张素青[1]2003年在《肝细胞癌中p27～（kip1）及CyclinD_1的表达及意义》文中指出目的 研究肝细胞肝癌(HCC)中p27~(kipl)和CyclinD_1的表达，探讨其在HCC发生、发展中的作用。 方法 应用免疫组织化学S-P法检测40例肝细胞肝癌、15例肝硬化组织和5例正常肝组织石蜡标本中p27~(kipl)和CyclinD_1蛋白的表达。 结果 (1)p27~(kiPl)蛋白在40例肝细胞肝癌中表达阳性率为32.5％(13／40)，对照组15例肝硬化组织中为60％(9／15)，正常肝组织中为80％(4／5)，p27~(kipl)蛋白在肝细胞癌中的表达与其在肝硬化组织和正常肝组织中的表达相比有显着性差异(P＜0.05)，p27~(kipl)蛋白与肝细胞肝癌的组织学分级、组织学类型、淋巴结转移、远处转移和生存期均有统计学意义。(2)CyclinD_1蛋白在40例肝细胞肝癌中表达阳性率为57.5％(23／40)，对照组15例肝硬化组织中为46.67％(7／40)，正常肝组织中为40％(2／5)，CyclinD_1蛋白在肝细胞癌中的表达与其在肝硬化组织和正常肝组织中表达相比无显着差异(P＞0.05)，CyclinD_1蛋白仅与肝细胞癌的组织学分级、远处转移有统计学意义。(3)p27~(kipl)蛋白和CyclinD_1蛋白的表达之间无统计学意义。 结论 (1)p27~(kipl)和CyclinD_1与肝细胞肝癌的发生、发展可能都有密切关系，但二者是独立地起作用的。(2)p27~(kipl)蛋白在一定程度上可以作为判断患者病情预后的指标之一。
李志壮, 方庆安, 施公胜[2]2004年在《细胞周期因子cyclinD1,cyclinE,P27~(KIP1)在肝细胞癌中的表达研究》文中研究表明目的 :探讨 cyclin D1,cyclin E,P2 7KIP1 在肝细胞癌中的表达及其意义。方法 :应用免疫组织化学 S- P法检测 5 0例肝细胞癌组织标本及 4 4例相应的癌旁肝组织标本中的 cyclin D1,cyclin E,P2 7KIP1 的表达。结果 :cyclin D1,cy-clin E,P2 7KIP1在肝细胞癌组织中的阳性表达率均高于癌旁组织 (P<0 .0 5 )。P2 7KIP1的低表达 ,cyclin D1的过度表达与肝细胞癌临床分期、有无转移显着相关。cyclin E过度表达者也易发生远处转移。肝癌组织中 P2 7KIP1 的低表达与 cyclin E的过度表达有相关关系。 P2 7KIP1 阳性表达者术后生存率高。结论 :P2 7KIP1 、cyclin D1作为调节细胞周期的重要因子 ,在肝细胞癌的发生、发展中发挥重要作用。P2 7KIP1是预测肝癌转移和预后的一个指标。
力超, 郑天荣, 郑雄伟, 陆丽俐, 林贤东[3]2006年在《肝细胞癌组织中PTEN和p27~(Kip1)及cyclinD1蛋白表达及临床意义》文中提出目的:研究肝细胞癌(hepatocellular carcinoma, HCC)中PTEN、p27Kip1和cyclinD1蛋白的表达及相互关系,初步探讨它们在肝细胞癌的发生发展中的生物学意义。方法:应用Elivision免疫纽化方法检测53例肝细胞癌组织及癌旁肝组织中PTEN、p27Kip1和cyclinD1蛋白表达。结果: 53例肝细胞癌组织中p27Kip1和cyclinD1蛋白表达的阳性率分别为65％和53％,均高于癌旁肝组织(x2=34．11,x2=29．05,P值均为0．000),肝细胞癌组织中PTEN蛋白表达的阳性率(57％)明显低于癌旁肝组织中的阳性率(96．2％)(x2=20．94, P=0．000),PTEN和cyclinD1蛋白表达与肿瘤大小、TNM分期和是否伴肝硬化无关;与组织分化程度、有无侵袭性呈显着相关(P值分别为0．014、0．003、0．026和0．042)。p27Kip1蛋白表达与肿瘤大小和是否伴肝硬化无关,与肝细胞癌组织分化程度、TNM分期和有无侵袭性呈显着相关(P值分别为0．000、0．008和0．001)。PTEN蛋白表达与p27Kip1和cyclinD1蛋白表达无相关性。结论: PTEN、p27Kip1和cyclinD蛋白在肝细胞癌的发生发展中发挥重要作用。PTEN、p27Kip1和cyclinD蛋白的联合检测对评估肝细胞癌的恶性程度有参考价值。
张素青, 李德春[4]2004年在《p27~(kipl)及CyclinD_1在肝细胞癌中的表达及意义》文中指出目的 研究p2 7kipl和CyclinD1蛋白表达在肝细胞肝癌 (HCC)中发生、发展中的作用。方法 免疫组化S P法检测 4 0例HCC、15例肝硬化组织和 5例正常肝组织石蜡标本p2 7kipl和CyclinD1蛋白表达。结果 p2 7kipl蛋白在HCC、肝硬化、正常肝组织表达阳性率分别为 32 5 % (13/ 4 0 )、6 0 % (9/15 )、80 % (4/ 5 ) ,p2 7kipl蛋白在HCC中表达与肝硬化和正常肝组织中表达比较有显着性差异 (P <0 0 5 ) ,p2 7kipl表达且与HCC的组织学分级、类型、淋巴结转移和生存期有统计学差异 ;CyclinD1蛋白在HCC、肝硬化、正常肝组织表达阳性率分别为 5 7 5 % (2 3/ 4 0 )、4 6 6 7% (7/ 4 0 )、4 0 % (2 / 5 ) ,CyclinD1蛋白在HCC中表达与肝硬化和正常肝组织中表达比较无显着差异 (P >0 0 5 ) ,CyclinD1表达仅与HCC的组织学分级有统计学差异 ;p2 7kipl和CyclinD1蛋白表达两者之间无相关性。结论 p2 7kipl和CyclinD1与HCC的发生、发展有着密切联系 ,两者独立地起作用 ;p2 7kipl蛋白在判断患者病情预后方面有较重要的价值。
秦军[5]2007年在《p27~（kip1）及其相关分子JAB1与肝细胞肝癌相关性的初步研究》文中进行了进一步梳理目的1.研究细胞周期调控蛋白p27kip1及其相关分子JAB1在肝细胞癌(human hepatocellular carcinoma, HCC)中的表达,并结合增殖指标Ki67和临床病理资料初步探讨p27及JAB1与HCC发生发展的关系。2.克隆人类p27kip1基因,构建其真核表达载体。3.研究化疗药物叁氧化二砷(As2O3)对肝癌细胞活性、细胞周期及细胞凋亡的影响,初步探讨p27kip1及JAB1在此过程中的作用。方法1.首先在组织水平,选取76例HCC及癌旁组织,l0例肝血管瘤旁肝组织病例标本,10例HCC及癌旁肝新鲜组织,采用免疫组化,10例新鲜组织中有6例采用免疫印迹(Western blot)方法,检测p27kip1及其相关分子JAB1的表达情况,并结合增殖指标Ki67、PCNA和临床病理资料初步探讨p27kip1及JAB1与HCC发生发展的关系。2.采用RT-PCR技术扩增人类p27kip1cDNA全长序列,通过DNA重组技术将其重组于pcDNA3.1及pEGFP-N2载体,构建p27kip1正、反义真核表达质粒及p27-EGFP融合蛋白表达质粒,通过酶切电泳分析及DNA测序的方法对重组表达质粒进行鉴定。3.以WST-1法、流式细胞术及Hochest染色法检测叁氧化二砷对人肝癌SMMC-7721细胞活性、细胞周期及细胞凋亡的影响, Western blot技术检测p27kip1分子网络中主要成员在此过程中的表达变化,运用细胞免疫荧光技术检测p27kip1相关分子在药物作用后亚细胞定位的变化。结果1.肝癌和癌旁组织免疫印迹结果显示,p27kip1主要在癌旁高表达,而JAB1蛋白在大部分HCC组织中的表达高于对应癌旁肝组织。免疫组化结果显示:JAB1在HCC中的表达高于癌旁组织和血管瘤旁肝组织。JAB1的表达与肝癌组织分化程度,血清AFP值及转移相关。p27kip1在正常肝组织和癌旁组织中的表达高于HCC组织,表达强度与肝癌组织分化程度,血清AFP值、坏死程度及转移相关。相关性分析表明HCC组织中JAB1蛋白表达与p27kip1蛋白表达呈负相关,与ki67表达正相关,p27的表达与ki67呈负相关。2.构建p27kip1正、反义真核表达质粒及p27-EGFP融合蛋白表达质粒,通过酶切电泳分析及DNA测序的方法对重组表达质粒进行鉴定,证实构建成功。3.叁氧化二砷能够抑制肝癌SMMC-7721细胞生长活性,小剂量叁氧化二砷可诱导肝癌细胞发生G2/M期生长阻滞,大剂量可诱发细胞凋亡;随As2O3作用时间的延长,SMMC-7721中p27kip1表达增加,CDK2、CRM1、JAB1等蛋白表达下降。免疫荧光结果显示,加药刺激后,p27kip1发生从胞浆向胞核的易位,伴有JAB1胞浆向胞核的易位,CRM1的胞浆定位变化不明显。。结论1. p27kip1蛋白表达的降低、JAB1表达的增高与HCC的发生及肿瘤恶性程度密切相关。JAB1蛋白的表达与p27kip1负相关,与ki67正相关,提示JAB1在HCC组织中表达上调,可能是通过作用于细胞周期调控蛋白p27kip1,加速了p27kip1的出核降解,使其表达及代谢发生异常。导致细胞周期失控并促进细胞异常增殖,从而参与了HCC的发生和发展。2.成功构建了人类p27kip1基因的正、反义真核表达质粒和p27-EGFP融合蛋白表达质粒,为进一步探讨p27kip1基因在肝癌发生中的作用奠定了实验基础。3.叁氧化二砷能够抑制肝癌细胞活性,引起细胞周期阻滞或凋亡,上调p27kip1蛋白表达,下调CRM1、JAB1等蛋白表达,同时伴有p27kip1相关分子亚细胞定位的改变。提示,CRM1、JAB1可能通过加速p27kip1的降解、改变p27kip1的亚细胞定位来影响p27kip1的功能,参与As2O3对SMMC-7721细胞生长抑制的分子调控机制。
李鹏[6]2010年在《P27~（kip1）157号苏氨酸磷酸化与肝癌相关性研究》文中提出目的1.研究细胞周期正调控因子p27Kip1的磷酸化在肝细胞肝癌中的表达与临床病理和预后的关系,初步探讨p27Kip1的磷酸化在肝细胞肝癌中的重要意义;2.运用PI3K抑制剂LY294002对肝癌SMMC-7721细胞的影响及与p-p27kip1 Thr157分子网络的关系,初步探讨p27kip1分子磷酸化在肝细胞肝癌发生机制过程中的作用。3.构建pEGFP-p27wt和pEGFP - p27Kip1 (T198A)突变质粒,为下一步转染HCC细胞株分析突变后对p27kip1的降解、亚细胞定位及生物学功能的影响奠定了实验基础。方法1.我们研究p27Kip1的157号位苏氨酸磷酸化在肝细胞肝癌中的表达,对51例肝癌组织石蜡切片进行免疫组织化学分析和对8例新鲜冰冻组织进行Western blot分析。检测p-p27kip1 Thr157与肝细胞肝癌的临床病理及其预后之间的关系。然后进一步观察p27Kip1的198号位苏氨酸磷酸化在肝细胞肝癌中的表达情况。2.我们运用CCK-8和流式细胞仪检测肝癌细胞用PI3K抑制剂LY294002处理后的增值和细胞周期的变化;Western blot分析p27Kip1表达变化和定位情况。3.人类野生型p27Kip1是通过寡核苷酸引物(5’CGAGATCTGATGTCAAACG TGCGAGT 3’和5’CT GAATTC TTGACGTCTTCTGAGGCC 3’) PCR扩增,然后克隆到质粒pEGFP-N2的Bgl II-EcoRI位点,产生pEGFP- p27Kip1wt载体。而p27Kip1的198号位苏氨酸突变为丙氨酸p27Kip1 (T198A)是运用重迭(序列)延伸PCR技术使突变位点转到野生型的p27Kip1上,其引物是5’CTCTCGAGGATGTCAAACGTGCGAGT 3’and 5’CGGAATTCTTTGACGTCTTCT GAGGCC 3’。pEGFP-p27wt和pEGFP - p27Kip1 (T198A)都被插入载体pcDNA3.1/myc-His的XhoI/EcoRI位点。最后测序确定质粒克隆的准确性。结果1. 51例免疫组化分析发现p-p27kip1 Thr157和KI67的表达呈正相关(r=0.161;p<0.05);p-p27kip1 Thr157是与肝癌患者肿瘤病理分级相关的(P=0.043),而Ki67的表达强度与患者血清AFP水平、坏死程度、肿瘤病理分级以及转移相关,P值分别为0.035、0.040、0.004、0.049。Kaplan-Meier分析发现p-p27kip1 Thr157和KI67的表达与肝癌患者的预后相关。进一步观察到p-p27kip1 Thr198在HCC中高表达,表达在细胞核和(或)胞浆中,p-p27kip1 Thr198在非癌组织中几乎无表达。2.本研究中PI3K抑制剂LY294002明显地抑制肝癌细胞的增殖,而且呈剂量依赖性,这个过程是通过p27来实现的,而p21,p16等其它抑癌因子在此过程中没有表达变化;同时核浆分离Western blot检测p27在核内聚集。3.成功得构建pEGFP-p27wt和pEGFP - p27Kip1 (T198A)质粒。结论1. P-p27kip1 Thr157可能是肝细胞肝癌的重要的预后指标。2.在临床上PI3K抑制剂LY294002可能可以作为肝癌化疗的一种药物; PI3K抑制剂LY294002发挥抑制增殖的作用可能是通过调控p27kip1表达和定位来实现的。
陈国良[7]2007年在《罗格列酮对肝癌SMMC-7721细胞周期和凋亡的影响及其可能的作用机制》文中认为目的:肝细胞癌( hepatocellular carcinoma,HCC)是我国最常见的恶性肿瘤之一,恶性程度高,预后差,而且手术治疗后复发率较高,但是关于肝细胞癌发生、发展的确切分子机制还不清楚,因此研究肝细胞癌的发生、发展机理以及探讨新的治疗措施具有极其重要的临床意义。过氧化物酶体增殖物激活受体(peroxisome proliferator activated receptor ,PPARs)是一类配体依赖的序列特异的核转录因子,因其具有被过氧化物酶体增殖物激活的特性,故而得名。迄今为止,已证实在脊椎动物中存在PPARα、PPARβ(或δ)、PPARγ这3种亚型,它们在结构、功能及组织分布上均有差异。PPARγ的生物学功能复杂多样,包括调控脂肪和糖代谢,脂肪细胞终末分化;控制单核细胞分化成熟,诱导巨噬细胞凋亡,抑制炎症反应;诱导肿瘤细胞分化和凋亡,抑制肿瘤血管生成;抗肝纤维化作用;抗动脉粥样硬化,降血脂和降血压;改善心功能衰竭和参与心室重构等。最新研究证实,PPARγ受体在多种肿瘤组织及细胞如大肠癌、乳腺癌、前列腺癌、胃癌、胰腺癌及肝癌中过度表达,与癌细胞增殖、分化、凋亡和肿瘤生成有关。胰岛敏剂噻唑烷二酮类化合物(thiazolidinedionesTZDs),如罗格列酮(ciglitazone)、吡格列酮(pioglitazone)、环格列酮(ciglitazone)等,是PPARγ受体人工合成配体,这类药增强机体对胰岛素的敏感性并具有降低血糖的作用,临床上主要用于Ⅱ型糖尿病的治疗。最近研究认为该类药物可通过激活PPARγ受体调控肿瘤细生长、促进肿瘤细胞凋亡、抑制血管生成等。细胞凋亡是细胞生命周期中的重要组成部分,是有机体调控机体发育,维持内环境稳定的重要环节,是一种由内在基因编码调节,通过主动的生化过程,使细胞自杀死亡的现象,也就是说它是基因严格控制的细胞自主性死亡过程。目前认为与凋亡调控有关的基因有叁类:抑制凋亡的基因﹑促进凋亡的基因和凋亡过程中起协助作用的基因。p27kip1作为近年来新发现的负性细胞周期调节蛋白,属于CDKI中Cip/kip家族。p27kip1主要作用是通过在G1期对cyclinE和CDK2结合的抑制,阻止细胞周期由G1期进展到S期,从而导致细胞周期停滞,使细胞发生肥大或凋亡。细胞S期激酶相关蛋白2(S-phase kinase associated protein 2 Skp2)是一种新发现的癌基因,Skp2是泛素连接酶E3结合磷酸化的p27kip1识别蛋白质,参与p27kip1的泛素化降解。Skp2的主要作用是促进细胞通过转换关卡的作用,有促进细胞周期的作用,从而促进细胞增殖。近年揭示Skp2在多种肿瘤中过度表达,但其对肿瘤的作用还未完全阐明。本研究拟检测肝癌细胞系中PPARγmRNA的表达及不同浓度罗格列酮对SMMC-7721细胞周期及凋亡率的影响,并检测与细胞周期调控相关的细胞因子p27kip1及Skp2的变化,从而探讨罗格列酮诱导肝癌SMMC-7721细胞凋亡及对细胞周期调控的可能机制。方法:对人肝细胞癌细胞株SMMC-7721细胞进行常规培养。采用逆转录-聚合酶链式反应(reverse transcription polymerase chain reaction,RT-PCR)技术,检测SMMC-7721细胞PPARγmRNA表达的变化,以?-actin作为内参照标准,并对扩增产物进行凝胶扫描;罗格列酮分别取0、0.1、1、10、100μmol/L 5个浓度组,其中10μmol/L浓度组取24h、48h、72h叁个作用时间点培养细胞,采用FCM检测不同时间点、不同浓度罗格列酮对肝癌细胞株SMMC-7721细胞周期和凋亡率的影响;以Western- blot方法检测不同时间点、不同浓度罗格列酮对SMMC-7721 p27kip1及Skp2蛋白表达的变化,并进行相对定量分析。结果:1 RT-PCR检测结果显示SMMC-7721中存在PPARγmRNA表达。2 FCM结果显示,罗格列酮使SMMC-7721细胞的G0/G1期比例显着升高( P<0.05),S期比例轻度降低( P<0.05),G2/M期明显降低(P<0.05),并且呈时间依赖性和剂量依赖性。同时罗格列酮对SMMC-7721细胞引起了显着的细胞凋亡,由于药物浓度和作用时间不同,细胞的凋亡率范围从5.15%～17.36%;但低浓度罗格列酮(0.1μmol/L)促进肝癌细胞凋亡作用不明显(P>0.05),但随着药物浓度的增加,罗格列酮的促凋亡作用明显增加并且呈时间依赖性和剂量依赖性(P<0.05)。3 Westen blot结果显示罗格列酮能明显降低Skp2蛋白的表达,且抑制作用呈明显时间及剂量依赖性(P<0.05)。罗格列酮使SMMC-7721细胞p27kip1蛋白表达量明显升高,并且呈时间依赖性和剂量依赖性(P<0.05)。结论:1人肝癌细胞系SMMC-7721中存在PPARγmRNA表达,位于360 bp处。2罗格列酮使SMMC-7721细胞的G0/G1期比例显着升高,S期比例轻度降低,G2/M期明显降低,使肝癌细胞停止于G0/G1期,同时罗格列酮对SMMC-7721细胞引起了显着的细胞凋亡,并且呈时间依赖性和剂量依赖性。3罗格列酮能时间及剂量依赖性降低Skp2蛋白及增加p27kip1蛋白的表达,表明罗格列酮可能通过上调p27kip1和下调Skp2的表达改变细胞周期和诱导细胞凋亡。
张萌[8]2010年在《PI3K/Akt信号通路在PPAR-γ激动剂诱导的HepG2细胞周期阻滞及凋亡中的作用研究》文中认为目的:肝细胞癌(Hepatocellular Carcinoma,HCC)是世界上第五大常见恶性肿瘤,高居全世界癌症死因的第叁位。由于高发病率和庞大的人口基数,肝癌在我国情况尤其严峻,我国是全球肝癌发病率最高的国家,肝癌为我国第二位恶性肿瘤致死病因。由于该病起病隐匿、进展迅速、早期就诊率低,60%-70%的患者在确诊时已处于肿瘤晚期,丧失了手术治疗的机会,只能进行姑息性的对症支持治疗。肝癌对放疗和化疗的敏感性低,易产生多药耐药,且毒副作用较大,迫切需要新的治疗方法及药物提高肝癌特别是晚期肝癌患者的生存期及生存质量。因此探讨肝癌的发病机制,寻找新的治疗靶点及有效的治疗药物,有十分重要的意义。过氧化物酶体增殖物激活受体γ(peroxisome proliferator-activated receptor-γ,PPAR-γ)是核激素受体超家族中的成员,PPAR-γ与人类恶性肿瘤的关系及其配体的治疗作用正受到广泛的研究。最近研究发现PPAR-γ激动剂噻唑啉二酮类药物(Thiazolidinediones,TZDs)具有抑制肿瘤细胞生长,诱导肿瘤细胞凋亡,抑制肿瘤血管生成,降低肿瘤侵袭力等作用,此类作用与PPAR-γ受体激活后通过多种途径调控癌基因和抑癌基因有密切关系,但具体分子机制并不清楚。研究认为PPAR-γ激动剂的抑癌作用可能通过上调PTEN实现。PTEN基因是人们发现的第一个具有磷脂酶活性的新型抑癌基因,可负性调节PI3K/Akt信号转导通路,在抑制细胞生长、分化,诱导细胞凋亡等方面发挥重要的作用。近期研究发现人类肿瘤细胞内Akt的高水平活化可导致Skp2的积聚,并将Skp2定义为Akt下游的靶蛋白。而Skp2介导的泛素-蛋白酶体降解途径在P27~(kip1)降解中起关键作用,Skp2的积聚将导致P27~(kip1)降解加速。P27~(kip1)蛋白是细胞周期抑制性蛋白,可负性调控细胞周期进程,诱导肿瘤细胞凋亡。由此我们推测,肿瘤细胞中可能存在PTEN-PI3K/Akt-Skp2-P27~(kip1)信号转导通路,PI3K/Akt通路在其中发挥重要作用,PPAR-γ激动剂的抑癌作用有可能通过此通路实现。本实验检测了PPAR-γ、PTEN、Akt、pAkt、Skp2及P27~(kip1)蛋白在人肝癌组织中的表达情况,分析它们与肝癌临床病理特征的关系及相互关系,结合随访资料探讨其表达的意义及预后价值。选取肝癌细胞系HepG2,观察PI3K/Akt信号转导通路阻断剂Wortmannin、PPAR-γ激动剂罗格列酮(Rosiglitazone,ROZ)及抑制剂GW9662对HepG2细胞的增殖、凋亡及细胞周期的影响,并检测PTEN/PI3K/Akt通路及P27~(kip1)、Skp2的变化,探讨PI3K/Akt信号通路在PPAR-γ激动剂诱导的肝癌细胞周期阻滞及凋亡中的作用,以期揭示PPAR-γ激动剂诱导肝癌细胞凋亡、调控细胞周期的可能分子机制。通过构建肝癌裸鼠移植瘤模型,观察罗格列酮对荷瘤裸鼠的抑瘤作用及其对PPAR-γ、PTEN、Akt、pAkt、Skp2及P27~(kip1)蛋白表达的影响,研究罗格列酮的体内抑瘤作用及可能机制,为PPAR-γ激动剂应用于肿瘤的临床治疗提供理论基础及实验依据。方法:1肝癌组织中PPAR-γ、PTEN、Akt、pAkt、Skp2及P27~(kip1)蛋白的表达及其意义收集河北医科大学第四医院肝胆外科手术切除并经病理证实的、随访资料完整的原发性肝癌标本78例,全部标本组织学类型均为肝细胞肝癌。所有患者术前均未经过任何抗肿瘤治疗。标本切除离体立即固定于10%中性甲醛溶液,石蜡包埋。由两位有经验病理医师进行病理组织学诊断。免疫组织化学方法联合检测78例肝癌组织及21例正常肝组织中PPAR-γ、PTEN、Akt、pAkt、Skp2及P27~(kip1)蛋白的表达,分析其与肝癌临床病理特征的关系及相互关系,并结合随访资料探讨它们在肝癌中表达的意义及预后价值。本研究随访时间1.0~61.3个月,中位随访时间为26.1个月。2研究PI3K的特异性抑制剂Wortmannin对人肝癌细胞株HepG2细胞周期和凋亡的影响,检测PPAR-γ、PTEN、Akt、pAkt、Skp2及P27~(kip1) mRNA及蛋白的变化,探讨其可能的作用机制以不含胎牛血清的RPMI-1640培养基常规培养人肝癌细胞株HepG2。采用MTT法检测不同浓度的Wortmannin(0、10、50、100、200nmol/L)在3h、10h、24h叁个时间点对HepG2细胞的增殖抑制作用;流式细胞术(FCM)测定细胞周期变化及细胞凋亡率;提取不同药物浓度及作用时间的细胞总RNA,RT-PCR检测PPAR-γ、PTEN、Skp2及P27~(kip1) mRNA的表达变化。提取不同药物浓度及作用时间的细胞总蛋白,Western blot检测PPAR-γ, PTEN, Akt, pAkt, Skp2和P27~(kip1)蛋白的表达变化。3研究PPAR-γ激动剂罗格列酮和抑制剂GW9662对人肝癌细胞株HepG2细胞周期和凋亡的影响,检测PPAR-γ、PTEN、Akt、pAkt、Skp2及P27~(kip1)mRNA及蛋白的变化,探讨其可能的作用机制常规培养人肝癌细胞株HepG2。采用MTT法检测不同浓度的罗格列酮(0、1、10、50、100μmol/L)在24h、48h、72h叁个时间点对HepG2细胞的增殖抑制作用;FCM测定细胞周期变化及细胞凋亡率;提取不同药物浓度及作用时间的细胞总RNA,进行RT-PCR检测并分析PPAR-γ、PTEN、Skp2及P27~(kip1) mRNA的表达变化。提取不同药物浓度及作用时间的细胞总蛋白,进行Western blot检测并分析PPAR-γ, PTEN, Akt, pAkt, Skp2和P27~(kip1)蛋白的表达变化。联合加入GW9662及罗格列酮(取0、5μmol/LGW9662+50μmol/LROZ、1μmol/LGW9662+50μmol/LROZ、50μmol/LROZ共4组)作用48h后,重复上述实验。4罗格列酮对人肝癌细胞裸鼠移植瘤生长的影响取4×10~6个肝癌细胞株HepG2细胞悬液接种于BALB/c-nu/nu裸小鼠的左侧肩胛部皮下构建肝癌细胞裸鼠移植瘤。10只裸鼠随机分为实验组和对照组(每组5只)。实验组给予30mg/kg罗格列酮(生理盐水溶解)每天一次灌胃,对照组给予相应体积生理盐水每天一次灌胃。给药5周后处死,取瘤块称重。实验过程中每隔3天测量肿瘤的最长径(a)和最短径(b),计算裸鼠移植瘤体积:V=a*b2/2,绘制肿瘤生长曲线,计算重量抑瘤率和体积抑瘤率。HE染色光镜下观察移植瘤形态学变化;FCM测定细胞周期变化及细胞凋亡率;Western blot检测并分析PPAR-γ, PTEN, Akt, pAkt, Skp2和P27~(kip1)蛋白的表达变化。结果:1肝癌组织中PPAR-γ、PTEN、Akt、pAkt、Skp2及P27~(kip1)蛋白的表达及其意义免疫组织化学检测显示在肝癌组织中,PPAR-γ、Akt、pAkt及Skp2蛋白的表达率分别为51.3%、66.7%、43.6%及47.4%,显着高于正常肝组织中的表达(P<0.05),PTEN及P27~(kip1)蛋白表达率分别为42.3%及34.6%,表达水平明显下调(P<0.05)。PPAR-γ蛋白在肿瘤直径>5cm组(66.7%)、门静脉癌栓组(88.9%)的阳性表达率显着升高(P<0.05);PPAR-γ蛋白的阳性表达率与TNM分期有关,分期越晚阳性率越高(P<0.01)。PPAR-γ蛋白表达与患者预后无关(χ2=1.843,P=0.175)。PTEN蛋白在肿瘤直径>5cm组(19.0%)、门静脉癌栓组(0%)、侵及周围脏器或淋巴结转移组(0%)的表达率显着降低(P<0.05);PTEN蛋白的表达率与TNM分期有关,分期越晚表达率越低(P<0.01)。PTEN蛋白高表达组生存期明显长于低表达组(χ2=13.764,P=0.000)。Akt及pAkt蛋白在肿瘤直径>5cm组、侵及周围脏器或淋巴结转移组的表达率显着升高(P<0.05);Akt及pAkt蛋白的表达率与TNM分期有关,分期越晚表达率越高(P<0.01)。Akt及pAkt蛋白低表达组生存期明显长于高表达组(P=0.000)。Skp2蛋白在肿瘤直径>5cm组(66.7%)、门静脉癌栓组(100%)的表达率显着升高(P<0.01);Skp2蛋白的表达率与TNM分期有关,分期越晚表达率越高(P<0.01)。Skp2蛋白低表达组生存期明显长于高表达组(χ2=25.470,P=0.000)。P27~(kip1)蛋白在肿瘤直径>5cm组(19.0%)、单发肿瘤组(28.8%)的阳性表达率显着降低(P<0.05);P27~(kip1)蛋白的阳性表达率与TNM分期有关,分期越晚阳性表达率越低(P<0.01)。P27~(kip1)蛋白表达与患者预后无关(χ2=2.830,P=0.093)。统计学相关分析显示:在肝癌组织中,PPAR-γ蛋白与PTEN、Skp2、pAkt及P27~(kip1)蛋白表达无相关性(P>0.05);PTEN与Akt蛋白的表达呈显着负相关(r=-0.385,P=0.000),与pAkt蛋白的表达呈显着负相关(r=-0.334,P=0.003),与Skp2蛋白的表达呈显着负相关(r=-0.294,P=0.009),与P27~(kip1)蛋白的表达呈显着正相关(r=0.413,P=0.000);Skp2与pAkt蛋白的表达呈显着正相关(r=0. 356,P=0.001),与P27~(kip1)蛋白的表达呈显着负相关(r=-0.313,P=0.005)。2研究Wortmannin对人肝癌细胞株HepG2的影响,探讨其可能的作用机制MTT结果显示,Wortmannin可显着抑制HepG2细胞的增殖,且呈时间和剂量依赖关系,最大抑制率可达(74.93±3.25)%;FCM检测结果显示,Wortmannin可诱导HepG2细胞的凋亡,使HepG2细胞的G0/G1期比例显着升高(P<0.05),S期比例显着降低(P<0.05),呈时间和剂量依赖关系;随着药物浓度的增加和作用时间的延长,RT-PCR检测发现,Skp2 mRNA表达量逐渐减少(P<0.05),而PPAR-γ、PTEN及P27~(kip1)mRNA表达量无明显变化;Western blot检测发现,P27~(kip1)蛋白的表达量逐渐增加,pAkt和Skp2蛋白的表达量逐渐减少(P<0.05),PPAR-γ、PTEN和Akt蛋白的表达量无明显变化。3研究罗格列酮和GW9662对人肝癌细胞株HepG2细胞的影响,探讨其可能的作用机制MTT结果显示,罗格列酮可显着抑制HepG2细胞的增殖,且呈时间和剂量依赖关系;FCM检测结果显示,罗格列酮可诱导HepG2细胞的凋亡,使HepG2细胞的G0/G1期比例显着升高(P<0.05),S期比例显着降低(P<0.05),呈时间和剂量依赖关系;随着药物浓度的增加和作用时间的延长,RT-PCR检测发现,PPAR-γ及PTEN mRNA表达量逐渐增加,Skp2 mRNA表达量逐渐减少(P<0.05),而P27~(kip1)mRNA表达量无明显变化;Western blot检测发现,PPAR-γ、PTEN和P27~(kip1)蛋白的表达量逐渐增加,pAkt和Skp2蛋白的表达量逐渐减少(P<0.05),Akt蛋白的表达量无明显变化。联合GW9662作用于HepG2细胞后,罗格列酮抑制细胞增殖、诱导凋亡及细胞周期阻滞的作用明显减弱,其上调PTEN和P27~(kip1),下调pAkt和Skp2的作用同时减弱。4罗格列酮对人肝癌细胞裸鼠移植瘤生长的影响成功构建人肝癌裸鼠移植瘤模型,成瘤率达100%。实验结束时,实验组移植瘤的体积及重量均明显小于对照组(P<0.05),体积抑瘤率为52.13%,重量抑瘤率为65.63%;光镜下可见实验组移植瘤内大片细胞坏死,细胞排列松散,结缔组织增生明显,伴纤维化改变,局部可见淋巴细胞浸润;与对照组相比,实验组移植瘤细胞凋亡率明显升高(19.42±2.70)%,G0/G1期细胞比例显着增高,S期细胞比例明显降低(P<0.05);实验组pAkt及Skp2蛋白表达量明显低于对照组,P27~(kip1)蛋白的表达量则明显升高(P<0.05),PPAR-γ及PTEN蛋白的表达量均高于对照组,但无统计学意义(P>0.05)。结论:1首次联合检测PPAR-γ、PTEN、Akt、pAkt、Skp2及P27~(kip1)蛋白在肝癌中的表达,证实PPAR-γ、Akt、pAkt及Skp2蛋白在肝癌组织中的表达水平明显升高,PTEN及P27~(kip1)蛋白的表达水平明显降低,此变化与肝癌的发生、发展及侵袭、转移等恶性生物学行为密切相关。PTEN、Akt、pAkt和Skp2可作为提示患者预后的指标。2 Wortmannin可抑制HepG2细胞的增殖,诱导凋亡并引发G0/G1期阻滞。阻断PI3K/Akt信号通路可下调Skp2、上调P27~(kip1)蛋白的表达,PI3K/Akt信号通路可能通过Skp2对P27~(kip1)蛋白的降解进行调控,可能存在PI3K/Akt-Skp2-P27~(kip1)信号通路。3罗格列酮可抑制HepG2细胞的增殖,诱导细胞凋亡并引发G0/G1期阻滞。罗格列酮可上调PTEN的表达,抑制PI3K/Akt信号通路,下调Skp2并促进P27~(kip1)的表达。提示罗格列酮的抑瘤作用可能通过PTEN-PI3K/Akt-Skp2-P27~(kip1)信号转导通路实现。联合PPAR-γ抑制剂GW9662后,罗格列酮的作用明显减弱,证实罗格列酮是通过激活PPAR-γ发挥作用的。4罗格列酮能显着抑制人肝癌裸鼠移植瘤的生长,且无明显的毒副作用,其体内抑瘤作用及机制与体外相似。PPAR-γ激动剂有可能为肿瘤临床治疗提供新的策略。
莫莉[9]2007年在《Cdk3在原发性肝细胞癌中的表达及作用机制》文中认为目的：探讨Cdk3在肝细胞癌中的表达及其致癌的分子机制，为肝癌的早期诊断提供实验和理论依据。方法：1．用免疫组化检测9例原发性肝细胞癌(HCC)、7例肝硬化、10例肝炎中的Cdk3蛋白表达，用原位杂交的方法检测4例原发性肝细胞性肝癌(HCC)、6例肝硬化、5例肝炎中的Cdk3 mRNA的表达，探讨Cdk3在HCC癌变过程中的规律；2．用软琼脂细胞集落形成实验观察Cdk3过表达促进细胞恶性转化的效应；3．用双色免疫荧光实验分析Cdk3与c-Jun在细胞中的共定位，分析Cdk3参与癌变可能的分子机制；4．用荧光素酶报告基因方法分析Cdk3过表达对AP-1活性的影响及Cdk3参与癌变可能的分子机制。结果：1．Cdk3蛋白在HCC中的表达为核-浆型，以浆为主。相对于肝炎和肝硬化组织，Cdk3蛋白在HCC中表达显着升高(P＜0.05)；Cdk3 mRNA在肝炎、肝硬化和HCC均有表达，且为核-浆型，以浆为主，但无显着性差异(P＞0.05)；2．利用稳定表达细胞系Cdk3-JB6、Cdk3-DN-JB6分析Cdk3对细胞停泊非依赖性增长的影响，软琼脂集落形成实验结果显示，在EGF的刺激下Cdk3稳定表达的JB6细胞形成集落数显着高于Cdk-DN(P＜0.05)及没有转染Cdk3的JB6细胞(P＜0.05)；3．Cdk3与c-Jun共定位于JB6细胞核；4．转染Cdk3的JB6细胞中AP-1荧光酶活性与没有转染Cdk3或转染Cdk3-DN的细胞中AP-1相对活性相比明显升高(P＜0.05)。结论：1．Cdk3蛋白在肝细胞癌癌变过程中表达逐步增强，这提示Cdk3在HCC癌变过程中发挥了重要作用；2．Cdk3过表达可促进细胞恶性转化；3．Cdk3与c-Jun共定位于细胞核；4．Cdk3通过上调AP-1的活性促使细胞恶性转化。
刘安文[10]2009年在《MAP4K4在原发性肝细胞癌中的表达及生物学意义》文中研究说明原发性肝癌(Primary hepatic carcinoma,PHC)绝大多数是肝细胞癌(HCC),素有“癌中之王”之称,现有的治疗手段效果均不佳,因此越来越多的学者致力于肝细胞癌基因靶向治疗的研究。肝细胞癌的发生是多因素、多途径、多步骤长期作用的结果,包括外环境致癌因素(病毒、寄生虫、细菌的感染、黄曲霉毒素的摄入、水源污染以及吸烟、饮酒)和自身遗传因素(癌基因的激活和抑癌基因的失活)。目前已经发现与人类肝细胞癌的发生有关的基因有:N-ras、c- fos、p53、C- myc、IGF-Ⅱ、IGF-ⅡR、p16、p21、DCC、nm- 23、c- erB-b- 2、TGF-α、CSF- IR、raf等。癌基因和抑癌基因的突变是肝细胞癌发生的分子基础,肝细胞的癌变是一个多基因参与多阶段的过程。丝裂原激活蛋白激酶激酶激酶激酶4(MAP4K4)系丝/苏氨酸激酶亚家族STE20中的一员,位于染色体2q11.2,含有33个外显子,编码区包括九个可供选择的剪接位点。人MAP4K4最早克隆于巨噬细胞cDNA库,不同来源的组织可分离出不同的由cDNA编码的MAP4K4亚型。MAP4K4属于丝裂原激活蛋白激酶(MAPK)信号传导通路的一个上游激活因子,MAPK是一组可以被多种细胞外信号(包括生长因子,激素,紫外线辐射,DNA损伤剂,炎性细胞因子和环境应激等)激活的丝/苏氨酸激酶。MAPK信号转导通路非常保守,自膜受体到MAPK激酶激酶(MAPKKK)再到MAPK激酶(MAPKK)然后到MAPK,在细胞信号转导通路中MAPK处于细胞质部分的终末位置,活化后可以转到核内作用靶点,调节基因的表达。这种激活模型存在于酵母至哺乳类动物。它参与细胞的多种生物学行为,包括细胞凋亡,分化和增殖、细胞周期调控,细胞生存的维持以及细胞恶性转化等。STE20家族是MAPKKK的上游激酶,哺乳类动物STE20/丝裂原蛋白激酶激酶激酶激酶(MAP4K)家族由其催化区相关的28种丝氨酸/苏氨酸激酶组成。这些激酶可分为两种结构类别,P21活性蛋白激酶(PAKs)和生发中心激酶(GCKs)。GCK激酶缺乏PAKs激酶中调节Cdc42/Rac的作用区,而代之以N-末端激酶区和不同长度的C-末端延伸。C-末端是一个枸椽同源区(CNH),称为枸椽rho相互作用激酶(CRIK),该区域对于激酶活性的调节起着重要作用。GCK激酶在激酶区域外显示出低度同源性,并分为九个亚家族。MAP4K4是GCK IV组中的一个成员,它对细胞的作用包括调节细胞的运动性,细胞骨架重排以及细胞增殖等。研究发现MAP4K4在多种肿瘤中有高表达并证明了它在加速肿瘤细胞转化,促进细胞侵袭,降低细胞黏附性方面起着一定的作用。近期又有研究提出MAP4K4与卵巢癌、乳腺癌、前列腺癌和恶性黑色素瘤的侵袭和转移有着密切的关系,通过siRNA敲减这些细胞系的MAP4K4基因可抑制它们的侵袭和转移。最新研究报道MAP4K4在胰腺癌中也有高表达,并与其不良预后有关。以上提示MAP4K4信号通路很可能与肿瘤的发生,发展有着密切的关系。而目前对于MAP4K4在肝细胞癌中的研究尚未见报道。我国为肝细胞癌高发国家,大多数肝细胞癌的发生与乙肝病毒感染密切相关,HBV是我国肝细胞癌发生的最直接危险因素。本实验首先应用cDNA芯片对1例HBV相关肝细胞癌进行检测,发现MAP4K4基因在肝细胞癌组织较癌旁组织显着高表达,受此启发,本课题拟探讨MAP4K4在肝细胞癌的生物学活性中是否也发挥一定的作用。据此,本课题的研究思路为:首先,继续采用cDNA芯片技术对5例HBV相关肝细胞癌基因表达谱进行初步研究,对比癌和癌旁组织的差异基因表达,明确MAP4K4基因在肝细胞癌组织中确实较癌旁组织显着高表达。然后,采用分子生物学方法和组织芯片技术进一步从转录和翻译水平检测肝癌细胞株及肝细胞癌组织中MAP4K4的表达情况,验证基因芯片的结果,并分析不同临床病理参数中MAP4K4蛋白表达水平的差异,以初步证实MAP4K4在肝细胞癌发展中的临床意义。最后,再通过RNAi技术研究MAP4K4基因敲减对肝癌细胞生物学活性的影响,并通过基因芯片技术初步探讨其生物学作用产生的可能机制。第一部分肝细胞癌基因表达谱的初步研究目的:应用含20228个基因的人cDNA芯片研究5例HBV相关肝细胞癌及配对癌旁肝组织的基因表达差异。方法:随机选择HBV相关肝细胞癌及其癌旁肝组织样本5例分别抽提标本的总RNA,反转录为cDNA与芯片进行杂交,对比差异表达的基因。结果:HBV相关肝细胞癌组织相对于癌旁组织明显上调表达基因有52个(>3倍),其中上调大于5倍的基因为ASPH,FACL4,LAPTM4B,PEX11B,MAP4K4,SQSTM1,CCT3,CPD,CKS1B,HMGA1,ENO1;明显下调表达的基因有37个,下调大于10倍的基因为CYP2E1,MT2A,MT1X,CPS1,EXTL1,FCN3,CYP2A7,NOLA2,CYP3A4,CYP2B6,CYP4A11,HSD11B1。结论:通过cDNA芯片技术,发现肝细胞癌广泛存在的异常表达基因,其中MAP4K4基因明显上调,综合考虑它作为MAPK信号途径的一个上游因子可能参与了细胞分化、增殖、凋亡及恶性转化等生物学功能,因此进一步对MAP4K4基因进行分析将可能有助于了解它在肝细胞癌中的生物学作用,为肝细胞癌的基因靶向治疗开辟一条新途径。第二部分MAP4K4在肝癌细胞株及肝细胞癌组织中的表达目的:从转录和翻译水平检测肝癌细胞株及肝细胞癌组织中MAP4K4的表达情况,以验证基因芯片结果,并分析不同临床病理参数中MAP4K4蛋白表达水平的差异,初步证实MAP4K4在肝细胞癌发展中的临床意义。方法:选取20例新鲜肝细胞癌组织和配对癌旁肝组织标本及四种肝癌细胞(Hep3B,HepG2,SMMC7721,Huh-7)进行RT-PCR,qRT-PCR和Western-blot分别检测MAP4K4 mRNA和蛋白水平的表达;对400例肝细胞癌蜡块标本构建肝细胞癌组织芯片,采用免疫组织化学技术检测MAP4K4蛋白在含400例配对肝细胞癌及癌旁组织的表达活性,分析不同临床病理参数中MAP4K4蛋白表达水平的差异。结果:1.肝细胞癌组织中MAP4K4 mRNA的表达在癌旁肝组织,MAP4K4 mRNA表达为0.001339～0.018747(平均0.007900),而大部分癌组织表达高水平MAP4K4 mRNA,0.007367～0.080935(平均0.029500);与配对癌旁肝组织相比,肝细胞癌组织MAP4K4 mRNA上调1.062～28.520倍(平均6.852倍)。配对t-检验证实肝细胞癌组织和癌旁肝组织差异有显着性(P < 0.001)。2.肝癌细胞株中MAP4K4 mRNA的表达经RT-PCR检测,MAP4K4 mRNA在各细胞株的表达为:HepG2> Hep3B> Huh-7 > SMMC7721;qRT-PCR检测MAP4K4 mRNA在HepG2、Hep3B、Huh-7、SMMC7721四种肝癌细胞株中相对表达量依次为(0.016008±0.002358)、(0.015629±0.001389)、(0.011674±0.001456)、(0.004895±0.000947),结果得到qRT-PCR检测证实。3.肝癌细胞株MAP4K4蛋白表达经Western-blot检测,MAP4K4蛋白在四种肝癌细胞株中均有表达,在HepG2细胞中表达最高,其次是Hep3B细胞,而在SMMC7721中表达最低。4.MAP4K4在肝细胞癌组织中的定位和表达在正常肝、肝炎和肝硬化组织的肝细胞MAP4K4呈一致阴性或弱阳性表达,周围结缔组织、血管和胆管无MAP4K4阳性着色,Kuffer细胞和淋巴细胞生发中心可见阳性染色,与相应的癌旁肝组织相比,异型增生结节的肝细胞MAP4K4的表达明显强于正常肝、肝炎和肝硬化组织的肝细胞。肝细胞癌组织MAP4K4表达显着增强。肝细胞癌组织MAP4K4呈异质性表达,其中过度表达194例(48.5%),灶性阳性或阴性206例(51.5 %)。HBsAg阳性患者MAP4K4阳性率51.5%(157/305)显着高于阴性的38.8% (37/95)(P = 0.033);肿瘤直径≤2cm的MAP4K4阳性率31.6%(18/57)显着低于肿瘤直径> 2cm的51.3%(176/343) (P = 0.006);MAP4K4在不同组织学分级中的阳性率差异有显着性(P<0.001);肝内转移病例的MAP4K4阳性率55.5%(152/274)显着高于未转移者的33.3%(42/126)(P = 0.002)。MAP4K4表达在患者年龄、血清甲胎蛋白浓度、肝硬化、包膜浸润方面差异无显着性。结论:MAP4K4在肝细胞癌中普遍高表达,并且其表达水平与HBV感染状态,肿瘤大小、组织学分级及转移情况可能有一定关系。第叁部分MAP4K4对肝癌细胞生物学功能的影响目的:检测MAP4K4基因敲减后肝癌细胞生物学活性(细胞增殖、细胞克隆形成、细胞周期、细胞凋亡)的改变并初步探讨其作用机制。方法:检测HepG2、Hep3B、Huh7、SMMC-7721肝癌细胞株中MAP4K4蛋白表达,选择表达活性最强者进行siRNA实验。设计一个空载体质粒转染组及叁对靶向MAP4K4的特异性siRNA核苷酸序列质粒转染组(0—HepG2-pGCSil-U6,1—pSilMAP4K4-1,2—pSilMAP4K4-2,3—pSilMAP4K4-3),用Lipofectamine 2000法分别转染到选取的肝癌细胞,qRT-PCR和Western-blot方法检测干扰效率,并对转染后肝癌细胞进行WST-8细胞增殖实验,平板克隆形成实验,PI染色法细胞周期检测,Annexin V法细胞凋亡检测,然后,选择TOLL样受体信号途径相关芯片对干扰效果最好转染组及空载体转染组细胞进行基因检测,以进一步探究MAP4K4基因在肝癌细胞中可能的作用机制。结果:依据Western-blot检测四种肝癌细胞株中MAP4K4蛋白表达情况,我们选择其中表达该蛋白最高的HepG2肝癌细胞株作为MAP4K4-siRNA的研究靶标。1.qRT-PCR和Western-blot检测干扰效率转染干扰片段1,2,3后与对照组相比,MAP4K4 mRNA抑制率分别为68.7%,25.9%和53.7%;MAP4K4蛋白的抑制率分别为:61.4%,27.8%和45.8%。2.细胞生长形态改变MAP4K4 RNA干扰后,对数生长期的转染组细胞数目减少,体积变大,贴壁性增强,较对照组比较,圆形M期细胞比例减少。3. WST-8细胞增殖实验结果pSilMAP4K4-1、pSilMAP4K4-3组,细胞增殖速度明显减慢( p<0.01),而转染pSilMAP4K4-2组与对照组相比差异无显着性(p>0.05)。4.平板克隆实验结果各转染组细胞克隆形成能力的检测结果:HepG2-pGCSil-U6 (56.83±8.51%)、pSilMAP4K4-1组(13.75±4.26%)、pSilMAP4K4-2组(50.71±7.47%)、pSilMAP4K4-3组(28.11±6.36%)。pSilMAP4K4-1和pSilMAP4K4-3组细胞的平板克隆形成率明显低于对照组(p<0.01),而pSilMAP4K4-2组与对照组间的差异无显着性(p>0.05)。5.细胞周期实验结果与对照组比较, pSilMAP4K4-1和pSilMAP4K4-3组均出现S期阻滞(p<0.01),M/G1期细胞比例减少(p<0.01),S、G2期细胞比例增多(P<0.05)。而pSilMAP4K4-2组与对照组相比差异无显着性(p>0.05)。6.细胞凋亡检测结果经无血清诱导,与对照组比较,pSilMAP4K4-1、pSilMAP4K4-3组的HepG2细胞凋亡比例增多(p<0.05),而pSilMAP4K4-2组与对照组比较差异无显着性(p>0.05)。7.基因芯片检测结果干扰前后肝癌细胞样本的基因芯片检测结果显示MAP4K4基因敲减后,有一定数目与其相关的基因的表达有明显改变(上调2倍以上或下调1/2以上),参照TOLL样信号传导途径通路图进行分析,我们发现MAP4K4基因在肝细胞癌中可能是通过NF-kB及JNK信号传导途径发挥作用的。结论:MAP4K4基因敲减可以阻滞细胞周期的进程,抑制肝癌细胞的恶性增殖,其机制可能是通过NF-kB信号传导途径、JNK信号传导途径发挥作用。
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