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山葡萄苯丙烷代谢相关基因的克隆表达与功能验证

2020-12-02阅读(160)

山葡萄苯丙烷代谢相关基因的克隆表达与功能验证

论文摘要

山葡萄果皮中富含多种花色苷,该物质既能使植物呈现出诱人的色泽,又在各个领域中具有开发应用的潜能,对山葡萄花色苷的生物合成进行研究具有重要意义。本试验以不同发育期的山葡萄果皮为供试材料,针对控制花色苷生物合成的苯丙烷代谢途径,对参与该分支前三个催化反应步骤的PAL、C4H、4CL基因进行研究,应用RACE法获得了PAL、C4H、4CL基因的全长cDNA序列,并进行生物信息学分析;应用实时荧光定量PCR技术,对不同发育期的果皮中三个基因表达量进行分析;将目的基因在大肠杆菌中进行表达,并优化诱导表达过程;以拟南芥为受体材料,将C4H基因转化到拟南芥中。主要研究结果如下:从山葡萄果皮中克隆得到PAL、C4H、基因全长cDNA序列。分析结果显示:PAL基因VaPAL的全长eDNA为2 130 bp,开放阅读框（ORF）为1 926 bp,共编码641个氨基酸,分子量为61.06 KDa。C4H基因VaC4H的全长cDNA为1735 bp,开放阅读框（ORF）为1 518 bp,共编码505个氨基酸,分子量为57.70 KDa。4CL基因Va4WCL 的 cDNA 全长为 1 772 bp,放阅读框（ORF）为 1 635 bp,共编码544个氨基酸,分子量为61.07 KDa。研究山葡萄果皮不同发育阶段中PAL、C4H、4CL基因的表达规律,结果表明:VaPAL基因从转色前到完熟期表达量逐次递减,转色50%和转色 100%儿乎不表达。VaC4H在果皮各个转色时期表达丰度较高,该基因表达量在整个生长过程中表达量呈逐渐上升的趋势。在山葡萄果皮颜色转色100%时,Va4CL的表达丰度最高,在此阶段前该基因表达量呈逐渐上升的趋势,完熟时期表达有所下降,相对表达量在这三个基因中最低。将重组质粒pET28a-VaPAL、pET28a-VaC4H、pET28a-Va4CL转化感受态细胞BL21后,加入1PTG诱导菌体表达。本研究中,在28℃培养条件下筛选IPTG的浓度,PAL、C4H、4CL蛋白的IPTG最佳诱导浓度分别为1.0 mmol L-1、1.0 mmo丨L-1、1.2mmol-L,分子量分别约为 61 kDa、57kDa、61 kDa。转VaC4H基因的拟南芥（Arabidopsis thaliana）植株较野生型生长迅速,表现为叶片数目多于对照,中部叶片、叶柄均长于对照,茎和叶均有明显颜色变化,茎和叶颜色较深,呈现紫红色。

论文目录

  • 摘要
  • Abstract
  • 第一章 前言
  •   1.1 山葡萄简介
  •   1.2 花色苷概要
  •   1.3 苯丙烷代谢调控花色苷合成的研究进展
  •     1.3.1 PAL基因对花色苷生物合成的影响
  •     1.3.2 C4H基因对花色苷生物合成的影响
  •     1.3.3 4CL基因对花色苷生物合成的影响
  •   1.4 研究的目的与意义
  • 第二章 山葡萄PAL、C4H和4CL基因的克隆与分析
  •   2.1 试验材料
  •     2.1.1 植物材料
  •     2.1.2 主要试剂
  •   2.2 试验方法
  •     2.2.1 总RNA样品提取
  •     2.2.2 cDNA第一链的合成
  •     2.2.3 3'RACE引物设计
  •     2.2.4 3'RACE Ready cDNA的合成
  •     2.2.5 目的片段与载体连接、转化、鉴定
  •     2.2.6 PAL、C4H和4CL基因全长序列的验证
  •     2.2.7 PAL、C4H和4CL基因全长序列的生物信息学分析
  •   2.3 结果与分析
  •     2.3.1 总RNA样品提取及检测
  •     2.3.2 PAL、C4H和4CL基因cDNA3'RACE的克隆
  •     2.3.3 PAL、C4H和4CL基因cDNA全长的获得
  •     2.3.4 PAL基因的生物信息学分析
  •     2.3.5 C4H基因的生物信息学分析
  •     2.3.6 4CL基因的生物信息学分析
  • 第三章 山葡萄苯丙烷途径基因的转录表达分析
  •   3.1 试验材料
  •     3.1.1 植物材料
  •     3.1.2 主要试剂
  •     3.1.3 主要仪器与设备
  •   3.2 试验方法
  •     3.2.1 cDNA第一链的合成
  •     3.2.2 PCR引物设计及合成
  •     3.2.3 引物的特异性验证
  •     3.2.4 标准曲线的制备
  •     3.2.5 山葡萄苯丙烷途径基因的相对表达水平分析
  •   3.3 结果与分析
  •     3.3.1 RNA的提取与检测
  •     3.3.2 实时荧光定量PCR引物的常规PCR扩增
  •     3.3.3 实时荧光定量PCR标准曲线的绘制
  •     3.3.4 在果皮不同着色阶段PAL、C4H、4CL基因的表达水平分析
  • 第四章 PAL、C4H和4CL基因的原核表达分析
  •   4.1 试验材料
  •     4.1.1 菌株、质粒
  •     4.1.2 主要试剂
  •   4.2 试验方法
  •     4.2.1 引物设计
  •     4.2.2 目的基因片段的获得
  •     4.2.3 原核表达载体的构建
  •     4.2.4 转化表达菌株及鉴定
  •     4.2.5 SDS-PAGE电泳及检测
  •   4.3 结果与分析
  •     4.3.1 原核表达载体的构建与鉴定
  •     4.3.2 原核诱导表达
  • 第五章 山葡萄C4H基因功能验证
  •   5.1 试验材料
  •     5.1.1 主要试剂
  •     5.1.2 仪器设备
  •   5.2 试验方法
  •     5.2.1 引物设计
  •     5.2.2 目的基因片段的获得
  •     5.2.3 T载体与表达载体pCAMBIA1301质粒DNA提取
  •     5.2.4 目的基因与载体的双酶切
  •     5.2.5 表达载体与目的片段的连接转化
  •     5.2.6 pCAMBIA1301-C4H重组子PCR及双酶切检测
  •     5.2.7 农杆菌感受态的制备及转化
  •     5.2.8 拟南芥花序侵染及转基因植株分子鉴定
  •     5.2.9 C4H基因功能初步鉴定
  •   5.3 结果与分析
  •     5.3.1 C4H基因植物双元表达载体的获得
  •     5.3.2 C4H拟南芥转基因植株的获得
  •     5.3.3 转基因植株的特性分析
  • 第六章 讨论与结论
  •   6.1 讨论
  •     6.1.1 山葡萄苯丙烷代谢关键酶基因的克隆与分析
  •     6.1.2 山葡萄苯丙烷代谢功能基因的表达分析
  •     6.1.3 山葡萄苯丙烷途径基因的原核表达分析
  •     6.1.4 山葡萄C4H基因的表达特性与功能鉴定
  •   6.2 结论
  • 參考文献
  • 致谢
  • 攻读学位期间发表的论文

    • 文章来源

    类型: 硕士论文

    作者: 陈蒙

    导师: 刘海峰

    关键词: 由葡萄,苯丙烷代谢,基因克隆,原核表达,遗传转化

    来源: 延边大学

    年度: 2019

    分类: 基础科学,农业科技

    专业: 生物学,生物学,园艺

    单位: 延边大学

    分类号: S663.1;Q943.2

    总页数: 70

    文件大小: 4632K

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