mTOR上调PFKFB3的分子机制及其功能研究

论文摘要

目的哺乳动物雷帕霉素靶蛋白（Mammalian target of rapamycin,mTOR）在细胞增殖、生长、代谢、蛋白合成和血管生成方面有重要作用。mTOR异常激活在肿瘤中十分常见,成为人们关注的焦点。抑癌基因磷酸酶和张力蛋白同源物（Phosphatase and tensin homolog,PTEN）、结节性硬化症复合物基因1（Tuberous sclerosis complex gene 1,TSC1）和结节性硬化症复合物基因2（Tuberous sclerosis complex gene 2,TSC2）突变失活或缺失;癌基因磷脂酰肌醇3激酶（Phosphoinositide3-kinase,PI3K）,蛋白激酶B（Protein kinase B/AKT,PKB/AKT）的突变激活,都会导致mTOR的活化从而促进肿瘤的发生发展。但mTOR导致肿瘤发生具体机制尚未完全清楚。方法通过小鼠胚胎成纤维细胞（Mouse embryonic fibroblasts,MEFs）进行研究,包括PTEN缺失的小鼠胚胎成纤维细胞（Phosphatase and tensin homologue null MEFs,Pten-/-MEFs）及其对照细胞（Pten+/+MEFs）和TSC2缺失的小鼠胚胎成纤维细胞（Tuberous sclerosis complex 2 null MEFs,Tsc2-/-MEFs）及其对照细胞（Tsc2+/+MEFs）。基因芯片分析PFKFB3在mTOR活化的MEFs中mRNA变化。然后用蛋白免疫印迹（Western Blot,WB）检测mTOR活化的细胞中PFKFB3蛋白水平的变化。在JASPAR网站上预测PFKFB3上的转录结合位点,以此探究mTOR调节PFKFB3的具体机制,发现在PFKFB3启动子上存在缺氧诱导因子-1α（HIF-1α）的转录结合位点。siRNA干扰实验抑制HIF-1α表达后,通过WB观察PFKFB3蛋白水平的改变。为进一步探究HIF-1α与PFKFB3的关系,进行加药模拟缺氧来观察PFKFB3随HIF-1α的变化情况。为了证实HIF-1α是否在转录水平调控PFKFB3,我们通过荧光素酶报告基因实验来进行检测。最后我们在mTOR活化的细胞中研究PFKFB3的功能。通过用病毒敲低PFKFB3以及在细胞中加入其抑制剂PFK15,进行细胞增殖、转移以及成瘤能力的检测。并且联合使用PFKFB3抑制剂PFK15和mTOR抑制剂雷帕霉素（rapamycin）观察用药疗效的差异。结果基因芯片分析结果显示,mTOR活化的细胞中,PFKFB3在四种同种型（PFKFB1-4）中表达最高,与对照细胞相比PFKFB3表达均显著升高（P<0.05）。通过siRNA干扰和WB证实,HIF-1α正向调控PFKFB3。通过荧光素酶实验证实,HIF-1α与PFKFB3启动子上的转录结合位点结合促进PFKFB3的转录。由此可见,mTOR是通过HIF-1α上调PFKFB3的。体外实验结果显示,当抑制PFKFB3活性时,细胞的增殖、转移以及克隆形成的能力明显降低。体内实验表明,抑制PFKFB3可以减弱肿瘤的成瘤能力。联合使用PFK15和rapamycin,检测mTOR活化的肿瘤细胞的增殖能力以及克隆形成的能力,发现联合用药比单独用药有更好的抑制效果。结论mTOR通过HIF-1α上调PFKFB3的表达。PFKFB3可以促进细胞的增殖、转移以及成瘤的能力。并且联合使用PFK15和rapamycin比单独用药效果更加明显。

论文目录

文章来源

类型: 硕士论文

作者: 汤思思

导师: 查晓军

关键词: 哺乳动物雷帕霉素靶蛋白,磷酸果糖激酶,果糖,二磷酸酶,缺氧诱导因子,肿瘤

来源: 安徽医科大学

年度: 2019

分类: 基础科学

专业: 生物学,生物学

单位: 安徽医科大学

分类号: Q75

总页数: 73

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