关淋巴管内皮细胞的成环数高于EC9706细胞的条件培养基。7.CCK-8结果：7.1在EC9706细胞收取的条件培养基进行叁维培养后各组细胞的增殖情况中,各组活细胞数空白对照组>阴性对照组>内皮抑素组>阴性+内皮抑素组>SG2组>SG1组>SG1+内皮抑素组>SG2+内皮抑素组,SG2组和内皮抑素组比较,SG2组和阴性+内皮抑素组比较,内皮抑素组和阴性+内皮抑素组比较,SG1+内皮抑素组和SG2+内皮抑素组比较,差异没有统计学意义(P>0.05)。余各组进行比较,差异均有统计学意义(P<0.05)。7.2在KYSE150细胞收取的条件培养基进行叁维培养后各组细胞的增殖情况中,各组活细胞数空白对照组>阴性对照组>内皮抑素组>SG2组>SG1组>阴性+内皮抑素组>SG1+内皮抑素组>SG2+内皮抑素组,两对照组比较,SG1组和SG2组比较,SG1组和内皮抑素组比较,SG1组和阴性+内皮抑素组比较,SG2组和内皮抑素组比较,SG2组和阴性+内皮抑素组比较,,SG1+内皮抑素组和SG2+内皮抑素组比较,差异没有统计学意义(P>0.05)。余各组进行比较,差异均有统计学意义(P<0.05)。7.3将EC9706细胞收取条件培养基进行叁维培养的各组和KYSE150细胞收取条件培养基进行叁维培养的各组进行比较,经过处理后的KYSE150细胞的条件培养基培养的食管癌相关淋巴管内皮细胞的增殖量高于EC9706细胞的条件培养基。结论1、不同分化程度的食管癌细胞均可促进食管癌微淋巴管内皮细胞的体外成环及增殖能力,低分化食管癌细胞效应更为明显。2、VEGF-C siRNA及endostatin均可抑制食管癌相关淋巴管内皮细胞成环及增殖能力。
王静文, 唐建武[6]2017年在《淋巴管内皮细胞受体NRP2研究新进展》文中指出NRP2是新近发现的淋巴管内皮细胞受体,其能与血管内皮细胞生长因子VEGFC/D结合,诱导肿瘤原有及新生淋巴管生成、分化和重构,促进肿瘤细胞向淋巴道迁徙、侵袭和转移。NRP2受体不仅是连接、启动、激活细胞外配体和细胞内信号通路的中枢结点,更是反映不同解剖学部位、不同组织学类型、不同发生发展阶段肿瘤特性的良好指标。了解NRP2受体结构功能的生化意义,确定其在VEGFC/D-NRP2反应轴中的核心地位,分析其与VEGFR3、NRP1等同类受体之间的相互关系,观察其在肿瘤淋巴管生成和淋巴道转移时的表达规律,阐明其可能涉及的分子生物学机制,具有重要意义。
陶文虎, 于在诚[7]2006年在《食管癌淋巴管生成研究进展》文中提出食管癌预后差,易早期出现淋巴结转移。肿瘤发生淋巴结转移与肿瘤的淋巴管生成及淋巴管生成因子的表达有关。肿瘤进展过程与淋巴管生成有关。近年来,关于食管癌淋巴管生成及淋巴结转移的研究逐渐成为食管癌相关研究的热点。现将食管癌淋巴管生成方面的研究进展综述如下。
张光正[8]2008年在《VEGF-C及其受体VEGFR-3在下咽癌中的表达及与下咽癌淋巴结转移的关系的研究》文中进行了进一步梳理肿瘤转移是影响下咽癌患者预后的重要因素之一,其转移主要依赖于新生淋巴管生成和血管生成。VEGF-C是VEGF家族主要成员之一,能结合并激活VEGFR-3和VEGFR-2,参与淋巴管与血管的生成,在肿瘤的淋巴转移中起重要作用。VEGFR-3属VEGF酪氨酸激酶受体家族成员,主要局限于淋巴管内皮细胞表达,是淋巴管内皮细胞特异的分子标志物。目前,VEGF-C在前列腺癌、食管鳞癌和胃癌等多种肿瘤的表达及其与淋巴转移的关系,已引起学者的广泛关注。目的:探讨下咽癌中VEGF-C/VEGFR-3的表达及其在淋巴转移中的作用,揭示肿瘤淋巴转移的机制。方法:收集南昌大学第一附属医院耳鼻咽喉-头颈外科2003年1月-2007年7月住院手术的下咽癌患者34例,男33例,女1例,年龄34-78岁,平均57.2岁。根据2002年UICC关于下咽癌的分区分期标准,Ⅰ期2例;Ⅱ期6例;Ⅲ期8例;Ⅳ期18例。有淋巴结转移的24例,无淋巴结转移的10例,取下咽部正常粘膜作为对照,共19例,男18例,女1例,年龄34-78岁,平均61.2岁。应用免疫组织化学法,检测下咽癌肿瘤组织VEGF-C蛋白表达、VEGFR-3阳性脉管数(MLVD)的表达。显微镜下计数免疫组化阳性细胞,采用Weidner最高血管密度计数法,记数肿瘤组织中淋巴管。所有数据均应用PEMS3.1统计软件进行统计学处理,以P<0.05作为有统计学差异。结果:1.在34例下咽癌组织中,有22例标本的癌细胞检测到VEGF-C蛋白阳性表达,阳性率为64.71%。VEGF-C阳性表达物质呈棕色或棕黄色颗粒状,位于癌细胞胞质内.正常对照组织中,4例VEGF-C蛋白阳性表达,阳性率为21.05%。下咽癌VEGFR-3表达阳性脉管数: 16.36±6.93;正常对照组织VEGFR-3表达阳性脉管数: 9.24±5.75。差异有统计学意义(p<0.05)2.小于60岁组有15例,VEGF-C表达阳性的有10例,占66.67%;VEGFR一3的蛋白表达阳性脉管数: 16.23±5.63,大于等于60岁组有19例,VEGF一C表达阳性的有12例,占63.16%;VEGFR-3的蛋白表达阳性脉管数: 15.42±5.44,两组无显着差别(P>.005)。3.高分化组14例,VEGF-C表达阳性的有10例,占71.43%;VEGFR-3的蛋白表达阳性脉管数: 15.86±3.92;中分化组11例,VEGF-C表达阳性的有6例,占54.55%;VEGFR-3的蛋白表达阳性脉管数: 14.27±6.32;低分化组9例,VEGF-C表达阳性的有6例,占66.67%;VEGFR-3的蛋白表达阳性脉管数: 17.56±6.41。叁组之间无显着差异4.I、Ⅱ期有8例,VEGF-C表达阳性的有2例,占25%;VEGFR-3的蛋白表达阳性脉管数: 11.63±3.63;ⅢⅣ期有26例,VEGF-C表达阳性的有20例,占76.92%;VEGFR-3的蛋白表达阳性脉管数: 17.08±5.32。差异有统计学意义(P<0.05)。5.发现淋巴结转移的有24例,VEGF一C表达阳性的有19例,占73.68%;VEGFR- 3的蛋白表达阳性脉管数: 17.29±5.39;未发现淋巴结转移的有10例,VEGF- C表达阳性的有3例,占30%;VEGFR-3的蛋白表达阳性脉管数: 12.20±3.79。差异有统计学意义(P<.005)。6.VEGF-C表达阳性有22例,VEGFR-3表达阳性脉管数18. 55±4.54;VEGF- C表达阴性有12例,VEGFR-3表达阳性脉管数10.75±2.63。差异有统计学意义,呈正相相关(P<0.05)。结论:1下咽癌组织VEGF-C和VEGFR-3蛋白表达水平明显高于正常组织2下咽癌中VEGFR-3蛋白的表达与VEGF—C阳性表达呈同向性改变。3 VEGF—C VEGFR-3蛋白的表达强度与淋巴结转移密切相关,淋巴结转移组VEGF-C和VEGFR-3蛋白表达水平明显高于无淋巴结转移组4 VEGF—C VEGFR-3蛋白的表达强度与临床分期密切相关,5 VEGF-C/VEGFR-3是预测下咽癌颈淋巴结转移的独立因素,可作为预测颈淋巴转移的指标之一。VEGF-C/VEGFR-3对生存率的影响尚不确定。
连海峰[9]2010年在《RNAi抑制NRP2表达对胃癌细胞SGC7901生长及侵袭转移的实验研究》文中进行了进一步梳理胃癌是人类最常见的恶性肿瘤之一,死亡率在世界范围恶性肿瘤中占第二位。我国是胃癌高发国家,胃癌位居所有恶性肿瘤死亡第一位。胃癌临床表现为进展快、预后差,早发现、早诊断、早治疗是降低胃癌死亡率的关键手段。遗憾的是绝大多数患者就诊时已是进展期,早期胃癌所占比例不足10%。研究发现2～4%的粘膜内胃癌、10～15%的粘膜下胃癌、80%的进展期胃癌有远处淋巴结转移,胃癌的预后与癌组织浸润深度及是否发生了淋巴结转移相关。目前研究认为,肿瘤相关淋巴管的形成能够促进肿瘤的转移扩散,所以现在有很多研究聚焦于如何抑制肿瘤环境下淋巴管的形成。VEGFR3是第一个被验证的淋巴管生成的特异性标记物,VEGFR3是淋巴管内皮生长刺激因子VEGFC的特异性受体。VEGFC与其受体VEGFR3结合后可引起淋巴管内皮细胞增殖、迁移及抑制内皮细胞凋亡,从而发挥促进淋巴管新生的作用。神经纤毛蛋白(Neuropilins,NRPs)是一种跨膜糖蛋白,最初是作为轴突导向分子Semaphorin的受体而发现,在神经系统的发育过程中起着重要调节作用,进一步研究证明NRPs在肿瘤的生长转移中也起着关键的作用。NRPs家族包括NRP1和NRP2两个成员。Maresa Caunt等最新研究认为NRP2参与了VEGFC诱导的淋巴管内皮细胞迁移和淋巴管新生(特别是肿瘤相关的新生功能性淋巴管)功能,在肿瘤动物模型中阻断NRP2功能发现肿瘤转移至哨兵淋巴结和远隔器官减少的现象。淋巴结转移是胃癌的一个重要的生物学特性,胃癌经淋巴结发生局部和远处转移是导致患者预后差的重要因素之一,NRP2是否参与胃癌发生及淋巴结转移,其作用机制如何是本课题需验证的设想。目的:检测不同胃癌细胞株中NRP2的表达,通过体外实验和裸鼠体内实验了解我们构建的RNA干扰表达载体能否特异性的干扰胃癌细胞中NRP2基因并影响胃癌细胞的生物学特性及移植瘤中淋巴管的生成。方法:1.采用RT-PCR、Western blot方法在mRNA和蛋白水平检测NRP2在胃癌细胞株BGC823、SGC7901的表达。2.利用计算机辅助设计软件,设计合成含有针对NRP2基因特定序列的寡核苷酸片段,并将其定向克隆入真核表达载体,得到重组质粒shRNA-NRP2-1、shRNA-NRP2-2、shRNA-NRP2-3和阴性对照质粒shRNA-HK。3.用脂质体法转染胃癌细胞株SGC7901,应用半定量RT-PCR、Western blot法检测转染前后NRP2mRNA和蛋白表达的情况,筛选出最佳干扰质粒。4.采用流式细胞仪、侵袭小室实验等检测shRNA2-2转染前后SGC7901细胞的增殖、细胞周期、凋亡、侵袭、迁移能力,并用半定量RT-PCR技术检测转染前后SGC7901细胞CXCR4的表达。5.裸鼠皮下接种胃癌细胞SGC7901成瘤,分为干扰组、阴性对照组及空白对照组叁组,成瘤后叁组裸鼠分别皮下注射shRNA-NRP2-2、shRNA-HK、PBS,不同时间点测定肿瘤体积和裸鼠体重的差异,连续观察6周,肿瘤组织切片免疫组化检测NRP2蛋白变化及计数淋巴管的密度(MLD),评价体内环境中NRP2RNAi表达载体对肿瘤细胞及淋巴管生成的影响。结果:1.两株细胞均有NRP2表达,BGC823、SGC7901细胞中NRP2蛋白的相对含量分别是0.63±0.02、0.85±0.03,两者差别有显着性(P <0.05)。BGC823、SGC7901细胞中NRP2mRNA的相对含量是0.56±0.01、0.86±0.03,两者差别有显着性(P <0.05)。SGC7901细胞中NRP2表达水平更高。2.经酶切和测序分析证明成功构建了NRP2小分子RNA干扰表达载体。3.重组质粒转染SGC7901细胞后,经Western blot检测,NRP2/β-actin吸光度比值:质粒NRP2-1、NRP2-2、NRP2-3分别为0.68±0.01、0.34±0.03、0.58±0.01,HK组和空白组分别为0.89±0.02和0.91±0.03。叁组质粒对NRP2蛋白表达的抑制率分别为31.5%、63.2%和49.6%;经RT-PCR检测,NRP2/β-actin吸光度比值:质粒NRP2-1、NRP2-2、NRP2-3分别为0.63±0.02、0.51±0.02、0.61±0.01;HK组为0.95±0.01,空白组为0.97±0.01。叁组质粒对NRP2mRNA的抑制率分别为36.3%、57.4%和37.2%。质粒NRP2-2抑制NRP2表达的效应最佳,与质粒NRP2-1和NRP2-3相比,有显着性差异(P <0.05)。4.流式细胞仪检测细胞周期和凋亡实验表明,与HK阴性对照组和空白对照组相比,NRP2干扰组Go/G1期细胞百分比显着升高,S期细胞减少,细胞凋亡率增加;Transwell小室侵袭和迁移实验表明NRP2干扰组细胞侵袭和迁移能力明显低于HK阴性对照组和空白对照组;NRP2干扰组CXCR4mRNA表达明显低于HK阴性对照组和空白对照组。5.与HK阴性对照组和空白对照组相比,体内实验中Western blot与免疫组化检测NRP2干扰组NRP2蛋白表达明显降低,与体外实验一致,裸鼠移植瘤的体积、重量及微淋巴管密度在NRP2干扰组也明显受抑制。结论:1.NRP2特异性RNA干扰敲低SGC7901细胞NRP2表达后,可抑制细胞体外增殖、侵袭、迁移能力,诱导细胞凋亡。2.裸鼠皮下胃腺癌移植瘤模型应用shRNA2-2处理后,同样可有效沉默NRP2的表达,同时移植瘤的体积、重量及MLD也受到明显抑制。3.NRP2可能通过调控CXCR4的表达影响胃癌生长及淋巴结转移。
陈炜[10]2005年在《Survivin、VEGF、P73在星形细胞瘤中的表达研究》文中认为目的:通过检测生存基因(Survivin)、血管内皮生长因子(VEGF)及P73在不同级别星形细胞瘤中的表达,分析Survivin、VEGF、P73表达与星形细胞瘤恶性程度的相关性,探讨Survivin、VEGF、P73在星形细胞瘤发生、发展中的作用机制。 方法:用免疫组化SP法对65例不同级别星形细胞瘤及13例正常脑组织中Survivin、VEGF、P73表达情况进行观测。 结果:星形细胞瘤中有Survivin、VEGF、P73的异常表达,且随着肿瘤级别的增高,叁者的表达增强。其中Ⅲ级与Ⅰ～Ⅱ级比较差异有显着性(P<0.05,P<0.05,P<0.01),而Ⅳ级与Ⅰ～Ⅱ级比较差异更为显着(P<0.05,P<0.01,P<0.01)。Survivin与VEGF表达有相关性(r_s=0.943,P<0.05),Survivin与P73表达无相关性(r_s=0.771,P>0.05),VEGF与P73表达无相关性(r_s=0.829,P>0.05)。 结论:Survivin、VEGF、P73在星形细胞瘤中异常表达,且与肿瘤的恶性程度呈正相关;由此证明Survivin、VEGF、P73的异常表达在星形细胞瘤发生、发展中起重要的作用。本研究为星形细胞瘤的免疫发病机理提供了理论依据。
参考文献：
[1]. 卵巢上皮肿瘤VEGF-C表达及肿瘤转移的研究[D]. 丁明星. 浙江大学. 2003
[2]. VEGF-C和VEGFR-3在舌癌中的表达及其和肿瘤淋巴转移的关系[D]. 李慧文. 山西医科大学. 2004
[3]. 趋化因子受体CXCR4、CCR7与食管鳞癌生物学行为的临床研究[D]. 宋亮. 山东大学. 2012
[4]. Annexin-1与VEGF-C在食管鳞癌中的表达和意义[D]. 郭权威. 郑州大学. 2013
[5]. 食管鳞癌细胞及VEGF-C siRNA对淋巴管内皮细胞增殖及成环能力的影响[D]. 郑玉平. 郑州大学. 2014
[6]. 淋巴管内皮细胞受体NRP2研究新进展[J]. 王静文, 唐建武. 临床与实验病理学杂志. 2017
[7]. 食管癌淋巴管生成研究进展[J]. 陶文虎, 于在诚. 癌症进展. 2006
[8]. VEGF-C及其受体VEGFR-3在下咽癌中的表达及与下咽癌淋巴结转移的关系的研究[D]. 张光正. 南昌大学. 2008
[9]. RNAi抑制NRP2表达对胃癌细胞SGC7901生长及侵袭转移的实验研究[D]. 连海峰. 重庆医科大学. 2010
[10]. Survivin、VEGF、P73在星形细胞瘤中的表达研究[D]. 陈炜. 青岛大学. 2005
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