孙汉堂[1]2003年在《牙本质涎磷蛋白转基因小鼠模型的建立和相关研究》文中研究表明牙本质涎磷蛋白(dentin sialophosphoprotein，DSPP)包括牙本质涎蛋白(dentin sialoprotein，DSP)和牙本质磷蛋白(dentin phosphoprotein，DPP)，属于非胶原蛋白，因最早被发现是由成牙本质细胞合成和分泌，一度被认为是牙本质的特异性蛋白而得名。近年来的研究表明，DSPP在其他组织和器官(如骨、软骨、内耳等)中也表达，只是表达水平相对较低而已，提示DSPP的功能可能并非局限于牙齿的发育和矿化。为进一步探讨DSPP在牙齿发育和矿化中的作用，并在此基础上对DSPP的功能做更加全面的研究，本研究在DSPP功能研究的在体模型的构建方面做了一些尝试，核心内容是建立DSPP的转基因和基因敲除小鼠系。本文是全面研究规划中的一部分，即DSP转基因小鼠模型、DSPP四环素调控性转基因小鼠体系、DSPP特异性启动子调控LacZ转基因小鼠模型的建立和DSPP基因敲除载体的构建以及胚胎干细胞基因打靶。 一、DSP转基因小鼠模型的构建 通过亚克隆将pcDNA3.1中的CMV启动子替换为cβ-actin启动子，构建载体pcDNA3.1-CX，然后将PCR获得的、末端带有HA-Tag的DSP基因编码序列克隆到pcDNA3.1-CX中，构建DSP转基因载体pcDNA3.1-CX-DSP；用显微注射的方法将BglII酶切线性化的载体DNA注射到小鼠受精卵的雄 第四军医大学博士学位论文原核，移植到假孕母鼠的输卵管；仔鼠出生后，用PCR、基因组Southern杂交检测阳性小鼠，结果获得4只GO代小鼠（founder）；阳性鼠分别传代开始建系。选其中一个单系进行了初步的分析，RTPCR显示转基因能在多个器官中表达。h、DSPP四环素调控性转基因小鼠体系的构建 将pTetonNSE载体中的NSE启动子替换为启动于c p仓ctin，构建调控载体pTeton（X；将DSPP基因编码序列克隆到pTREZ中，构建受控载体pTREZ＊SPP通过显微注射将线性化载体导入小鼠受精卵，制备GO代小鼠，经PCR、基因组Soutnern杂交检坝卜性小鼠，pTeton－CX手pTREZoSPP分别获 11只、10只GO代小鼠。阳性鼠分别传代开始建系。选pTet｛n（X转基因小鼠一个单系进行了初步的分析，RTPCR结果表明小鼠多种器官中均可表达转录因子tTA。叁、DSPP基因特异性启动子的克隆和pTNlPM工acZ转基因小鼠的构建 据文献报道，在软件DNAstar辅助下设计一对引物，以小鼠基因组DNA为模板，PCR获得约1石 kb的片段，序列测定证实为DSPP基因特异性启动子；通过亚克隆构建了特异性启动子一LacZ转基因载体，命名为pTN－DPM工acZ，显微注射法制备pTN0PM＊acZ转基因小鼠。经PCR筛选，共获得 12只GO代小鼠。四、DSPP基因敲除载体的构建和ES细胞基因打靶的尝试 根据NCBI GenBank提供的序列，软件辅助设计并合成上、下游两条同源臂的两对引物：以用细胞基因组＊＊A为模板，P＊R获得上、下游两条同源臂；将同源臂测序确认后，和筛选标志按一定顺序克隆到载体pBluescript中，构建了G418筛选的们打靶载体和G418／GANC筛选的＃2打靶载体；酶切和序列测定确认构建无误后，N。ti酶切使载体线性化用于ES 3 第四军医大学博士学位论文细胞基因打靶。共进行了 3次打靶，鉴定了 3 74个细胞克隆。虽然没有获得阳性克隆，但得到了一定的经验，为以后的研究打下了基础。 DSP转基因小鼠模型、DSPP四环素调控性转基因小鼠体系、DSPP特异性启动子一LacZ转基因小鼠模型的建立以及DSPP基因敲除载体的构建和ES细胞基因打靶的尝试，为全面研究DSPP的功能奠定了基础。
程振江[2]2010年在《蛋白调控骨、牙矿化的研究及模拟》文中研究说明本文采用材料学分析、表征等手段,结合生物学相关技术,对两种骨、牙基因变异模型中矿物结构和性能进行了分析,探讨了基因、细胞和蛋白变化对矿化过程的影响。在此基础上设计了两种多肽片段,分别模拟非胶原蛋白和釉原蛋白的结构和功能,研究了其对I型胶原矿化和对晶体生长组装的影响,试图从分子水平上探讨生物矿化过程中的蛋白调控机制。col1-caPPR型鼠牙釉质中,出现了片状晶体等异常形态;其排列方式紊乱;结晶性和成熟度明显下降;釉柱组装散乱;力学性能明显下降。这些变化表明,釉原蛋白等的紊乱表达影响了晶体的形核、生长及组装,成釉细胞的分化削弱、排列紊乱破坏了釉柱、釉间质紧密结构。本文首次报道了在牙本质内异常发育的牙釉质,证实了釉牙本质界存在成釉细胞和成牙本质细胞之间的信号传导。Axin2 KO型鼠骨中,成骨细胞数量增加,活性提高;胶原纤维分泌旺盛,排列组装更加有序;新生骨小梁中胶原纤维更易于形成板层结构;皮质骨变厚,板层结构变薄,板层数量增加,结构更加密实;矿物结晶度和成熟度都有所提高。表明Axin2 KO鼠骨中骨更新更加有效,使皮质骨纳米力学性能明显增加。本文所设计的多肽片段(EEEEEEEEDSESSEEDR)在钙离子作用下呈β-折迭,促进了HA晶体的定向生长和平行排列;通过静电作用结合于胶原e1区,促进了其纤维化过程,增加了形核位点,促进了矿物沉积和晶型转变;促进了牙本质的修复再矿化。该多肽片段有望应用于骨组织工程和牙本质修复等领域。本文建立了牙釉质腐蚀早期脱矿模型,其腐蚀最先从有机鞘开始,釉柱区域腐蚀较快而釉间质晶体较晚被腐蚀;最终形成完全脱矿层、软化层、过渡层和正常层等多层结构。该定量观测方法可应用于饮料、牙膏和临床研究等领域。本文设计的高分子—多肽(DMPA-PCL-P)能够自组装形成200 nm左右的纳米球结构。该自组装结构能够影响HA晶体的平行排列组装,促进相邻晶体间融合、生长。这种结构有助于我们理解釉原蛋白的调控作用,也有助于探索新型的有机大分子模板用于调控无机晶体生长。
郭红延[3]2004年在《大鼠牙髓干细胞培养鉴定及生物学特性研究》文中指出干细胞是一类具有自我更新和分化潜能的细胞，它包括胚胎干细胞和成体干细胞。目前已经成功分离培养包括来自骨髓、肌肉、神经、上皮等组织的成体干细胞。牙髓干细胞是位于牙髓组织的一种成体干细胞。2000年，Gronthos等首先成功地分离培养出人牙髓干细胞，为干细胞的研究开辟了一个新的领域。牙髓干细胞具有同其他成体干细胞相似的生物学特性，具有较强的克隆形成能力，可以分化为牙髓组织中的终末功能细胞并具有一定的横向分化能力。目前国内外只有人牙髓干细胞培养成功的报道，鼠牙髓干细胞的相关研究国内外还未见报道，而鼠是实验研究最常用的模型，它具有取材容易、与人同源性较高等优点，因此本研究以大鼠为实验对象，采用细胞克隆分离培养方式进行大鼠牙髓干细胞的培养，同时对大鼠牙髓干细胞进行了一系列生物学特性研究，为牙髓干细胞的研究增加了新的内容，为牙齿再生的研究奠定基础。 第一部分：大鼠牙髓干细胞的分离培养及鉴定 本部分实验采用细胞克隆分离培养的方式，对大鼠牙髓细胞进行克隆筛选，将获得的单细胞克隆来源的细胞进行体外诱导分化及体内接种实验，结果共获得4株单细胞克隆来源细胞株(282、6A11、8A1、8A7)，对282细胞株进行矿化液诱导，部分细胞出现细长的单个胞浆突起，与成牙本质细胞胞浆突起相似，同时出现牙本质特异性蛋白DSPP的表达。裸鼠体内种植实验结果表明，该株细胞经过8周的体内种植后，形成了类牙髓牙本质复合体结构，该结构具有前期牙本质、矿化牙本质、成牙本质细胞层及牙髓组织，第四军医大学博士学位论文与正常牙髓牙本质复合体结构相似，并表达牙本质特异性蛋白DSP。 第二部分:大鼠牙髓千细胞的生物学特征分析 首次培养成功的细胞株明确其生物学特征至关重要，本部分实验研究了大鼠牙髓干细胞的形态学、生长及增殖、矿化能力、细胞克隆形成等一系列细胞生物学特征，同时对大鼠牙髓干细胞的细胞周期与核型进行了检测，旨在通过一系列细胞生物学研究方法对所获得的2B2株牙髓干细胞进行综合分析及评测。结果显示大鼠牙髓干细胞2B2株为成纤维细胞样生长，细胞密集区可见多角形或椭圆形细胞。从细胞生长曲线图来看，大鼠牙髓千细胞的生长能力弱于大鼠骨髓间充质干细胞，其生长曲线在8一10天达到最大值，该细胞株群体倍增时间为58.3小时。大鼠牙髓干细胞的克隆形成率为2.55%，较第一部分大鼠牙髓细胞的克隆形成率为高。细胞核型及致瘤性检测表明该细胞株无染色体畸形及致瘤性等肿瘤细胞特性。大鼠牙髓千细胞经过一定的诱导后，出现了矿化结节，表明具有一定的矿化能力。以上对牙髓干细胞的生物学特性研究为其进一步的功能学研究奠定了基础。 第叁部分:大鼠牙髓千细胞的功能学特征分析 本部分实验从叁个方面对大鼠牙髓干细胞2B2株进行研究。实验一采用免疫组织化学的方法进行了大鼠牙髓干细胞相关蛋白的检测。研究结果表明，未经诱导的大鼠牙髓干细胞DMPI仅个别细胞阳性表达，DSP少量细胞阳性表达，而CBFAI、BMPZ为阳性染色。经矿化液7一10天的诱导后，大鼠牙髓干细胞DSP染色出现部分细胞强阳性，DMPI出现阳性表达，表明矿化液的诱导使部分大鼠牙髓干细胞具有了成牙本质细胞的特征。实验二对大鼠牙髓干细胞的脂肪、神经、肌肉转分化进行研究。在对大鼠牙髓干细胞进行适当的诱导后，采用RT一PCR的方法对诱导前后相关特异性蛋白mRNA的表达进行检测，结果表明:大鼠牙髓干细胞可以向脂肪细胞系进行转分化，表明具有一定的横向分化能力，而向神经及肌肉细胞系方向的分化没有阳性结果，表明常规诱导条件下，大鼠牙髓干细胞不具备向神经细胞系、肌细胞系横向分化的能力。实验叁采用TGF一p做为细胞诱导因子，对大鼠牙髓干细胞进行一定的诱导，研究其生物学特性的改变。结果表明经过TGF一p诱导后，大鼠牙髓干细胞内总蛋白含量增加，细胞生长及增殖能力明显增强，碱性磷酸酶活性增强表明该细胞具有了更强的矿化能力，诱导后出现DSPP第四军医大学博士学位论文的阳性表达表明TGF一p可以促使该细胞株向成牙本质细胞方向分化。 综上所述，本研究以大鼠作为研究对象，采用细胞克隆分离培养模式首次成功获得了大鼠牙髓千细胞2B2株，并对其进行了鉴定。在此基础上对该细胞株的细胞生物学特性进行了一系列的研究，为牙髓干细胞研究领域提供了新的研究工具，为牙齿再生及牙齿发育研究奠定了基础，具有重要的理论意义和潜在的临床应用前景.
于金华[4]2007年在《牙髓干细胞形成牙体组织能力及其制备嵌合体牙齿的实验研究》文中认为牙齿组织工程中局部诱导微环境的建立主要是通过支架材料或单因子诱导的方式,来促进牙髓干细胞的分化。由于牙齿发育的微环境异常复杂,涉及到上皮-间充质相互作用以及多种基质成分、矿物离子、生长因子的参与,单纯依靠支架材料或某几种生长因子等非生理诱导方式局限性较明显,不能满足组织工程化牙齿的形态发生要求。本研究拟通过模拟牙髓干细胞的体内生长发育环境,以重组微环境的方式来调控牙髓干细胞的分化和形态发生,并在此基础上,尝试利用牙髓干细胞研制同种异体“嵌合体牙齿”,以期为组织工程化牙齿最终的临床应用探寻一条新的研究途径。所取得的主要研究结果如下:1组织工程化牙齿异位再生环境的筛选和验证比较了出生后4 d的封闭群SD仔鼠磨牙牙胚器官,在同种异体宿主体内不同部位的生长发育情况,结果表明肾被膜下的牙胚发育状况接近正常;进一步将相关的牙齿组织块移植至肾被膜下,同样生长发育良好;单独将牙乳头细胞团进行肾被膜下移植,可以形成牙尖样的牙本质牙髓复合体。另外,我们还比较了传代前、后的牙胚细胞团在肾被膜下构建组织工程化牙齿的可行性,结果表明:原代牙胚细胞团体内可发育成典型的牙胚样结构,而第二代牙胚细胞团仅形成极少量的釉质,覆盖在牙本质牙髓复合体表面。上述结果证实肾被膜下环境有利于牙胚及其相关组织、细胞的继续生长发育。在肾被膜下的生长环境中,出生后的牙乳头细胞、牙胚细胞可分别再现牙齿间充质、牙胚早期的发育模式,说明牙齿形态发生所需的遗传信息是储存在离散后的单个牙源性细胞中的。2牙胚细胞诱导牙髓干细胞分化的实验为了验证牙胚细胞所提供的发育微环境是否适合成体牙髓干细胞的增殖、分化,本实验通过叁种不同的培养方式:牙胚细胞条件液、分层培养、混合培养,观察牙胚细胞对牙髓干细胞生物学活性的影响。结果显示:牙髓干细胞在与牙胚细胞条件液培养、分层培养的情况下,可向功能性成牙本质细胞谱系分化,诱导分化后的牙髓干细胞团移植至肾被膜下,形成了规则的牙本质牙髓复合体结构。而牙胚细胞与牙髓干细胞混合培养方式不能提供了良好的促增殖、促分化的诱导环境,以致诱导后的牙髓干细胞不能形成典型的牙本质牙髓复合体。上述结果提示牙胚细胞与牙髓干细胞非接触式培养时,所提供的可溶性信号分子,有利于牙髓干细胞的牙向分化、牙本质形成;而接触式培养条件下牙胚细胞分泌的胞外基质蛋白以及不溶性表面分子,可能对牙髓干细胞的增殖起抑制作用,进而影响了其牙向分化的可持续性。3牙髓细胞对牙髓干细胞增殖分化的影响为验证来自成体牙髓细胞的微环境能否促进牙髓干细胞的增殖、分化,本实验采用酶消化法结合组织块法,获取原代牙髓细胞,与STRO-1+的牙髓干细胞以叁种方式:条件液、分层培养、混合培养进行共培养。结果表明:缺少上皮信号的成体微环境不能有效地诱导牙髓干细胞的牙向分化和形态发生,但可明显促进其增殖活性。提示成体微环境中缺少促进牙髓干细胞牙向分化的启动信号,但成体微环境中生长因子、细胞外基质以及细胞表面分子等对牙髓干细胞的促增殖效应明显。4用牙髓干细胞制备嵌合体牙齿为进一步验证牙胚细胞的诱导作用是来自其中的上皮还是间充质成分,本实验将取自不同个体的大鼠切牙根尖蕾细胞、牙乳头细胞分别与STRO-1+牙髓干细胞复合形成细胞团重组体,肾被膜下移植,结果显示根尖蕾细胞-牙髓干细胞嵌合体在体内形成典型的牙冠样结构;牙乳头细胞-牙髓干细胞嵌合体形成的含骨样牙本质和牙本质牙髓复合体的结构中,PKH26标记的牙髓干细胞并未直接参与成牙本质细胞分化和牙本质形成,说明在牙胚细胞诱导牙髓干细胞牙向分化过程中,是牙源性上皮成分起了决定性作用。在与非牙源性STRO-1+骨髓基质干细胞嵌合成牙的比较研究中,我们发现:根尖蕾细胞能促进骨髓基质干细胞向成牙本质细胞谱系分化,但根尖蕾细胞-骨髓基质干细胞重组体在肾被膜下,仅发育成不典型的牙本质牙髓复合体,无釉质形成。提示在嵌合体牙齿研究中,牙源性成体干细胞比非牙源性成体干细胞更具有临床应用价值。当牙髓干细胞与根尖蕾细胞按不同比例进行体内重组时,我们发现:上皮细胞与牙髓干细胞的比例可影响嵌合体牙齿的形态发生,只有在1:1细胞比情况下,才会形成典型的牙冠样结构。综上所述,尽管不同的重组微环境对牙髓干细胞分化和形态发生的影响各不相同,但其规则的形态发生离不开牙源性上皮信号的诱导,从根本上讲,仍离不开上皮-间充质的相互作用。利用这一发现,本研究成功地用牙髓干细胞构建出嵌合体牙胚样结构。
吴容思[5]2012年在《过表达BMP4、MSX1、PAX9对牙髓干细胞牙向分化潜能的影响》文中指出人类一生仅有一次更换牙齿的机会,牙齿的损伤或缺失无疑会对人们的日常生活带来很大的影响。牙齿再生由于其再造牙齿的重要意义和实现的可能性,已经成为组织工程学的研究热点。牙髓干细胞(dental pulp stem cell, DPSC)是近年来应用于组织工程学研究的一类种子细胞。天然DPSC可以修复牙齿组织的损伤,但是缺乏诱导上皮分化和再生出牙齿的能力。因此,本篇论文的重点在于借助慢病毒介导的基因过表达方法,分析BMP4、MSX1、PAX9的过表达对DPSC牙向分化潜能的影响。在本论文的研究工作中,我们分离了成人第叁磨牙的牙髓干细胞,并传代培养。然后先后利用携带有BMP4、MSX1、PAX9目的基因的慢病毒载体,制备出大量具有感染能力的慢病毒并浓缩至较高的滴度,分别对牙髓干细胞进行感染,从而实现目的基因的过表达。我们将分别过表达BMP4、MSX1、PAX9的牙髓干细胞与HA/TCP支架结合,移植到裸鼠的背部皮下,8周后取出移植块,观察其结构。结果发现：过表达BMP4的DPSC和过表达MSXl的DPSC移植块形成肿瘤样结构,说明BMP4.MSX1的过表达有可能改变了DPSC的增殖特性,使其转化成为肿瘤细胞；过表达PAX9的DPSC、正常DPSC和被空载病毒感染的DPSC的移植块形成牙本质基质样结构并且在胞外基质中表达牙本质涎蛋白(dentin sialoprotein,DSP),而且PAX9过表达的DPSC移植块表达更多DSP,说明PAX9的过表达有可能提高了DPSC的牙向分化潜能和诱导成牙的能力。
张永宽[6]2006年在《地塞米松对体外培养的人牙囊细胞成骨特性影响的实验研究》文中指出牙囊是牙齿萌出前的牙胚中围绕造釉器和牙乳头的疏松外胚间充质组织。牙囊中含有形成牙周组织的前体细胞，在牙齿的发育过程中形成牙骨质、牙周膜和固有牙槽骨。目前认为牙囊靠近发育中的牙根的最内层发育为成牙骨质细胞，形成牙骨质；靠近牙槽骨的外层细胞分化为成骨细胞分泌骨基质；中间层发育为成纤维细胞并产生牙周膜的细胞外基质。由生长因子和细胞分子组成的调控网络控制牙囊细胞的发育和功能。牙骨质的形成依靠牙根的形成，牙根形成开始于内釉上皮和外釉上皮增殖形成的Hertwig’s上皮根鞘，来源于上皮根鞘的刺激开始了牙囊前体细胞向成牙骨质细胞的分化。这些刺激物包括釉基质蛋白、层粘连蛋白、Ⅰ型胶原和转化生长因子β超家族等。 目前对于牙囊细胞的成骨特性研究集中于以下方面：1．体外培养培养牙囊细胞在体外的矿化和和体内成骨实验研究以及在此过程中的相关基因表达；2．胰岛素、地塞米松和BMP-2诱导下牙囊细胞向成骨细胞分化过程中，OCN、BMP-2、Cbfal、DLX—5、MSX—2等基因的mRNA的表达。迄今为止，已发现了许多对成骨细胞有影响的因素，其中包括多种生长因子如：骨形成蛋白(BMPs)、转化生长因子(TGF-β)、成纤维细胞生长因子(FGFs)、胰岛素样生长因子(IGFs)、血小板衍生生长因子(PDGF)、表皮生长
汪银雄[7]2009年在《用牙髓干细胞构建牙齿样结构的实验研究》文中研究表明牙髓干细胞是牙齿组织工程中重要的种子细胞,自2000年发现以来已经取得了许多突破性的认识和发现,但在牙髓干细胞的进一步研究和实际应用中,还有许多问题有待认识和解决,例如今后怎样用它与其它一种或多种细胞构建复杂牙齿结构的问题,怎样在体外培养中提供合适的微环境来诱导牙髓干细胞向特定方向分化的问题,尤其是向成牙方向分化的问题。本研究首次尝试将人牙髓干细胞与异种牙胚上皮细胞构建异种嵌合体牙齿结构、检测异种牙胚细胞条件培养基对其有何诱导作用以及将牙髓干细胞与牙周膜干细胞进行复合来尝试构建工程化牙根样结构,以期为牙髓干细胞的进一步研究和应用奠定实验基础,为牙髓干细胞在今后牙齿组织工程的合理使用提供一些有益的提示和参考,并探索出用牙齿来源干细胞进行牙齿再生的一些新途径和新方法。所取得的主要结果如下:一、用牙髓干细胞制备异种嵌合体牙齿用酶消化法培养了牙髓干细胞,结果显示所培养的牙髓干细胞形态典型,表达间充质干细胞标志物STRO-1、CD106、CD29,有克隆形成能力,经诱导后有成骨和成脂肪细胞能力,表明我们培养的细胞是来源于间充质的干细胞。另外分离获得猪第叁磨牙牙胚并培养牙胚细胞,用差速消化法纯化获得牙胚上皮细胞,免疫细胞化学鉴定显示其对CK14、AMBN阳性表达,而对Vimentin阴性表达。然后将人牙髓干细胞和猪的牙胚上皮细胞以不同方式复合植入到裸鼠皮下,6周后取材。结果发现大部分移植物没有形成任何有序的结构形态,但有一部分移植物中形成了含有类似牙本质、牙髓和牙釉质的牙齿样结构的组织,但是形成这种结构的概率较低。免疫组化结果证明我们形成的釉质样结构来源于猪牙胚上皮,而牙本质样结构源于人的牙髓干细胞。本部分结果表明人的牙髓干细胞和猪的牙源性上皮细胞在体内,可以模拟类似牙胚发育时期的上皮-间充质相互作用方式,相互诱导,并有可能成功形成异种嵌合体结构。因而我们推断可见只要进一步优化条件,用人的牙齿间充质干细胞与异种的牙源性上皮细胞进行异种嵌合在牙齿再生中是有一定可行性的,并将可能成为解决牙釉质再生的一条新途径。二、猪牙胚条件培养基诱导人牙髓干细胞牙向分化的实验研究以前的实验已经证实人牙胚条件培养基可以为人牙髓干细胞提供成牙微环境,诱导牙髓干细胞向成牙方向分化。但由于实际中应用人牙胚条件培养基并不可行,所以本实验中我们验证了用异种牙胚条件培养基来诱导人牙髓干细胞可行性。我们培养发育期猪的第叁磨牙牙胚,并收集获得牙胚条件培养基,同时培养人的牙胚并获得人牙胚条件培养基。将猪和人的牙胚条件培养基分别诱导人的牙髓干细胞,并从体内、体外比较了猪牙胚条件培养基和人牙胚条件培养基对人牙髓干细胞的诱导作用。结果表明:人牙髓干细胞经过一定时间的猪牙胚条件培养基诱导后,能在细胞形态上和细胞周期上发生改变,能具有更高的克隆形成能力和多向分化能力,能维持更好的干细胞特性,具有更强的增殖能力,表达更高水平的碱性磷酸酶,免疫组化和RT-PCR提示诱导后的牙髓干细胞能在蛋白水平和基因水平表达出一些牙向分化的标志,如DSP、DSPP、DMP1、BSP、OCN、OPN等。此外,经猪牙胚条件培养基诱导过的人牙髓干细胞植入裸鼠体内能获得形状更为规则的牙本质-牙髓复合体样结构,而且形成这种规则结构的概率从20%提高到超过70%。这些结果与人牙胚条件培养基诱导的牙髓干细胞表现类似,但常规培养的人牙髓干细胞没有表现出特别变化。所得结果说明猪牙胚条件培养基拥有与人牙胚条件培养基一样的能力,诱导人牙髓干细胞向成牙方向分化。这提示我们异种牙胚条件培养基有可能作为一种牙齿再生的有用工具,我们在今后的牙组织工程领域,应用异种的牙胚条件培养基将有助于构建理想的工程化牙齿。叁、用人牙髓干细胞和牙周膜干细胞尝试构建工程化牙根的实验研究牙髓干细胞和牙周膜干细胞是牙齿再生领域最有潜力的两个成体干细胞,那把这两种干细胞一起复合,能否在体内获得牙根样结构呢?本实验进行了这方面的初步尝试。我们体外培养了人牙周膜干细胞并对其性质进行了鉴定,结果显示牙周膜干细胞对Vimentin染色阳性,CK阴性,显示其为间充质来源, STRO-1呈阳性染色,说明培养的牙周膜干细胞具有间充质来源干细胞的表型特点。成脂、成骨诱导实验验证了牙周膜干细胞的多向分化能力与可塑性。本研究中将人的牙髓干细胞进行标记后,再与牙周膜干细胞以不同的方式复合并植入裸鼠体内,希望获得有一定结构的工程化牙根。结果显示:以牙根状CBB为支架的复合物取材后肉眼观呈外形良好的小牙根状,HE染色表明所有移植物中都有矿化发生,且能在一部分移植物中发现有典型Sharpey纤维样结构。在以CBB颗粒为支架的移植物中,肉眼观是形成了扁平状的结构,HE染色结果显示也能也有矿化现象发生,但矿化基质较牙根状CBB为支架的标本少。而单纯细胞团移植物除小部分出现了一定的矿化现象,大部分不能产生任何的有形结构。在叁个实验组中都没有发现有典型牙髓牙本质复合体样结构形成。本实验结果提示我们:在构建组织工程化牙根中,支架材料最好是有预成形状的,以引导相关干细胞沿着支架生长并形成大体结构良好的牙齿样组织;另外多种细胞构建一定结构时,不同的种子细胞最好是分别复合到支架上,而不应该简单混合到一起;细胞团移植不适合于用多种细胞复合构建有良好大体观的牙齿样结构。
徐琳[8]2008年在《大鼠磨牙牙根发育期根端组织成牙能力的研究》文中指出哺乳动物牙根发育是一个长期的过程,包括:牙根发育启动、牙根延长并建立牙周附着关系、牙齿萌出直至咬合关系建立、最后牙根发育完成、根尖孔闭合。在人类,牙根发育持续至牙齿萌出后的3-5年。然而,目前大量相关研究集中在牙根发育的启动阶段,对于牙根启动后至发育完成这一长期而复杂的过程的研究非常少。然而在这一过程中,牙根进一步发育同时伴有牙周组织形成及牙周附着的建立,从而使牙根及牙周组织形成一个功能单位被锚定在颌骨上。因此,对于牙根发育启动后至发育完成这一时期的研究,特别是对牙根及牙周组织共同发育机制的探讨是非常必要的。牙根及牙周组织共同的发育依赖于发育期牙根的根端组织持续增殖并分化。在结构上,发育期牙根的根端组织包含双层上皮细胞构成的鞘样结构,即Hertwig上皮根鞘(Hertwig’s epithelial root sheath,HERS)。上皮根鞘将其下方的外胚间充质组织划分为牙乳头及牙囊,牙乳头形成根部牙本质及牙髓,牙囊则形成牙周组织。尽管这个区域的细胞在构成上具有异质性的特征,然而,存在于这叁种成分间的相互作用及各自的功能对于建立结构完整的牙根/牙周复合体是必须的。因此,发育期牙根的根端组织似乎成为一个发育上的复合体,这个复合体由多种相互作用,密切相关的细胞类型构成的,我们将其命名为发育期牙根的根端复合体(developing apical complex,DAC)。本课题旨在通过对大鼠磨牙牙根发育期根端复合体-DAC的组织学及细胞学观察,探讨DAC在原位的组织学特征,以及体外分离、培养的DAC细胞的生物学特性,并进一步将DAC组织与细胞分别进行同种异体大鼠肾被膜下移植,明确DAC在体内是否具有继续发育能力,以及分化成为牙根/牙周组织形成细胞并在体内形成牙根及牙周组织的能力,并初步探讨了HERS在牙根及牙周组织共同发育中的作用。最后,我们还比较了DAC与牙根发育早期及牙根发育完成期根端组织的组织学、细胞学及成牙能力的差异,以明确DAC在发育学上的特征。第一部分大鼠磨牙牙根发育期根端复合体-DAC在原位的组织学观察实验一、采用组织学方法系统观察了牙根发育早期(PN8d),发育期(PN21d)及发育完成期(PN35d),SD大鼠下颌第一磨牙牙根发育过程中根端组织的组织学特征。同时应用免疫组织化学方法观察了牙根发育不同时期,HERS的形态学特征。结果表明: PN8d时,SD大鼠下颌第一磨牙HERS开始形成,牙根发育启动;牙囊包绕成釉器与牙乳头。此时的根端组织包括牙乳头、HERS及部分牙囊。牙囊与牙乳头间有明确的组织学界限。PN21d时,牙根发育接近一半,HERS在根旁已经断裂,然而在牙本质根尖末端及上皮隔的部位仍然保持完整。此时牙囊仅存在于发育期牙根的根端,与牙乳头相连,两种组织间失去了牙根启动时存在的明确的组织学界限,而成为一个组织结构上的整体,因此将其命名为发育期根端复合体。PN35d时,HERS完全断裂并消失,牙根发育完成。实验二、采用组织学及免疫组织化学方法检测了发育期牙根的根端复合体-DAC在原位的组织学特征。结果发现:DAC呈现出细胞浓聚的现象,这种细胞浓聚有利于细胞-细胞,细胞-基质间相互作用,从而有利于组织形态发生;DAC包含大量具有高增殖活性的未分化间充质前体/干细胞,提示DAC较其邻近的成体牙髓组织(dental pulp, DP)具有更为“胚胎性”的特征;DAC表达多种牙本质,骨/牙骨质相关的矿化蛋白,提示DAC细胞不仅具有成牙本质细胞向分化的潜力,同时也具有成骨/成牙骨质向分化的潜力。第二部分DAC细胞分离、培养和生物学特性的初步研究实验一、采用显微机械法分离了PN21d龄SD大鼠下颌第一磨牙根端复合体-DAC,并使用抗CK-14免疫组化染色观察离体的DAC组织中是否包含HERS结构。并采用酶消化法分离培养了原代DAC细胞及牙髓细胞(dental pulp cells, DP细胞)。结果发现:离体的DAC组织包含结构完整的HERS及间充质组织,表明本实验使用的分离方法能够完整分离DAC组织;原代培养的DAC细胞包含典型的上皮样细胞及间充质样细胞。间充质样细胞接种后迅速贴壁,伸展后呈长梭形或叁角形。上皮样细胞呈多角形,细胞连接紧密,聚集在一起呈克隆样生长,细胞排列成铺路石样。间充质样细胞分散在上皮样细胞团周围,使上皮样细胞呈“岛”样分布。原代培养的牙髓细胞均为间充质样细胞,细胞形态为长梭形或叁角形,未见上皮样细胞存在。实验二、采用细胞计数、BrdU掺入增殖细胞及流式细胞仪检测细胞周期分布等方法,检测了DAC细胞在体外的增殖能力,并与牙髓细胞-DP的增殖能力作了对比分析,从而明确DAC细胞在体外的增殖特性以及发育期组织与成体组织细胞间增殖能力的差异。结果表明:DAC细胞的增殖能力显着高于成体牙髓细胞,相比较,几乎全部的牙髓细胞都处于静息状态。提示发育期组织来源的细胞较之成体细胞具有更高的增殖能力;此外,DAC作为成体环境中的发育期组织,具有“胚胎性”组织的特征。实验叁、采用ALP活性检测、矿化结节染色及RT-PCR检测矿化相关基因表达的方法,检测了原代培养的DAC细胞在体外的矿化及分化能力。使用牙髓细胞-DP作为对照,分析了发育期组织与成体组织细胞间矿化及分化能力的差异。结果表明:DAC细胞在体外显示了较牙髓细胞更高的矿化能力。并且高表达成牙本质细胞、成牙骨质/成骨细胞的标志基因,提示DAC细胞不同于牙髓细胞,不仅存在成牙本质细胞向的分化,也存在成骨/成牙骨质细胞向的分化。第叁部分DAC组织及细胞的体内种植研究及HERS作用的探讨实验一、将离体的完整DAC组织与牙髓组织分别进行了同种异体大鼠肾被膜下移植,以明确DAC组织在体内是否具有独立发育能力,并且能够重现有序的牙根及牙周组织形态发生。结果表明:DAC组织移植物在异位环境中重现了正确的牙根及牙周组织形态发生,形成了结构完整的,包含牙本质、牙骨质、牙周膜及骨样组织的牙根-牙周复合体样结构。提示DAC组织在异位环境下能够继续发育,并发育成为形态正确的牙根及牙周组织。牙髓组织移植物仅发育成为不规则的牙本质/牙髓复合体样结构。实验二、将原代DAC细胞进行反复差别消化培养,获得了纯化的上皮细胞(HERS)及间充质DAC细胞,经Western blot鉴定排除了上皮与间充质细胞间的污染,并将包含HERS细胞的DACCs(HERS+间充质细胞混合培养)与不包含HERS细胞的DACCs-M(仅间充质细胞),分别与陶瓷化牛骨(ceramic bovine bone, CBB)复合后进行同种异体大鼠肾被膜下移植,以探讨HERS在牙根及牙周组织发育中的作用。结果表明:包含HERS细胞的DACCs移植物形成了形态良好的牙根及牙周组织样的结构,包括牙本质、牙骨质、牙周膜及骨样组织。然而,去除了HERS细胞的DACCs-M移植物仅形成了没有牙本质小管结构的骨样牙本质,以及无规则排列的纤维样组织。提示HERS在牙根及牙周组织发育中起重要的作用,同时也揭示了DAC作为一个功能性的整体在牙根及牙周组织共同发育中起作用,而DAC中每一种细胞成分对于牙根-牙周复合体的形成都是必需的。第四部分DAC与牙根启动期及完成期根端组织的对比研究实验一、采用显微机械分离、酶消化法原代培养了DAC细胞(PN21d)及牙根发育启动期(PN8d)、发育完成期(PN35d)的根端组织细胞,并采用细胞计数、流式细胞仪检测细胞周期分布、ALP活性检测、矿化结节染色及RT-PCR基因表达检测等方法对比了DAC细胞与牙根启动期、完成期根端组织细胞,在体外细胞增殖、矿化及分化能力上的差异。结果表明:DAC细胞具有类似于牙根启动期根端组织细胞的极高的细胞增殖能力;其矿化能力较牙根启动期的根端组织细胞更高。并且这两个时期矿化相关蛋白mRNA的表达也存在差异,DAC细胞不仅表达牙根-牙周组织前体细胞的标志分子,还表达分化成熟的牙根-牙周组织形成细胞的标志分子。提示DAC中不仅存在形成牙根及牙周组织的前体细胞群,还包含分化成熟的牙根/牙周组织形成细胞。然而,DAC细胞在体外的极高的发育潜力在牙根发育完成期的根端组织细胞中不存在。实验二、将原代培养的DAC细胞、牙根启动期及完成期根端组织细胞分别与CBB复合后进行同种异体大鼠肾被膜下移植,以探讨DAC细胞与牙根启动期、完成期根端组织细胞在体内分化能力及形成牙根-牙周组织能力的差异。结果表明:DAC及牙根启动期根端组织细胞在体内均能形成形态规则的牙根-牙周组织样结构,而完成期的根端组织细胞没有形成牙根-牙周组织的能力。提示DAC细胞类似于牙根发育早期的根端组织细胞,不仅包含牙根及牙周组织形成所需要的所有的前体细胞,也包含正确的牙根/牙周组织形态发生所必需的成牙的微环境。
付广丽[9]2012年在《腺病毒介导表皮生长因子体外转染人牙髓干细胞对其增殖的影响》文中研究表明目的：通过体外培养人牙髓干细胞(human dental pulp stem cells, hDPSCs),观察重组腺病毒介导的表皮生长因子(recombinant adenovirus mediated epidermal growth factor, rAd-EGF)转染至hDPSCs后对其生长、增殖和凋亡的影响,为EGF对hDPSCs的作用提供实验依据,并为牙齿缺损与牙再生提供可能的新思路和新方法。方法：1.常规收集对数生长期的hDPSCs,将密度为1×105/ml的细胞悬液接种至6孔板中,每孔细胞悬液量为2ml,根据实验目的分为空白组(只有hDPSCs和培养基)、阴性对照组(转染rAd-EGFP的hDPSCs)和实验组(转染rAd-EGF的hDPSCs),待24h细胞贴壁后转染rAd-EGFP与rAd-EGF,在72h后采用RT-PCR检测rAd-EGF转染hDPSCs后对EGF mRNA表达的影响情况。2.体外培养hDPSCs,常规收集对数生长期的hDPSCs,将密度为4×103/ml的细胞悬液接种于96孔板中,每孔细胞悬液量为200μl,根据实验目的分为空白组、阴性对照组和实验组。待24h细胞贴壁后转染rAd-EGFP与rAd-EGF,在1、3、5、7、9、11d的同一时点,采用MTT比色法观察rAd-EGF转染hDPSCs后对其体外增值能力的影响。3.常规收集对数生长期的hDPSCs,将密度为3×106/ml的细胞悬液接种于6孔板中,每孔中的细胞贴壁后转染rAd-EGFP与rAd-EGF,继续培养48h,用流式细胞仪Annexin V-FITC/PI法检测rAd-EGF转染hDPSCs后的凋亡情况。结果：实验组hDPSCs中EGFmRNA的表达水平相对于阴性对照组与空白组均明显上调(P<0.05)。与阴性对照组与空白组比较,实验组hDPSCs体外增殖能力明显升高,第1-7天升高明显,有显着性差异(P<0.05),但7天后减弱,无显着性差异(P>0.05)。流式细胞Annexin V-FITC/PI法结果显示在作用时间相同的情况下同阴性对照组与空白组相比,实验组hDPSCs体外凋亡指数明显降低(P<0.05)。结论：rAd-EGF转染入hDPSCs, EGF mRNA的表达量增加,在短期内对其增殖能力具有促进作用,对其凋亡具有抑制作用。
参考文献：
[1]. 牙本质涎磷蛋白转基因小鼠模型的建立和相关研究[D]. 孙汉堂. 中国人民解放军第四军医大学. 2003
[2]. 蛋白调控骨、牙矿化的研究及模拟[D]. 程振江. 清华大学. 2010
[3]. 大鼠牙髓干细胞培养鉴定及生物学特性研究[D]. 郭红延. 第四军医大学. 2004
[4]. 牙髓干细胞形成牙体组织能力及其制备嵌合体牙齿的实验研究[D]. 于金华. 第四军医大学. 2007
[5]. 过表达BMP4、MSX1、PAX9对牙髓干细胞牙向分化潜能的影响[D]. 吴容思. 福建师范大学. 2012
[6]. 地塞米松对体外培养的人牙囊细胞成骨特性影响的实验研究[D]. 张永宽. 第四军医大学. 2006
[7]. 用牙髓干细胞构建牙齿样结构的实验研究[D]. 汪银雄. 第四军医大学. 2009
[8]. 大鼠磨牙牙根发育期根端组织成牙能力的研究[D]. 徐琳. 第四军医大学. 2008
[9]. 腺病毒介导表皮生长因子体外转染人牙髓干细胞对其增殖的影响[D]. 付广丽. 泸州医学院. 2012
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