温伟红[1]2003年在《人抗HBsAg单链抗体基因的构建、表达及其表达产物的活性鉴定》文中提出目的 构建人抗HBsAg单链抗体基因，在真核细胞和原核细胞中进行表达，并对其表达产物的活性进行鉴定。 方法 以从噬菌体抗体库中筛选获得的抗HBsAg的Fab抗体基因为模板，分别扩增出其轻、重链可变区(V_L、V_H)基因，通过重组PCR方法将轻、重链可变区基因用连接肽(Gly_4Ser)_3的编码序列连接，并引入前导肽编码序列，构建具有L-V_H-Linker-V_L结构的单链抗体基因。 将所构建的单链抗体基因克隆入绿色荧光蛋白融合表达载体pEGFP-N3，瞬时转染COS-7细胞，分析其表达情况。稳定转染Jurkat细胞，建立稳定表达ScFv融合蛋白的细胞系，并分析其表达产物的活性。 将获得的不含前导肽的单链抗体基因克隆入HA和6His融合的原核表达载体pTAT-HA，在大肠杆菌BL21中进行表达，分析其表达情况。表达产物并经NiNTA柱纯化后，分析其活性。 结果 经测序表明，前导肽、连接肽、V。及V。的序列正确，经酶切鉴定证实成功地构建了绿色荧光蛋白基因融合表达载体。瞬时转染COS刁细胞后，通过荧光显微镜观察、间接免疫荧光检测、免疫组化检测证实了SCFV融合蛋白的表达。稳定转染 Jurkat细胞，经 G4筛选，建立了稳定表达 ScFv融合蛋白的细胞系。建系细胞裂解产物和浓缩的培养上清经SDS－PAGE及Western Blot分析，证实了ScFv融合蛋白的分泌性表达。间接ELISA检测证实所表达的单链抗体具有与HBSAg结合的特异性。建系细胞培养上清与肝癌细胞作用后，经荧光显微镜观察、间接免疫荧光及流式细胞仪检测进一步确定表达的SCFV融合蛋白具有与HBSAg特异性结合的活性。 经酶切鉴定证实原核表达载体pTAT爿ASCFV构建成功。在大肠杆菌BLZI中实现了 SCFV融合蛋白的表达。经 Ni－NTA柱纯化获得纯化产物，经间接ELISA分析确定所得产物具有与HBSAg结合的特异性。与肝癌细胞作用后，通过间接免疫荧光检测、免疫组化捡测进一步确定所获得的纯化产物具有与HBSAg特异性结合的功能。 结论 门）成功地构建了五种人抗HBSAg单链抗体基因。Q）瞬时转染COS7细胞，获得了分泌性表达。稳定转染Jurkat细胞，经筛选获得稳定表达SCFV融合蛋白的细胞系，并证实表达产物具有与HBSAg特异性结合的功能。（3）在大肠杆菌 BLZI中进行表达，经 Ni－NTA柱纯化获得了纯化产物，并证实纯化产物具有与HBSAg特异性结合的功能。
孟艳玲, 温伟红, 薛茜, 张勇, 张巍[2]2006年在《人抗HBsAg单链抗体/鱼精蛋白截短体融合蛋白基因的构建、表达及活性鉴定》文中研究表明目的:构建人抗HBsAg单链抗体(ScFv)/鱼精蛋白截短体(truncated protam ine,tP)融合基因,在大肠杆菌中进行表达纯化并分析ScFv/tP融合蛋白的活性.方法:设计引物扩增人抗HBsAg ScFvHBs15基因,在其3′端引物引入tP的编码基因,PCR扩增获得ScFv/tP融合基因,将其克隆入原核表达载体pET-32 a后,在大肠杆菌BL2 l(DE3)LysS内诱导表达.表达产物经SDS-PAGE及W estern b lot鉴定后,用N i-NTA螯合层析介质纯化.间接ELISA分析ScFv/tP融合蛋白的亲和活性,凝胶迁移阻滞实验检测ScFv/tP融合蛋白与DNA结合的情况.结果:成功获得人抗HBsAg ScFv/tP融合基因,经IPTG诱导后在大肠杆菌中表达,表达的ScFv/tP融合蛋白不仅保持了与HBsAg结合的能力,同时具有DNA结合活性.结论:ScFv与tP融合后,同时具有与抗原和DNA结合的活性,为该ScFv的进一步应用奠定了基础.
孟艳玲, 温伟红, 薛茜, 贾林涛, 鲍炜[3]2005年在《人抗HBsAg单链抗体-Tat融合基因的构建、表达及表达产物的活性鉴定》文中进行了进一步梳理目的:构建人抗HBsAg单链抗体Tat蛋白转导结构域(ScFvTat)融合基因,在大肠杆菌中进行表达,并分析ScFvTat融合蛋白的活性及内化情况.方法:设计引物扩增人抗HBsAg单链抗体基因,克隆入含有蛋白转导结构域Tat序列的原核表达载体pTATHA,在大肠杆菌BL2l(DE3)LysS内诱导融合蛋白表达.表达产物用SDSPAGE及Westernblot鉴定,用亲和层析柱纯化.间接ELISA和ELISA竞争抑制实验分析ScFvTat融合蛋白的亲和活性,将纯化蛋白与HBsAg阳性或阴性肝癌细胞共孵育后,免疫细胞化学染色分析ScFvTat融合蛋白的结合及内化情况.结果:成功地构建了人抗HBsAg单链抗体Tat融合蛋白的原核表达载体,在IPTG诱导下获得了表达,表达的ScFvTat融合蛋白具有与HBsAg结合的活性,并且能够特异性内化入HBsAg阳性肝癌细胞.结论:单链抗体与Tat蛋白转导结构域融合后,实现了ScFvTat融合蛋白的特异性内化,为该单链抗体的进一步应用奠定了基础.
余宙耀, 陈文吟, 饶桂荣, 粟宽源[4]2004年在《重组人抗-HBs单链抗体与白细胞介素2融合蛋白的表达、纯化及活性鉴定》文中研究说明目的 探讨抗 HBs单链抗体与白细胞介素 2融合蛋白的表达、纯化及活性鉴定方法。方法 将构建的目的蛋白表达工程菌M15[pQE ScFv IL 2 ]经IPTG诱导后 ,通过SDS PAGE及Westernblot分析鉴定表达产物 ;再通过Ni2 + 离子金属螯合亲和层析和离子交换层析纯化目的蛋白 ;采用逐步透析法对纯化后的目的蛋白进行复性后 ,用间接ELISA实验和CTLL 2细胞增殖反应实验对其进行活性鉴定。结果 SDS PAGE及Westernblot分析结果显示有分子量约为 4 3kD的重组蛋白表达 ,表达量可达 18% ;两步纯化后凝胶成像分析目的蛋白的纯度达到 95 % ;复性后纯化产物的活性鉴定结果表明 ,重组抗体融合蛋白既能与HBsAg特异性结合 ,也能刺激CTLL 2细胞增殖。结论 获得的抗体融合蛋白兼具亲本分子的双特异性 ,为慢性乙型肝炎及相关疾病的导向治疗研究打下了良好基础。
蔡磊[5]2010年在《携带Survivin特异性siRNA的完全人源性肝癌单链抗体/鱼精蛋白截短体融合蛋白对肝癌凋亡的影响研究》文中指出对于多数不能手术的肝癌患者目前仍无有效治疗手段。近年来以RNA干扰技术为代表的新型肿瘤靶向治疗方法日益受到关注。单链抗体(ScFv)作为一种新型的肿瘤靶向治疗载体显示了良好的应用前景。我们从自行建立的全人源性肝癌ScFv抗体库中筛选到了1株肝癌ScFv,在原核表达系统中诱导表达后得到了可溶性的、具有生物学功能的ScFv蛋白,且通过检测发现其与肝癌细胞有较强的结合能力。鱼精蛋白(protamine)[1-3]是一种富含阳离子的强碱性蛋白,结合DNA的能力强。有研究者应用鱼精蛋白截断体与阳离子脂质体和DNA按照一定比例混合,成功地提高了转染效率。而Survivin[4, 5]是近年发现的凋亡抑制蛋白家族(inhibition of apoptosis protein,IAP)家族中的一员,对凋亡有极强的抑制作用。研究发现Survivin在肝癌组织中高表达。本研究旨在该肝癌特异性单链抗体ScFv和鱼精蛋白截短体(tP)重组的方法,构建以ScFv区作为靶向肿瘤部位的功能区、以tP作为效应功能区的ScFv/tP融合蛋白,并对该融合蛋白的功能进行鉴定以及研究;同时将ScFv/tP融合蛋白与细胞凋亡抑制基因Survivin特异性siRNA体外孵育形成复合物,检测该复合物对肝癌细胞凋亡的影响,为研究肝癌细胞的生物学特性奠定理论基础,为开发依赖抗体介导的肝癌靶向药物建立研究平台。实验一:目的: ScFv/tP融合基因的构建及表达方法:设计携带相应酶切位点的ScFv引物,经PCR扩增;用限制性核酸内切酶HindⅢ与EcoRⅠ酶切pET28/ScFv,核酸电泳后回收ScFv;人工合成两条tP编码寡核苷酸序列,在其两端带上可以直接与经HindⅢ和XhoⅠ酶切的载体相连接的HindⅢ和XhoⅠ酶切位点的粘端序列。将两条tP缓慢退火后,与从质粒、用EcoRⅠ和XhoⅠ切下的ScFv一起连入经EcoRⅠ和XhoⅠ双酶切的原核表达载体pET32a中;将质粒转化大肠杆菌JM109(DE3)感受态细胞后,筛选阳性克隆,进行酶切鉴定并测序;将测序正确的重组质粒在大肠杆菌E. coli BL21trxB中诱导表达,利用HisTrap Ni-NTA螯合层析介质纯化所得蛋白,产物经SDS-PAGE鉴定。结果及结论:经酶切鉴定以及测序证实:扩增的目的基因序列正确,成功构建了含有ScFv/tP的原核表达载体。经SDS-PAGE鉴定,所获得的ScFv/tP融合蛋白大小与预测大小一致,约42 kDa。实验二:目的: ScFv/tP融合蛋白的活性功能研究方法:选用人肝癌细胞HepG2,人正常肝细胞7701等检测ScFv/tP融合蛋白靶向性;间接免疫荧光检测人肝癌细胞HepG2,人正常肝细胞7701对ScFv/tP融合蛋白内吞效果;凝胶迁移阻滞实验检测ScFv/tP融合蛋白与DNA结合活性;光学以及荧光倒置显微镜观察ScFv/tP融合蛋白对siRNA的靶向传递情况。结果:间接免疫荧光检测提示ScFv/tP融合蛋白可内化进入人肝癌细胞HepG2,但不能内化进入人正常肝细胞7701;凝胶迁移阻滞实验提示ScFv/tP融合蛋白具有DNA结合活性;光学以及荧光倒置显微镜观察发现ScFv/tP融合蛋白能够将siRNA靶向传递入人肝癌细胞HepG2,但不能传递入人正常肝细胞7701。结论:ScFv/tP融合蛋白能够被人肝癌细胞内化进入细胞内,而不能被人正常肝细胞所内化;ScFv/tP融合蛋白既具有肝癌特异的靶向性,又具有DNA结合活性;ScFv/tP融合蛋白能够将siRNA特异性的传递入人肝癌细胞,而不能传递入人正常肝细胞。实验叁:目的:携带Survivin特异性siRNA的ScFv/tP融合蛋白对人肝癌细胞HepG2凋亡的影响方法:流式细胞仪定量分析siRNA与ScFv/tP融合蛋白最佳的转染比例;利用RT-PCR、REAL-PCR和Western-Blot分别在mRNA和蛋白水平检测利用ScFv/tP融合蛋白转染siRNA后对肝癌细胞内Survivin的抑制情况;流式细胞仪定量分析ScFv/tP融合蛋白转染Survivin-siRNA的效率;流式细胞仪定量分析ScFv/tP融合蛋白转染Survivin-siRNA后对肝癌细胞周期的影响;扫描及透射电镜定性分析ScFv/tP融合蛋白转染siRNA后对肝癌细胞凋亡的影响;流式细胞仪和TUNEL染色法定量分析ScFv/tP融合蛋白转染Survivin-siRNA后对肝癌细胞凋亡的影响;MTT以及台盼兰拒染实验定量分析ScFv/tP融合蛋白转染siRNA对肝癌细胞活性的影响;PCR Array定量分析ScFv/tP融合蛋白转染siRNA后对凋亡相关基因表达的影响;体内实验:采用裸鼠成瘤实验,测量不同处理组种植瘤的大小,在体内条件下,采用间接免疫荧光检测体内实验检测裸鼠体内肝癌种植瘤细胞对ScFv/tP融合蛋白的内吞效果,采用HE染色法、TUNEL染色法检测ScFv/tP融合蛋白转染Survivin-siRNA后对肝癌种植瘤细胞凋亡的影响,采用RT-PCR和Western Blot检测不同处理组对种植瘤肝癌细胞内Survivin mRNA和蛋白的抑制情况。结果:由ScFv/tP融合蛋白介导的Survivin-siRNA转染能够在体内以及体外降低Survivin mRNA以及蛋白的表达水平,且转染后能够在人肝癌细胞HepG2以及裸鼠体内种植瘤细胞中诱导凋亡的发生。结论:ScFv/tP融合蛋白能够作为转染试剂成功地将siRNA等传递入人肝癌细胞中,影响肝癌的各种生物学活性,从而为肝癌的靶向治疗提供了新的理论以及实验基础。
参考文献：
[1]. 人抗HBsAg单链抗体基因的构建、表达及其表达产物的活性鉴定[D]. 温伟红. 中国人民解放军第四军医大学. 2003
[2]. 人抗HBsAg单链抗体/鱼精蛋白截短体融合蛋白基因的构建、表达及活性鉴定[J]. 孟艳玲, 温伟红, 薛茜, 张勇, 张巍. 第四军医大学学报. 2006
[3]. 人抗HBsAg单链抗体-Tat融合基因的构建、表达及表达产物的活性鉴定[J]. 孟艳玲, 温伟红, 薛茜, 贾林涛, 鲍炜. 第四军医大学学报. 2005
[4]. 重组人抗-HBs单链抗体与白细胞介素2融合蛋白的表达、纯化及活性鉴定[J]. 余宙耀, 陈文吟, 饶桂荣, 粟宽源. 解放军医学杂志. 2004
[5]. 携带Survivin特异性siRNA的完全人源性肝癌单链抗体/鱼精蛋白截短体融合蛋白对肝癌凋亡的影响研究[D]. 蔡磊. 第四军医大学. 2010
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