猪传染性胃肠炎病毒（TGEV）感染IPEC-J2细胞的炎症反应及亮氨酸的调控作用

论文摘要

本研究旨在阐明传染性胃肠炎病毒（TGEV）对小肠上皮细胞炎性调控的作用机制,探讨亮氨酸（Leu）是否可以缓解TGEV感染对小肠上皮细胞的炎症反应,揭示Leu在TGEV感染小肠上皮细胞产生炎症反应中的调控作用。试验以IPEC-J2细胞为体外研究模型,分为三个试验。试验一考察TGEV感染IPEC-J2细胞对细胞增殖的影响,构建TGEV感染IPEC-J2细胞模型。为了探究TGEV对细胞增殖、凋亡和自噬的影响,将TGEV（MOI=5）与IPEC-J2细胞共同培养不同时间（1h、3h、6h、12h、24h、36h）。结果表明:（1）随着感染时间的延长,TGEV复制不断增加,TGEV感染IPEC-J2细胞24-36h,病毒复制达到高峰期。（2）TGEV感染IPEC-J2细胞36h显著抑制细胞增殖（P<0.01）,促进细胞凋亡和自噬（P<0.01）。（3）TGEV感染IPEC-J2细胞36h能够提高NF-κB磷酸化水平（P<0.05）,降低mTOR磷酸化水平（P<0.05）。试验二考察TGEV感染IPEC-J2细胞对炎性反应的调控机制。为了探究mTOR在炎性调控中的作用,TGEV（MOI=5）与10nM mTOR抑制剂（Rapamycin）或10μM mTOR激活剂（MHY1485）共同作用于IPEC-J2细胞培养36h。同时通过构建TGEV编码蛋白IPEC-J2稳定细胞株,筛选抑制mTOR的TGEV编码蛋白,考察TGEV编码蛋白与mTOR之间的关系。结果表明:（1）TGEV（MOI=5）感染IPEC-J2细胞36h时能够提高TLR2、TLR3、TLR9、RIG-I和MDA5的mRNA水平（P<0.01）,激活NF-κB（P<0.01）,诱导细胞因子TNF-α、IL-1β、IL-6、IL-8、IFN-β及IFN-λ的产生（P<0.01）,显著抑制IFN-α的mRNA表达（P<0.05）。（2）在TGEV（MOI=5）感染早期,mTOR抑制后下调TLR2、TLR3、RIG-I和MDA5的mRNA表达水平（P<0.01）,降低NF-κB活性,进而降低TNF-α、IL-6和IL-8的转录（P<0.01）,在感染早期降低TGEV复制（P<0.01）。mTOR激活后上调RIG-I和MDA5表达（P<0.01）,提高IFN-λ的mRNA表达水平（P<0.01）,降低NF-κB和IL-8的mRNA表达水平（P<0.01）,抑制TGEV的复制（P<0.01）。（3）TGEV的编码蛋白NSP4、NSP10、NSP12、ORF3a、S、ORF7显著抑制mTOR磷酸化水平（P<0.05）。（4）NF-κB抑制后,促进mTOR的转录水平（P<0.01）,抑制TGEV的mRNA表达（P<0.01）。试验三考察亮氨酸缓解TGEV诱导炎症反应的作用机制。将TGEV（MOI=5）与不同剂量亮氨酸（5mM、10mM）共同作用于IPEC-J2细胞培养36h。结果表明:（1）10mM亮氨酸激活mTOR信号通路,抑制TGEV复制与细胞自噬（P<0.05）。（2）亮氨酸下调TLR2表达（P<0.01）,抑制NF-κB活性（P<0.01）,进一步降低TNF-α（P<0.05）和提高IL-10（P<0.05）的mRNA表达水平,从而缓解TGEV造成的炎性反应。综上可知:TGEV在IPEC-J2细胞中复制的高峰期为24-36h。TGEV通过TLRs（TLR2、TLR3、TLR9）和RLRs（RIG-I、MDA5）信号通路促进NF-κB磷酸化,调控炎性因子表达,此反应依赖于mTOR。通过添加亮氨酸能够激活mTOR活性,抑制NF-κB磷酸化水平,进而抑制促炎细胞因子TNF-α和促进抗炎细胞因子IL-10的表达,最终抑制TGEV复制,降低炎症反应,促进细胞增殖。

论文目录

文章来源

类型: 硕士论文

作者: 王岚

导师: 罗钧秋,张正帆

关键词: 传染性胃肠炎病毒,亮氨酸,雷帕霉素靶蛋白,核转录因子

来源: 四川农业大学

年度: 2019

分类: 基础科学,农业科技

专业: 生物学,畜牧与动物医学

单位: 四川农业大学

分类号: S852.65

DOI: 10.27345/d.cnki.gsnyu.2019.000581

总页数: 94

文件大小: 4216k

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