郑红[1]2004年在《鼻咽癌中DNA聚合酶β基因突变及与EB病毒相关性研究》文中进行了进一步梳理目的:许多证据表明肿瘤的发生与细胞DNA损伤修复能力下降有密切关系。DNA聚合酶β(DNA polymerase β,polβ)是DNA聚合酶家族的一员,广泛分布于哺乳动物细胞内,主要功能是DNA错配修复。其基因组DNA序列及互补DNA(cDNA)序列已有报导,且报道在结肠癌、直肠癌、胃癌、乳腺癌、肝癌、肺癌、膀胱癌、前列腺癌、食管癌中发现有pol β基因的突变,其中结、直肠癌患者中突变频率高达80%。然而有关鼻咽癌中有无pol β基因突变尚未见报道。该课题利用国内外这些年来对pol β的研究基础,采集非高发区鼻咽癌及癌旁组织标本,对pol β的变异进行研究,以了解该基因在鼻咽癌中突变的情况,为探索鼻咽癌的发病机制提供新的理论依据。有研究表明,EB病毒(Epstein-Barr virus EBV)感染可能引起癌基因和抑癌基因突变,从而在鼻咽癌发生中起重要作用。但EBV感染引发鼻咽癌的过程与修复基因pol β的突变有无关系,国际上还未见报道。该课题提取鼻咽癌及其癌旁组织的DNA并利用特异性EBV引物加以扩增,探讨EBV感染与DNA聚合酶β突变及鼻咽癌发生的相关性。材料与方法:鼻咽癌标本26例均在河南省内医院切取活检时收集(编号为NPCa-z),均经病理检查诊断为鳞状上皮细胞癌;同时切取癌旁标本26例(编号JCTa-z)。实验中使用的试剂、质粒载体、菌种除本室保存外,均购于国内外各公司。第一部分:提取总RNA;反转录合成cDNA;巢式PCR扩增;用SSCP筛选突变基因序列;以一对全基因引物扩增在SSCP中被发现的异常标本的pol郑州大学2004届硕士学位论文鼻咽癌中DNA聚合酶日基因突变及与EB病毒相关性研究p完整DNA序列:选择pGEM一T为载体,以几DNA连接酶连接目的基因Polp和质粒DNA;选用JM 109为宿主菌,用氯化钙共沉淀法制备感受态细胞并将重组体转入宿主菌。在用插入灭活法、蓝白筛选、小量质粒提取后限制性内切酶切割以及通用引物扩增等方法鉴定重组体;最后通过大量质粒提取测定DNA序列,测得序列用DNASIs、OMIGA软件与GenBank中查到的DNA聚合酶p基因序列进行同源性比较分析,推测其蛋白序列并分析蛋白同源性及结构改变情况。第二部分:提取26例鼻咽癌及其癌旁组织的DNA,用EBV引物进行扩增,观察是否出现阳性结果,分析出现EBV-PCR阳性与pol日突变及鼻咽癌发生之间的相关性。结果:本研究polp一SsCP结果显示,在26例癌旁组织中polp无突变。26例鼻咽癌组织中存在polp基因变异的有8例,突变率为30.8%。从中随机抽取3例polp基因变异的鼻咽癌标本(编号NpCI,NpCZ,NpC3)及1例癌旁正常组织标本(编号JCTI),polp测序结果显示:NPCI的第454位核普酸由T变为C,其氨基酸变异为第114位氨基酸由Phe变为Ser;第4“位核昔酸由G变为A,其氨基酸变异为第118位氨基酸由Gly变为Glu。NPcZ的第148位核普酸由A变为G,其氨基酸变异为第28位氨基酸由Asn变为Ser。NPC3的第287位核营酸由A变为G,其第58位氨基酸谷氨酸(Glu)未改变。JCTI的核普酸序列无改变。提取DNA用EBV引物进行扩增,26例鼻咽癌标本中出现阳性的有24例,阳性率为92.3%,与文献中用其他方法得出鼻咽癌患者EB病毒感染率为89一100%一致;对应的癌旁组织出现一致的反应。实验结果发现有polp突变的病例均有EBV感染。结论:1.本研究发现鼻咽癌中存在polp基因突变。2.在鼻咽癌中有多种郑州大学2004届硕士学位论文鼻咽癌中DNA聚合酶日基因突变及与EB病毒相关性研究polp突变形式,多种类型的突变形式可能导致氨基酸序列、二级空间结构的改从而导致酶活性的变异,在鼻咽癌的发生中可能起重要作用。3.在鼻咽癌发现EBv感染与polp的变异之间有一定的相关性。变中
郑红, 李明善, 赵国强, 董子明, 宋宝义[2]2005年在《鼻咽癌组织DNA聚合酶β基因突变与EBV感染相关》文中研究指明目的:研究探讨鼻咽癌中DNA聚合酶β(DNA pol-ym erase,βpolβ)的变异情况及与EBV感染有无相关关系.方法:采用RT-PCR法(逆转录-DNA聚合酶链反应)、PCR-SSCP(聚合酶链-单链构象多态性分析)、DNA序列分析法对26例鼻咽癌组织及癌旁组织标本进行polβ基因突变研究.用特异性EBV引物PCR扩增法检测EB病毒,分析出现EBV-PCR阳性与polβ突变及鼻咽癌发生之间的相关性.结果:polβ-SSCP结果显示癌旁组织标本中polβ无突变;26例鼻咽癌组织标本中存在polβ基因变异的有8例,突变率为30.8%.polβ基因变异的鼻咽癌标本测序结果显示:核苷酸序列有多种形式的改变.提取DNA用EBV引物进行扩增,26例鼻咽癌标本中出现阳性的有24例,阳性率为92.3%.结论:首次发现在鼻咽癌中存在多种形式的polβ突变,有polβ突变的病例均有EBV感染.
张文靖[3]2006年在《交链孢霉酚诱导细胞DNA聚合酶β基因突变及表达的分析》文中指出背景与目的 霉菌毒素在肿瘤病因学上的作用已经被大多数学者认同。研究发现多数的霉菌毒素主要在基因水平导致基因突变而致癌。其中交链孢霉酚(Alternariol，AOH)和交链孢酚单甲醚(Alternari-oimonomtyhi ether，AME)已证明具有强的致癌性。而DNA聚合酶β(polymerase polβ)是DNA聚合酶家族中的一员，在DNA损伤修复中起着重要的作用，它主要对1-4个碱基突变进行碱基切除修复(base excision repair，BER)。已经证实在多种肿瘤中DNA polβ的表达是增高的，且有多种形式的碱基突变。然而霉菌毒素的致癌机制与polβ是否有一定的关系，国内外还没有相关报道。本试验将野生型polβ及空载体分别转染入NIH3T3细胞，分别获得稳定表达野生型polβ及空载体的NIH3T3细胞株；用不同浓度的AOH诱导这些细胞，观察AOH对polβ的致突变作用及其对细胞蛋白表达的影响。为霉菌毒素致病机制的分子水平研究也为polβ在基因治疗方面的研究提供重要依据。 实验方法 1．细胞培养转染及AOH诱导 1．1 从DH5α细菌中提取质粒pEGFP-C3、pEGFP-C3-polβ。 1．2 将质粒用脂质体包裹转染入NIH3T3细胞；G418筛选2周；得到稳定高表达转染野生型polβ和转染空质粒的NIH3T3细胞株。 1．3 药物诱导转染pEGFP-C3-polβ的NIH3T3细胞、pEGFP-C3的NIH3T3细胞及未转染的NIH3T3细胞48小时。 2．提取mRNA逆转录出cDNA，扩增出polβ全基因，插入T载体，进行DNA序列
参考文献：
[1]. 鼻咽癌中DNA聚合酶β基因突变及与EB病毒相关性研究[D]. 郑红. 郑州大学. 2004
[2]. 鼻咽癌组织DNA聚合酶β基因突变与EBV感染相关[J]. 郑红, 李明善, 赵国强, 董子明, 宋宝义. 第四军医大学学报. 2005
[3]. 交链孢霉酚诱导细胞DNA聚合酶β基因突变及表达的分析[D]. 张文靖. 郑州大学. 2006
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