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DOC-1R蛋白结合CK2α与PRDX1及其结合区域的初步分析

2020-12-08阅读(406)

DOC-1R蛋白结合CK2α与PRDX1及其结合区域的初步分析

论文摘要

目的:本科室前期通过质谱检测发现,DOC-1R（Deleted In Oral Cancer-1 Related）可能与酪蛋白激酶2（Casein Kinase 2,CK2）的α亚基及过氧化物酶1（peroxiredoxin 1,PRDX1）具有相互作用,本研究通过Pull-Down、免疫共沉淀（Co-Immunoprecipitation,Co-Ip）等方法证实DOC-1R与CK2α及PRDX1的相互作用,并通过构建DOC-1R截短蛋白载体及Pull-Down分别初步探究DOC-1R与CK2α及PRDX1蛋白的结合区域,为进一步研究DOC-1R的生物学功能及其作用机制奠定基础。研究方法:1 GST Pull-Down分别检测DOC-1R与CK2α及PRDX1的结合将转化有pGEX-5X-1及重组载体pGEX-DOC-1R的E.coli BL21菌株进行诱导表达,所得到的菌体裂解后收集GST蛋白及GST-DOC-1R融合蛋白,与MagneGST particle混匀孵育,加入HEK-293细胞总蛋白进行GST Pull-Down实验,Western Blot分别检测DOC-1R与CK2α及PRDX1蛋白的结合情况。2 Co-Ip分别检测DOC-1R与CK2α及PRDX1的相互作用常规培养DOC-1R及对照病毒感染的HeLa细胞,裂解细胞获得总蛋白,分为两个实验组:分别用FLAG抗体、CK2α抗体或PRDX1抗体进行免疫共沉淀反应,通过Western Blot方法分别检测DOC-1R与CK2α及PRDX1蛋白的相互作用。3构建缺失型DOC-1R原核表达载体,诱导表达重组蛋白并通过GST Pull-Down分别检测DOC-1R与CK2α及PRDX1的结合区域以本室前期构建的pGEX-DOC-1R质粒为模板,分别构建pGEX-DOC-1RdelC42、pGEX-DOC-1RdelN42、pGEX-DOC-1RdelN63三种缺失型DOC-1R原核表达载体。经菌落PCR鉴定,扩大培养阳性克隆菌落,提取质粒进行酶切鉴定后对三种缺失型pGEX-DOC-1R重组表达载体进行DNA测序分析。将编码序列正确、开放阅读框架完整的三种缺失型pGEX-DOC-1R重组表达载体转化E.coli BL21感受态细胞中,诱导表达并收集菌液。将菌液进行SDS-PAGE凝胶电泳,考马斯亮蓝染色并脱色以检测融合蛋白的表达情况。将新构建的三种含有缺失型DOC-1R的大肠杆菌（pGEX-DOC-1RdelC42、pGEX-DOC-1RdelN42、pGEX-DOC-1RdelN63）、本科室前期构建及保存的含有缺失型DOC-1R的大肠杆菌（pGEX-DOC-1RdelC63、pGEX-DOC-1RdelC30、pGEX-DOC-1RdelC20、pGEX-DOC-1RdelC7）及对照菌分别诱导表达,并将得到的菌液裂解,收集融合蛋白,与MagneGST particle混匀孵育,4 h后加入HEK-293细胞总蛋白混匀孵育过夜,Western Blot分别检测缺失型DOC-1R蛋白与CK2α及PRDX1的结合。结果:1 GST Pull-Down实验证明DOC-1R分别结合CK2α及PRDX1蛋白通过Pull-down及Western Blot实验,证实DOC-1R分别与CK2α及PRDX1蛋白结合,同时我们在洗脱物中应用CK2β抗体检测到了CK2β的存在。2 Co-Ip实验证明DOC-1R分别与CK2α及PRDX1相互作用通过Co-Ip和Western Blot实验,检测可知DOC-1R分别与CK2α及PRDX1蛋白存在相互作用。3构建缺失型DOC-1R原核表达载体并诱导表达重组蛋白以分别初步确定DOC-1R与CK2α及PRDX1蛋白结合的关键区域截短的DOC-1R片段已经成功插入pGEX-5X-1载体中,目的片段序列正确且开放阅读框架完整,截短的DOC-1RdelN42、DOC-1RdelC42、DOC-1RdelN63在37℃诱导3 h时均大量表达。DOC-1R第107-119位氨基酸区域结合CK2α蛋白,且DOC-1R第85-126位氨基酸区域结合PRDX1蛋白。结论:1.应用GST Pull-Down和Co-Ip技术证实DOC-1R分别与CK2α及PRDX1相互结合。2.应用重组技术及GST Pull-Down技术证明,DOC-1R与CK2α结合区域在DOC-1R的第107-119位氨基酸区域,DOC-1R与PRDX1蛋白的结合区域在DOC-1R的第85-126位氨基酸区域。

论文目录

  • 摘要
  • Abstract
  • 英文缩略语
  • 1 前言
  • 2 材料与方法
  •   2.1 实验材料
  •     2.1.1 菌株、载体与细胞系
  •     2.1.2 主要仪器设备
  •     2.1.3 主要试剂及配制
  •   2.2 实验方法
  •     2.2.1 pGEX-DOC-1R重组载体的诱导表达
  •     2.2.2 Pull-Down法纯化GST-DOC-1R重组蛋白
  •     2.2.3 细胞复苏
  •     2.2.4 细胞培养
  •     2.2.5 细胞冻存
  •     2.2.6 细胞总蛋白的提取
  •     2.2.7 Pull-Down法分别检测DOC-1R与 CK2α及 PRDX1蛋白的结合
  •     2.2.8 Western Blot检测分析
  •     2.2.9 Co-Ip分别检测DOC-1R与 CK2α及PRDX1 的相互作用
  •     2.2.10 缺失型DOC-1R引物的设计与合成
  •     2.2.11 截短型DOC-1R的 PCR扩增和DNA切胶回收
  •     2.2.12 缺失型DOC-1R重组载体的构建
  •     2.2.13 提取DOC-1R缺失型重组载体质粒DNA并进行限制性内切酶酶切分析
  •     2.2.14 DOC-1R缺失型重组载体的DNA序列测序
  •     2.2.15 E.coli BL21 感受态的制备
  •     2.2.16 DOC-1R缺失型重组载体的转化及重组蛋白的诱导表达
  •     2.2.17 DOC-1R全长及缺失型融合蛋白的纯化
  •     2.2.18 DOC-1R结合CK2α及PRDX1 蛋白结合区域的初步确定
  • 3 实验结果
  •   3.1 GST Pull-Down结合Western Blot分别证实DOC-1R与 CK2α及PRDX1 蛋白在体外存在结合
  •   3.2 Co-Ip结合Western Blot分别证实DOC-1R与 CK2α及PRDX1 蛋白在细胞内存在相互作用
  •   3.3 缺失型GST-DOC-1R原核表达载体的构建
  •     3.3.1 缺失型DOC-1R基因片段的扩增
  •     3.3.2 缺失型DOC-1R重组质粒菌落PCR鉴定结果
  •     3.3.3 缺失型DOC-1R重组质粒限制性核酸内切酶双酶切鉴定结果
  •     3.3.4 缺失型DOC-1R重组载体的DNA序列测定分析
  •   3.4 三种缺失型GST-DOC-1R融合蛋白的表达
  •   3.5 DOC-1R结合CK2α区域的初步确定
  •   3.6 DOC-1R结合PRDX1 区域的初步确定
  • 4 讨论
  • 5 结论
  • 本研究创新性的自我评价
  • 参考文献
  • 综述
  •   参考文献
  • 攻读学位期间取得的研究成果
  • 致谢
  • 个人简历

    • 文章来源

    类型: 硕士论文

    作者: 沈飞

    导师: 刘琦

    关键词: 诱导表达

    来源: 中国医科大学

    年度: 2019

    分类: 基础科学

    专业: 生物学

    单位: 中国医科大学

    分类号: Q78

    DOI: 10.27652/d.cnki.gzyku.2019.001445

    总页数: 52

    文件大小: 2371K

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