利用转座子插入突变文库研究杀鱼爱德华氏菌代谢和毒力互作机制

论文摘要

转座子是存在于染色体上的一段可移动的DNA。基于已经成熟的Mariner家族Himar1转座子pMAR2×T7,我们设计并改造成满足特定需求的转座子pMKGR。pMKGR携带庆大霉素抗性标签和mCherry红色荧光标签,也携带无启动子的EGFP和卡那霉素阅读框,识别TA碱基位点并且插入染色体。以杀鱼爱德华氏菌（Edwardsiella piscicida）为模式菌,成功构建了包含20,668个插入位点确定的突变株文库。该文库覆盖杀鱼爱德华氏菌全基因组（编码3,599基因）中2,806个基因,覆盖率为78.0%。根据文库的分析数据和中性碱基模型,我们预测杀鱼爱德华氏菌大约有464个必需基因。针对文库不同的筛选目的,在文库的基础上构建了 5个不同的子库,利用5个子库进行了体内外毒力相关基因的筛选。Tn-seq筛选结果显示,杀鱼爱德华氏菌毒力表达与其代谢状态密切相关,尤其是甘露糖代谢和脂肪酸代谢,相关基因的突变导致该菌的体内存活能力显著降低。对于甘露糖代谢,E.piscicida通过ManXYZ催化甘露糖生成甘露糖-6磷酸（Man-6P）,经ManA催化进一步生成果糖-6磷酸（Fru-6P）,参与糖酵解过程。我们发现,甘露糖代谢产物Man-6P可以通过直接结合DeoR家族转录调控因子ETAE2071（EvrA）,调控三型分泌系统（T3SS）以及六型分泌系统（T6SS）表达。实验证实,EvrAR141和EvrAR221是和Man-6P相互作用的关键氨基酸。突变这两个氨基酸后,EvrA不能感受并结合甘露糖,进而关闭esrB的表达。在考察脂肪酸和T3/T6SS表达之间关系时,我们发现E.piscicida体内不饱和脂肪酸含量和T3SS显著负相关（R2=0.981）。实验发现,游离长链单不饱和脂肪酸（UFA）可以直接与EsrC相互作用,使EsrC失去结合DNA的能力,最终关闭T3/T6SS的表达。通过对EsrC蛋白结构的模拟分析,发现EsrC和UFA直接作用的关键氨基酸为EsrCR38。在E.piscicida感染宿主和成功定植过程中,UFA扮演了更为重要的角色。UFA不仅动态调控了杀鱼爱德华氏菌T3/T6SS毒力系统的表达,而且促进了宿主细胞内脂滴（Lipid droplet,LD）的大量形成,进一步介导炎症反应,清除病原菌。在宿主细胞中,多余的脂肪酸主要以甘油三酯和胆固醇酯的形式储存在LD细胞器中。细胞中LD的含量与不饱和脂肪酸含量线性相关。E.pisciciEa感染宿主细胞的过程显著降低了宿主细胞中LD的含量,E.piscicida ΔT3SS感染过程却显著激活了宿主体内SCD1表达,促进了LD形成。E.piscicida T3SS对宿主细胞中UFA/LD合成的抑制不依赖于T3SS针状结构,而依赖于T3SS效应物。UFA显著抑制了EE.piscicida在HeLa细胞中定植,E.piscicida在SCD1-/-细胞中的定植水平显著高于在野生型HeLa细胞中的定植水平。在E.piscicida感染斑马鱼过程中,外加油酸显著提高了斑马鱼的存活率,SCD1-/-斑马鱼显示出对E.piscicida更高的敏感性。UFA/LD既能抑制病原菌毒力表达,又能激活宿主免疫响应,以抵抗和清除外来的病原菌。因此,UFA/LD在抵抗E.piscicida感染宿主方面发挥了重要作用。在自然界中,病原菌利用自身代谢物或者宿主体内代谢物作为信号调控毒力表达是病原菌适应复杂多变体内外环境的一种重要策略。本课题利用转座子插入突变文库为工具,以E.pipscicida为模式菌,研究病原微生物代谢和毒力互作关系。本研究为水产病原防治和水产养殖提供重要的指导。

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摘要

Abstract

第1章文献综述

1.1 杀鱼爱德华氏菌

1.1.1 杀鱼爱德华氏菌概述

1.1.2 杀鱼爱德华氏菌的主要毒力系统

1.1.3 杀鱼爱德华氏菌T3/T6SS毒力调控网络

1.2 代谢和毒力表达相互作用关系

1.2.1 糖代谢和毒力关系

1.2.2 脂肪酸代谢和毒力关系

1.3 脂肪酸代谢

1.3.1 细菌的脂肪酸代谢系统

1.3.2 真核生物体内脂肪酸代谢

1.4 脂滴与病原菌相互作用

1.4.1 脂滴

1.4.2 真核生物体内脂滴相关蛋白

1.4.3 脂滴和免疫

1.4.4 病原微生物利用宿主体内的脂滴完成定植

1.5 转座子插入突变文库

1.5.1 转座子功能和分类

1.5.2 位点确定转座子插入突变文库

1.5.3 转座子插入测序

1.6 本课题的研究内容及意义

第2章转座子插入突变文库的构建

2.1 前言

2.2 实验材料

2.2.1 菌种和质粒

2.2.2 主要试剂及缓冲液的配制

2.2.3 分析处理软件

2.3 实验方法

2.3.1 大肠杆菌感受态细胞制备

2.3.2 接合

2.3.3 突变株挑选和平板克隆

2.3.4 热不对称PCR

2.3.5 测序数据处理

2.4 实验结果

2.4.1 转座子插入位点确定的突变株文库的构建

2.4.2 转座子插入位点确定的突变株文库数据统计分析

2.4.3 转座子插入位点的验证和子库构建

2.5 讨论

2.6 本章小结

第3章三型分泌系统调控因子筛选和鉴定

3.1 前言

3.2 实验材料

3.3 实验方法

3.3.1 文库的筛选

3.3.2 沉降表型

3.3.3 缺失株构建

3.3.4 胞外蛋白抽提

3.3.5 SDS-PAGE蛋白电泳

3.3.6 生长曲线和荧光素酶的测定

3.3.7 Western blot

3.3.8 凝胶迁移阻滞实验

3.4 实验结果

3.4.1 文库筛选结果分析

3.4.2 T3SS基因岛外蛋白对T3SS的显著激活

3.4.3 转座子插入突变株和框内缺失株表型对比

1437 （YebC）的功能分析'> 3.4.4 ETAE₁437 （YebC）的功能分析

2071 （EvrA）的功能分析'> 3.4.5 ETAE₂071 （EvrA）的功能分析

3.4.6 EvrA结合Mannose-6P增强对T3/T6SS的激活

3.5 讨论

3.6 本章小结

第4章大菱鲆体内毒力相关基因筛选

4.1 前言

4.2 实验材料

4.3 实验方法

4.3.1 杀鱼爱德华氏菌在大菱鲆体内筛选

4.3.2 高通量测序文库构建

4.3.3 测序结果分析

4.3.4 大菱鲆的驯养和攻毒

4.4 实验结果

4.4.1 大菱鲆感染模型和突变株文库体内筛选

4.4.2 杀鱼爱德华氏菌感染大菱鲆过程必需基因分析

4.4.3 脂肪酸代谢相关基因体内毒力验证

4.5 讨论

4.6 本章小结

第5章胞内长链不饱和脂肪酸对T3SS表达的调控

5.1 前言

5.2 实验材料

5.3 实验方法

5.3.1 荧光素酶（luxAB）和EGFP表达质粒构建

5.3.2 EsrC及点突变蛋白表达纯化

5.3.3 脂肪酸组成测定

5.3.4 细胞培养和细胞感染

5.3.5 普通荧光细胞样品处理

5.4 实验结果

5.4.1 脂肪酸代谢相关基因影响T3SS表达

5.4.2 脂肪酸组成影响T3SS表达

5.4.3 长链不饱和脂肪酸通过结合EsrC抑制T3SS表达

R38直接结合UFA'> 5.4.4 EsrC通过EsrC^R38直接结合UFA

5.5 讨论

5.6 本章小结

第6章 T3SS操控宿主体内脂肪酸组成促进病原菌在宿主体内定植

6.1 前言

6.2 实验材料

6.3 实验方法

6.3.1 表达质粒和病毒转染质粒构建

6.3.2 HeLa和J774A.1细胞感染

6.3.3 乳糖脱氢酶检测

6.3.4 慢病毒制备和转染

6.3.5 CRISPR/Cas9敲除细胞株筛选

6.3.6 脂滴、Plin2和HA融合蛋白免疫荧光检测

6.3.7 免疫透射电镜样品制备

6.3.8 蛋白质免疫共沉淀

6.3.9 斑马鱼活体成像和攻毒实验

6.4 实验结果

6.4.1 HeLa细胞中LD含量与UFA含量线性相关

6.4.2 T3SS通过NF-κB信号通路激活SCD1表达

6.4.3 E.piscicida ΔT3SS感染激活宿主细胞的UFA和LD合成

6.4.4 E.piscicida招募LD进入囊泡

6.4.5 UFA抑制E.piscicida在HeLa细胞中定植

6.4.6 UFA/LD有助于宿主抵抗E.piscicida感染

6.5 讨论

6.6 本章小结

第7章结论与展望

7.1 主要结论

7.2 论文创新点

7.3 展望

参考文献

致谢

攻读博士学位期间的论文成果

附录一

附录二

文章来源

类型: 博士论文

作者: 魏立帆

导师: 刘琴,王启要

关键词: 杀鱼爱德华氏菌,转座子,突变体文库,不饱和脂肪酸,三型分泌系统,脂滴,代谢,毒力

来源: 华东理工大学

年度: 2019

分类: 基础科学,农业科技

专业: 生物学,水产和渔业

单位: 华东理工大学

基金: 国家自然科学基金提供的经费支持(31602200,31430090)

分类号: Q78;S941.42

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