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哺乳动物细胞CRISPR/Cas9介导精准基因编辑富集系统的构建、应用及优化研究

2020-12-02阅读(885)

哺乳动物细胞CRISPR/Cas9介导精准基因编辑富集系统的构建、应用及优化研究

论文摘要

精准基因组编辑使科学家可以按照意愿直接改变基因组序列,以研究基因功能,并有利于开发出安全、高度精确的基因治疗方法。CRISPR/Cas9系统利用Cas9核酸酶与单链导向RNA（sgRNA）复合物,通过更有效地诱导基因组中特定位点的DNA双链断裂,使研究人员能够进行基因组编辑。DNA双链断裂主要由非同源末端连接（NHEJ）和同源重组（HDR）两种机制来修复。相比NHEJ在DNA双链断裂处进行不可预测的碱基插入或者缺失,HDR可以利用与DNA双链断裂处周围区域同源的外源性DNA为供体模板,以精确重组的方式修复DNA。精准基因组编辑技术的核心是基于基因组双链断裂后的HDR修复机制。然而,在哺乳动物细胞基因组中,HDR修复效率远远低于NHEJ修复效率,这限制了精准编辑在哺乳动物细胞中的应用。为了提高CRISPR/Cas9和HDR介导的精准编辑效率,研究人员提出了抑制NHEJ通路、激活HDR通路或者控制细胞周期等方法,均在一定程度上提高了HDR效率。另外,由于较低的HDR效率,从所有处理过的细胞群中分离出基因精确修饰的阳性细胞尤其耗时、耗力。前期研究已经开发的富集基因编辑细胞的方法主要基于筛选转染阳性的细胞和筛选核酸酶活性的细胞,但是目前还没有关于筛选HDR介导的精准编辑细胞技术的报道。本研究开发了一种专门用于富集CRISPR/Cas9和HDR介导的精准编辑细胞的通用筛选报告载体（Homology Directed Repair-based Universal Surrogate Reporter,HDR-USR）系统。在应用该报告载体时,不需要对其进行任何改造,只需要将其与用于精准编辑细胞基因组的打靶载体以及供体共转染细胞,转染2天后向细胞培养基中添加合适浓度的嘌呤霉素药物,筛选5天,即可高效富集HDR介导的精准点编辑、片段插入和片段删除的细胞。该系统可以广泛应用于多种哺乳动物细胞的多个基因位点。本研究的主要结果如下:（1）构建了HDR-USR筛选报告载体,该载体包括通用sgRNA表达盒、Cas9基因表达盒、被sgRNA靶序列打断的嘌呤霉素抗性基因表达盒以及嘌呤霉素基因同源重组修复模板。当该载体转染到细胞时,Cas9基因表达盒表达的Cas9蛋白在sgRNA表达盒表达的靶序列sgRNA的指导下对嘌呤霉素抗性基因表达盒进行切割,同时载体本身的嘌呤霉素基因序列作为修复模板对嘌呤霉素表达盒进行修复,从而启动嘌呤霉素基因的表达。（2）精准点编辑方面:HDR-USR应用于人源细胞系（HEK293T,U2OS,Hela和A375）的六个基因位点（EMX1、AAVS1、CCR5、VEGF、HPRT1和NUDT5）,鼠源细胞系（B16和CHO）的COSMC基因位点以及猪源细胞系（PK15）的IGF2位点,通过对细胞池基因组靶序列的酶切检测以及扩增子深度测序分析,HDR-USR富集的HDR效率高达45.93%,相比未富集组高达20.7倍。（3）双位点同时精准编辑方面:HDR-USR应用于HEK293T细胞同时富集EMX1和AAVS1的点编辑事件,通过挑取细胞单克隆进行基因分型分析,HDR-USR组两个位点同时精准点编辑效率达42%,而在未富集组没有检测到两个位点同时精确编辑的细胞克隆。（4）基因片段敲入方面:HDR-USR应用于HEK293T细胞GAPDH位点,通过流式细胞仪分析HDR-USR富集的HDR介导的eGFP敲入效率达35.7%,相比未富集组高达8.9倍。（5）基因片段删除方面:HDR-USR应用于HEK293T细胞AAVS1位点,通过挑取细胞单克隆进行基因分型分析,HDR-USR富集的双等位基因同时删除的效率达61%,相比未富集组效率高达35.9倍。（6）在HDR-USR所富集的阳性细胞克隆中,通过嘌呤霉素抗性分析以及PCR扩增没有检测到载体随机整合;通过Sanger测序和T7E1酶切试验没有检测到载体在细胞基因组的脱靶效应。（7）在HDR-USR富集的基础上,yRad52、Ad4E1B-E4orf6、ssODN供体或者PCR扩增形成的线性双链供体或者双切供体都可以进一步提高其所富集的HDR效率。总之,HDR-USR在不干扰细胞基因组完整性的前提下,为富集精准编辑的细胞提供了一种简单、快速、高效的筛选方式,为推动基因编辑技术在基因功能研究、精准医疗以及动物遗传育种方面的应用提供了有效途径。

论文目录

  • 摘要
  • ABSTRACT
  • 主要符号对照表
  • 第一章 文献综述
  •   1.1 CRISPR/Cas技术
  •     1.1.1 CRISPR/Cas简介
  •     1.1.2 CRISPR/Cas系统的结构与类型
  •     1.1.3 CRISPR/Cas9 技术的开发与应用
  •   1.2 DNA双链断裂的修复机制
  •     1.2.1 NHEJ介导的双链断裂修复
  •     1.2.2 HDR介导的双链断裂修复
  •   1.3 HDR介导的精准编辑
  •     1.3.1 选择合适的核酸酶
  •     1.3.2 优化gRNA的设计
  •     1.3.3 同源修复模板的设计
  •   1.4 提高HDR精准编辑效率的策略
  •     1.4.1 抑制NHEJ通路或者激活HDR通路
  •     1.4.2 控制细胞周期
  •     1.4.3 其它提高HDR效率的策略
  •   1.5 筛选富集基因编辑细胞的策略
  •     1.5.1 筛选转染阳性的细胞
  •     1.5.2 筛选核酸酶活性的细胞
  •     1.5.3 利用内源性基因为标记进行筛选
  •   1.6 筛选富集HDR修复细胞的策略
  •   1.7 基因组精准编辑在畜牧业中的应用
  •     1.7.1 精准编辑在猪中的应用
  •     1.7.2 精准编辑在牛中的应用
  •     1.7.3 精准编辑在羊中的应用
  •   1.8 本研究的目的意义
  • 第二章 CRISPR/Cas9 介导HDR修复细胞的通用筛选报告载体系统的构建
  •   2.1 试验材料
  •     2.1.1 试验菌种、质粒及细胞系
  •     2.1.2 主要试剂及仪器
  •     2.1.3 引物
  •   2.2 试验方法
  •     2.2.1 筛选报告载体HDR-USR1 的构建
  •     2.2.2 筛选报告载体HDR-USR2 的构建
  •     2.2.3 筛选载体pPuro-T2A-eGFP的构建
  •     2.2.4 细胞培养、转染与药物筛选
  •   2.3 试验结果
  •     2.3.1 筛选报告载体HDR-USR1 的鉴定
  •     2.3.2 筛选报告载体HDR-USR2 的鉴定
  •     2.3.3 筛选载体pPuro-T2A-eGFP的鉴定
  •     2.3.4 验证三种筛选报告载体是否工作
  •   2.4 讨论
  •   2.5 小结
  • 第三章 HDR-USR在富集HDR介导精准点编辑细胞中的应用
  •   3.1 试验材料
  •     3.1.1 质粒和细胞
  •     3.1.2 主要试剂和仪器
  •     3.1.3 引物
  •   3.2 试验方法
  •     3.2.1 不同基因位点打靶载体的构建
  •     3.2.2 不同基因位点供体载体的构建
  •     3.2.3 不同基因位点SSA-RPG和 NHEJ-RPG载体的构建
  •     3.2.4 细胞培养
  •     3.2.5 细胞转染
  •     3.2.6 嘌呤霉素筛选浓度的确定
  •     3.2.7 比较不同筛选报告载体富集细胞后的细胞存活状态以及HDR效率
  •     3.2.8 验证HDR-USR是否能应用于多种细胞的不同基因位点
  •     3.2.9 扩增子深度测序进一步分析HDR和 NHEJ效率
  •     3.2.10 验证HDR-USR在同时富集两个基因位点精准点编辑细胞中的应用
  •     3.2.11 HDR-USR富集细胞后挑取细胞单克隆进行基因分型
  •     3.2.12 HDR-USR富集细胞中随机整合以及脱靶效应检测
  •   3.3 试验结果
  •     3.3.1 不同基因位点打靶载体的鉴定
  •     3.3.2 不同基因位点供体载体的鉴定
  •     3.3.3 不同基因位点SSA-RPG和 NHEJ-RPG载体的鉴定
  •     3.3.4 不同细胞系的细胞形态及其嘌呤霉素工作浓度的确定
  •     3.3.5 不同报告载体组嘌呤霉素筛选后细胞存活情况
  •     3.3.6 HEK293T细胞EMX1、AAVS1、CCR5、VEGF、HPRT1和NUDT5 位点利用不同报告载体富集后HDR效率的比较
  •     3.3.7 HDR-USR系统在不同细胞系富集HDR修复细胞中的应用
  •     3.3.8 EMX1 位点利用HDR-USR富集后细胞单克隆的基因分型
  •     3.3.9 HDR-USR系统在同时富集EMX1和AAVS1 两个基因位点精准点编辑细胞中的应用
  •     3.3.10 HDR-USR富集细胞中随机整合以及脱靶效应的检测
  •   3.4 讨论
  •   3.5 小结
  • 第四章 HDR-USR在富集HDR介导的基因片段插入与片段删除细胞中的应用
  •   4.1 试验材料
  •     4.1.1 质粒和细胞
  •     4.1.2 主要试剂和仪器
  •     4.1.3 引物
  •   4.2 试验方法
  •     4.2.1 GAPDH位点基因片段插入相关的三个打靶载体以及GAPDH-SSA-RPG载体的构建
  •     4.2.2 GAPDH位点eGFP插入相关供体载体的构建
  •     4.2.3 GAPDH位点eGFP插入相关不同同源臂长度供体的制备
  •     4.2.4 流式细胞仪分析三个GAPDH打靶载体的打靶效率
  •     4.2.5 流式细胞仪分析HDR介导的eGFP插入效率
  •     4.2.6 构建AAVS1 位点片段删除相关的两个打靶载体
  •     4.2.7 构建AAVS1 位点片段删除相关的供体载体
  •     4.2.8 细胞转染、挑细胞单克隆及基因分型鉴定
  •   4.3 试验结果
  •     4.3.1 GAPDH位点片段插入相关打靶载体及GAPDH-SSA-RPG载体的鉴定
  •     4.3.2 GAPDH位点eGFP插入供体载体pD-eGFP-KI的鉴定
  •     4.3.3 GAPDH位点片段插入相关三个sgRNAs打靶效率的比较
  •     4.3.4 未筛组与HDR-USR筛选组中HDR介导的e GFP整合效率的比较
  •     4.3.5 AAVS1 位点片段删除相关的打靶载体以及供体载体的鉴定
  •     4.3.6 未筛组与HDR-USR筛选组中HDR介导的AAVS1 删除效率的比较
  •   4.4 讨论
  •   4.5 小结
  • 第五章 HDR-USR系统的优化
  •   5.1 试验材料
  •     5.1.1 质粒和细胞
  •     5.1.2 主要试剂和仪器
  •     5.1.3 ssODNs
  •     5.1.4 引物
  •   5.2 试验方法
  •     5.2.1 含有不同打靶效率靶位点（sgT1、sgT2、sgT3）的三个HDR-USR载体的构建
  •     5.2.2 含有不同靶位点的四个HDR-USR载体富集HDR效率的比较
  •     5.2.3 嘌呤霉素药物筛选时间对HDR-USR富集HDR效率的影响
  •     5.2.4 Ad4E1B-E4orf6、yRad52、SCR7和nocodazole对 HDR-USR富集HDR效率的影响
  •     5.2.5 不同类型的供体对HDR-USR富集HDR效率的影响
  •   5.3 试验结果
  •     5.3.1 HDR-USR四个靶位点打靶活性的比较
  •     5.3.2 含有不同靶位点的四个HDR-USR在 EMX1、AAVS1、HPRT1 三个位点富集HDR效率的比较
  •     5.3.3 嘌呤霉素药物筛选时间对HDR-USR富集HDR效率的影响
  •     5.3.4 Ad4E1B-E4orf6、yRad52、SCR7和nocodazole对 HDR-USR富集HDR效率的影响
  •     5.3.5 不同类型供体对HDR-USR富集HDR效率的影响
  •   5.4 讨论
  •   5.5 小结
  • 结论与创新点
  • 参考文献
  • 致谢
  • 作者简介

    • 文章来源

    类型: 博士论文

    作者: 闫娜娜

    导师: 张智英

    关键词: 同源重组修复,通用筛选报告载体,精准基因编辑,哺乳动物细胞

    来源: 西北农林科技大学

    年度: 2019

    分类: 基础科学

    专业: 生物学,生物学

    单位: 西北农林科技大学

    基金: 国家科技重大专项转基因生物新品种培育专项基金(编号:2014ZX0801009B和2018ZX0801009B)

    分类号: Q78

    总页数: 114

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