郑刚[1]2004年在《MPP～+对PC12细胞体外增殖的抑制作用及其机制探讨》文中进行了进一步梳理帕金森病(PD)发生的根本原因在于大脑黑质-纹状体系统多巴胺能神经细胞退行性病变，引起多巴胺能神经元大量丧失以及多巴胺(DA)的耗竭，从而导致锥体外系功能失调。1-甲基-4-苯基-1，2，3，6-四氢吡啶(MPTP)是一种神经毒素，经大量研究证实可以成功地诱导帕金森病动物模型，提示MPTP可能与PD等神经退行性疾病的发生有关。MPTP本身对细胞并无毒性，只有被线粒体中的单胺氧化酶B催化生成它的吡啶类代谢产物MPP~+之后，才对多巴胺能神经细胞产生毒性作用。近年来研究表明凋亡可能是神经退行性病变中细胞死亡的主要方式，可能在环境毒物诱导帕金森病发生的机制中起到重要作用。 丝裂原活化蛋白激酶(MAPKs)信号转导通路是生物信号从细胞表面传导到细胞核内部的重要传递者，对MAPKs的调节涉及细胞生长、发育、分裂、死亡以及细胞间的功能同步化等多种细胞生理过程。其中细胞外信号调节蛋白激酶(ERK)通路主要参与细胞增殖与分化的调控，而p38及c-Jun氨基末端激酶(JNK／SAPK)通路的激活参与了不同刺激所致凋亡的启动。另外，并行的MAPKs信号通路之间可以相互协调、相互调控。 近年来，有关MPP~+与多巴胺能神经细胞生长、增殖以及凋亡之间关系的研究受到了广泛关注，许多学者试图证明细胞凋亡及MAPKs通路在MPP~+诱导帕金森综合征的机制中的贡献。初步的研究发现较低剂第四军医大学硕士学位论文量的MPP+短时间作用于多巴胺能神经细胞可能诱导其磷酸化ERK水平增高，但也有降低的报道。另外，MPP+可以诱导细胞磷酸化刀NK表达升高，并且casPases激活等现象提供了细胞发生凋亡的证据。由于实验条件不同，研究结果不尽一致。一般认为低浓度MPP+短时间作用可诱导磷酸化ERK的表达增高，对细胞的增殖、分化产生一定的影响;而较高剂量、较长时间的作用则会产生毒性。 基于以往的实验结果，我们选择多巴胺能的大鼠嗜铬细胞瘤细胞PC12为实验对象，研究MPP+对多巴胺能神经细胞的毒性作用。筛选MPP+对神经细胞增殖抑制作用的剂量一效应及时间一效应关系以及对细胞凋亡的影响，探讨在此过程中细胞MAPKs信号转导通路蛋白活化表达的特点及其相互之间的关系。旨在寻找MPTP等PD相关环境危险因子对大脑黑质一纹状体系统损伤的分子机制，以期揭示PD等神经退行性疾病的病因学基础，并为制定其相关环境危险因子的暴露剂量、临床预防及治疗提供一定的实验依据。方法 取对数生长期PC12细胞，使用含有100一700林mo比MPP+的即Ml1640培养液，分别作用1一7d后，用MTT法测定细胞生长活力并绘制细胞生长曲线:细胞计数法测定MPP+对细胞生长增殖的抑制率，筛选MPP+的细胞毒性剂量范围;采用透射电镜、流式细胞仪及TUNEL法观察凋亡细胞的形态和数量:Westem blot法检测细胞ERKI/2及p38蛋白的活化表达情况;TUNEL法观察阻断ERK及p38通路对MPP+所诱导细胞凋亡的影响。结果 细胞生长抑制实验中，MTT法和细胞计数法检测结果一致显示MpP+对Pc12细胞的生长、增殖可以产生呈剂量一依赖性及时间一依赖性的抑制作用。其中300一500林moFL MPP+作用4d对细胞的抑制率达40%心60%(P<0 .01)，细胞生长曲线也相应发生改变。提示MPP+对多巴胺能神经细胞PC12可以产生显着的增殖抑制作用。 透射电镜观察发现MPP+可诱导PC12细胞发生凋亡的超微结构改变;流式细胞仪检测显示MPP+可以使细胞凋亡率比对照组显着增高萦四军医大学月可d卜学位论文(P<0.01):TUNEL检测结果表明Mpp+作用后TUNEL染色阳性细胞显着增多(P<0.01)。上述结果一致提示MPP+对PC12细胞生长、增殖的抑制作用可能是通过诱导细胞凋亡实现的。 从阳stem blot结果显示MPP+可以使PC12细胞磷酸化ERKI/2的表达下降，而使磷酸化p38的表达量增高，并均呈剂量一效应和时间一效应关系(p<0.01)。100、300、500林mo比Mpp+作用4d后磷酸化 ERKI/2水平分别为对照组的35.4%、27.6%和18.4%;300林mo讥MpP+作用1、2、4、6d时，ERKI/2磷酸化水平分别降低至对照组的47.9%、37.1%、28.5%和10.3%;使用ERK通路特异性阻断剂PD98059可以抑制MPP+对磷酸化ERKI/2表达的下调，而且TUNEL染色阳性细胞数也显着减少(P<0.01)，表明MPP+通过抑制MEKI/2的磷酸化而下调其下游E双l/2的磷酸化水平。100、300、500林mol/L MPP+作用4d后，p38磷酸化水平比对照组分别增加1.7、4.3和6.7倍:300娜ollLMpp+作用l、2、4、6d时，p38磷酸化水平比对照组分别增加1 .1、2.5、4.7和7.4倍;使用p38通路特异性阻断剂sB203580可以抑制MPP+对p38磷酸化的上调，TtJNEL染色阳性细胞数也显着减少伊<0.01)，表明MpP+通过增加磷酸化MEK3/6的表达而上调其下游p38的磷酸化水平，从而诱导细胞凋亡。上述实验结果提示MPP+引起的细胞磷酸化ERKI/2水平的降低和磷酸化p38水平的增高可能是MPP+诱导PC12细胞生长、增殖抑制和凋亡的重要机制。结论 MpP+可以显着地抑制PclZ细胞的生长和增殖。诱导凋亡可能是MPP+的神经毒作用的重要机制之一。其分子机制可能是通过州叭卫Ks信号转导通路的协调反应实现的。随着MPP+作用浓度的增高、作用时?
郑刚, 骆文静, 张雪平, 蔡同建, 孟姗姗[2]2009年在《MPP~+对PC12细胞增殖及外信号调节激酶影响》文中认为目的研究1-甲基-4苯基-吡啶离子(MPP+)对大鼠嗜铬细胞瘤PC12细胞增殖的抑制作用及其分子机制。方法PC12细胞体外培养,分别以100,300,500μmol/L MPP+进行染毒。四甲基偶氮噻唑蓝法(MTT)观察MPP+对细胞的抑制作用;免疫印迹法检测细胞ERK1/2表达及磷酸化水平。结果不同剂量以及不同作用时间的MPP+对PC12细胞增殖有明显的抑制作用,抑制率为18.86%~58.06%。MPP+可以抑制细胞外调节信号激酶(ERK)的磷酸化水平,其中300μmol/L MPP+染毒3 d时,ERK磷酸化水平约为对照组的4.7%。ERK通路阻断剂PD98059与300μmol/L MPP+共同作用时,对细胞增殖的抑制率增高至78.9%。结论MPP+可以明显抑制PC12细胞的增殖,降低ERK的磷酸化水平可能是其重要分子机制之一。
颜玉文[3]2014年在《Cytochalasin H对MPP~+诱导的PC12细胞凋亡的保护作用及其机制研究》文中研究说明内生真菌(Endophytic fungi)是指其在生活史的某一段时期生活在植物组织内,对植物组织没有引起明显病害症状的真菌。青梅属(Vatica genus)植物富含白藜芦醇(Resveratrol)化合物,有报道称它能阻止氧化应激引起的PC12细胞凋亡。基于内共生理论,青梅属植物青皮内生菌极有可能产生与白藜芦醇相同或相似的活性成分。我们对青皮内生菌(Phomopsi sp.)固体发酵产生的化合物进行初步筛选,结果发现细胞松弛素H(Cytochalasin H, CytH)对损伤的PC12细胞可能有潜在的保护作用。目前尚未发现对CytH该方面活性的研究报道,因此对其作用以及作用机制研究是非常必要和有意义的。帕金森病(P arkinson's disease, PD)是一种神经系统退行性疾病,其发病原因与黑质多巴胺(Dopamine, DA)能神经元渐进性缺失有关,而凋亡是其神经元丢失的主要形式。该病的主要发病机制之一为氧化应激。CytH与上述白藜芦醇均来源于青梅属植物,它是否也能产生与后者相似的抗氧化应激作用从而对PD产生有益的影响呢?为此,本实验应用甲基苯基吡啶离子(1-methyl-4-phenylpyridinium, MPP+)制备PD体外细胞模型,观察了CytH对其损伤和凋亡的影响,并对其作用机制进行了初步研究。主要结果如下：1. Cytochalasin H对MPP+诱导的PC12细胞损伤的影响方法：MTT法检测PC12细胞存活率,比色法测定LDH释放率。分组及加药：(1)对照组：0.01%DMSO溶剂；(2)模型组：500μmol/LMPP+;(3)阳性药组：100μmol/L司来吉兰；(4)受试药物组：不同浓度CytH。受试药和阳性药采用3种加药方法：①预处理：先向PC12细胞中加入药物培养4h后再加入Mpp+；②后干预：Mpp+作用4h后再加药；③同时干预：药物与MPP+同时加入。各组Mpp+作用时间均持续48h。结果：(1) CytH化合物细胞毒性：与对照组比较,0.00125～2μmol/L CytH组细胞存活率均无显着性降低。在0.05,0.1,0.2μmol/L时,CytH反使PC12细胞存活率增加,分别为118.22%±4.29%,119.00%+7,33%,118.48%±6.85%,与对照组相比,均具有显着性差异(P<0.01)。表明CytH化合物不仅没有细胞毒性,反而能够促进神经细胞增殖。(2)CytH化合物预处理对MPP+诱导的PC12细胞存活率和LDH的影响：CytH预处理在0.001～0.01μmol/L范围内细胞存活率呈浓度依赖性上升(r=0.939、P<0.01), CytH浓度为0.01μmol/L时存活率达到103.7%±0.3%(P<0.001)。CytH (0.0025～0.01μmol/L)预处理LDH释放率呈浓度依赖性下降(r=-0.946、P<0.01),与模型组比较差异有显着性(P<0.01,0.001)。(3)CytH化合物后干预对MPP+诱导的PC12细胞存活率和LDH的影响：CytH后干预在0.01～0.15μmol/L范围内细胞存活率呈浓度依赖性上升(r=0.890、P<0.01), CytH浓度为0.15μmol/L时存活率达到104.3%±2.4%(P<0.001)。CytH (0.01～0.2μnmol/L)后干预LDH释放率呈浓度依赖性下降(r=-0.858、P<0.01),与模型组比较差异有显着性(P<0.01,0.001)。(4) CytH化合物同时干预对MPP十诱导的PC12细胞存活率和LDH的影响：CytH同时干预在0.05～0.2μmol/L范围内细胞存活率呈浓度依赖性上升(r=0.885、P<0.01), CytH浓度为0.2μmol/L时存活率达到96.60%±4.6%(P<0.001)。CytH (0.05～0.2μmol/L)同时干预LDH释放率呈浓度依赖性下降(r=-0.913、P<0.01),与模型组比较差异有显着性(P<0.01,0.001)。结论：CytH化合物对Mpp+诱导的PC12细胞损伤有一定的预防、治疗和修复作用。2.Cytochalasin H对MPP+诱导的PC12细胞凋亡的保护作用方法：分组同上,采用同时干预法加药。应用透射电镜观察细胞超微结构,AO/EB荧光染色观察细胞形态,流式细胞仪测定细胞凋亡比率。结果：(1)透射电镜下细胞超微结构：电镜结果显示,Mpp+作用后可见细胞发生凋亡的形态学改变：细胞表面的微绒毛减少或者消失；细胞核膜皱缩,细胞核体积缩小；染色质致密并凝聚成块状聚于细胞核周边；细胞质中可见线粒体明显肿胀,甚至产生空泡状改变。经过0.05,0.1,0.2μmol/L CytH干预,与模型组相比,细胞的超微结构趋于正常,细胞核膜清晰,核内染色质相对正常,细胞质中可见正常完整的细胞器,尤其高浓度组与正常组较为接近。结果表明CytH各剂量组能够部分改善PC12细胞的变化,减少细胞器的丢失。提示CytH能改善Mpp+诱导的PC12细胞超微结构的变化。(2) AO/EB荧光双染法观察细胞凋亡：正常组细胞大多呈长梭形,核质体被均匀染成绿色,部分细胞荧光强度变暗；模型组细胞大多呈椭圆形,核质体被均匀染成橙色或亮黄色；阳性药物组以及CytH各剂量组(0.05,0.1,0.2μmol/L)均能不同程度改善这一现象,其中高剂量组作用最明显,效果接近于司来吉兰阳性药物组。结果表明CytH对MPP+诱导的PC12细胞凋亡有一定的保护作用。(3)流式细胞仪分析PC12细胞凋亡比率：模型组早期凋亡细胞较对照组显着升高(P<0.05),晚期凋亡或坏死细胞(P<0.01)及总凋亡率(P<0.001)也呈显着增加；CytH各剂量组(0.05,0.1,0.2μmol/L)与模型组相比,活细胞数明显增多(P<0.01,0.001),总凋亡率显着下降(P<0.001),且呈剂量依赖性(r=-0.754、P<0.05)。结果表明CytH能降低MPP+诱导的PC12细胞的凋亡率。结论：CytH化合物能够一定程度上抑制MPP+诱导的PC12细胞凋亡。3. Cytochalasin H对MPP+诱导的PC12细胞氧化应激的影响方法：分组同上,采用同时干预法加药。应用流式细胞仪测定细胞内ROS；采用硫代巴比妥酸(TBA)、黄嘌呤氧化酶法和二硫代二硝基苯甲酸法测定细胞中MDA含量和SOD2、GSH-PX酶活力；还原法检测细胞总抗氧化能力(T-AOC)。结果：(1)CytH对细胞内ROS的影响：与对照组(ROS含量比值为1)相比,500Hmol/LMPP+使细胞内ROS含量比值升高至1.91±0.15(P<0.001).0.05,0.1,0.2μmol/L CytH干预后,ROS含量比值下降为1.78±0.23(P>0.05),1.07±0.3(P<0.05),0.91±0.37(P<0.05),100μmol/L司来吉兰组为1.18±0.13(P<0.01)。表明CytH能抑制MPP+升高ROS含量的作用,并呈剂量依赖性(r=-0.780、P<0.05)。(2) CytH对细胞内MDA含量的影响：模型组MDA含量为24.48±3.51nmol/mgprot,与对照组相比呈显着性升高(P<0.01), CytH0.0125、0.025、0.05.0.1、0.2μmol/L组以及司来吉兰组与模型组比较,MDA含量均有显着性下降(P<0.05),其中以CytH0.05μmol/L效果最好,MDA含量仅为3.23±1.42nmol/mgprot。表明CytH能明显抑制MPP+诱导的PC12细胞MDA含量的升高。(3) CytH对细胞内T-AOC、SOD和GSH-PX活性的影响：模型组T-AOC、SOD和GSH-PX活性分别为0.9±1.56U/mgprot (P<0.01),19.49±4.36U/mgprot (P<0.001),507.6±67.3U/mgprot (P<0.001),与对照组比较呈显着性下降。与模型组相比,CytH0.05,0.1、0.2μmol/L叁个剂量组均能显着升高T-AOC活性(P<0.01,P<0.001)；升高SOD活性作用在中剂量和高剂量组有显着性差异(P<0.05、P<0.001)；但升高GSH-PX活性的作用仅在高剂量组有显着性差异(P<0.001)。CytH高剂量组叁种物质的活性分别为：T-AOC10.47±0.75U/mgprot(P<0.001), SOD81.25±3.79U/mgprot(P<0.001), GSH-PX1063.18±53.7U/mgprot (P<0.001)。表明CytH能明显升高PC12细胞中T-AO、SOD和GSH-PX活性。结论：CytH化合物能够提高PC12细胞内T-AOC、SOD和GSH-PX活性,减少MDA含量和ROS的产生,可能通过抗氧化应激作用而抑制Mpp+诱导的PC12细胞凋亡。4. Cytochalasin H对MPP+诱导的PC12细胞凋亡的保护作用的分子机制研究方法：分组同上,采用同时干预法加药。细胞处理后提取蛋白。利用BCA法进行蛋白定量,应用Western blot法测定Bcl-2、caspase3蛋白表达。结果：(1) CytH对Mpp+诱导的PC12细胞中Bcl-2表达的影响：与对照组相比模型组中Bcl-2表达有较大下降,CytH (0.05,0.1,0.2μmol/L)干预后,高剂量组可以抑制Bcl-2表达的下降,司来吉兰组亦有相类似作用。(2) CytH对MPP+诱导的PC12细胞中Caspase-3表达量的影响：Caspase-3受到某些因素的由前体产生有酶活性的片段,此过程为Caspase-3的活化。与对照组相比,模型组中35kD的Caspase-3的活化水平显着增强,CytH (0.05,0.1,0.2μmol/L)干预后Caspase-3与模型组相比活化程度降低,表明Mpp+可以诱导Caspase-3活化,并促发细胞凋亡效应；而CytH可以通过减少Caspase-3的活化来减少PC12细胞的凋亡。结论：CytH可通过上调Bcl-2蛋白表达、抑制Caspase-3的活化而抑制MPP+诱导的PC12细胞凋亡。CytH对Mpp+诱导的PC12细胞凋亡的保护作用的分子机制可能涉及对Bcl-2家族蛋白表达水平的影响及对Caspase蛋白水解酶的活化的调节。
田季雨[4]2004年在《培补肝肾中药治疗帕金森病的机制研究》文中提出帕金森病(Parkinson's disease，PD)是一种常见于中老年的神经系统变性疾病，其发病率在65岁以上人群高达1％。其病理特征是中脑黑质纹状体系统多巴胺(Dopamine，DA)能神经元变性死亡，当DA能神经元死亡超过50％时，导致脑内神经递质DA明显减少，出现静止性震颤、肌僵直和运动迟缓等临床表现。其病因不甚明确，可能与遗传、环境、老龄等因素有关。目前认为自由基生成、氧化反应增强、谷胱甘肽含量降低以及线粒体功能异常、内源性和外源性毒物是可能导致黑质DA能神经细胞变性的原因。该病的内科治疗以左旋多巴制剂为主，疗效较好，但这种制剂的长期应用，会出现明显的疗效减退及较严重的副作用，包括运动症状波动，开关现象等。临床以培补肝肾中药为主治疗PD有较好的疗效，本研究旨在从抗氧化作用和抗黑质细胞凋亡两方面来探讨培补肝肾中药为主治疗PD可能的作用机制。本研究拟通过动物实验研究证实：1．培补肝肾复方对PD小鼠模型黑质组织匀浆活性氧、MDA、GSH、GSH-Px、和SOD等的影响；2．培补肝肾复方及肉苁蓉对PC12细胞活性和细胞凋亡的影响。3．MPP+作用于体外培养的正常SD胎鼠黑质DA能神经元细胞，建立细胞凋亡模型，并观察培补肝肾中药肉苁蓉对DA能神经元的活性和凋亡的影响；实验内容如下： 实验一：目的观察MPTP对PD小鼠模型黑质抗氧化系统的作用及培补肝 第四军医人学硕卜学位论文肾复方对其影响。方法采用MPTP腹腔注射小鼠造成PD模型，并用培补肝肾中药进行治疗，同时设立正常对照组、模型组、治疗组共3组，各组分别为10、20、20只。观察培补肝肾复方对氧化应激的影响。结果模型组活性氧和丙二醛(MDA)分别为403士7 IU .mg一，，10.3士3.2 nmol .mg一，与培补肝肾组(201士34)U .mg一，和(5士2) nmol .mg一，相比较明显降低，统计学差异显着(P(0.05);GSH、GSH一Px、和SOD含量模型组为(4.6士1.3)mg .9一，，(2.4士0.3)nU .9一，，(136士5)nU .9一，，与中药治疗组相比(6.4士2.3)mg .9一，，(3.2士0.3) nU .9一‘和(168士8) nU .mg一，明显增高，统计学差异显着(P<0 .05)。结论培补肝肾中药可能通过增加MPTP诱导的PD模型小鼠的抗氧化能力，清除自由基，而减低自由基对黑质的损伤。实验二:目的探讨培补肝肾复方对MPP‘所致PC12细胞损伤模型的保护作用。方法采用血清药理学的方法，以肾上腺嗜铬细胞瘤克隆化细胞株PC12细胞为材料，制备中药含药血清，利用M尸P+建立经神经生长因子(NG曰诱导前后的PC12细胞的损伤模型，观察给药不同的培补肝肾中药剂量血清对Pc12细胞的不同作用。结果形态学检查发现等效剂量培补肝肾中药复方血清对诱导前后的PC12细胞具有保护作用，可显着提高 PC12细胞的存活数，减低细胞损伤程度。结论培补肝肾复方中药血清可能通过对抗淤P+引起的细胞损伤，对体外培养的PC12细胞具有一定的保护作用。实验叁:目的观察中药肉从蓉含药血清对PC12细胞凋亡的影响。方法采用l一甲基一4一苯基毗陡离子(1一methyl一4一phenylpyridinium，MpP+)建立PC12细胞凋亡模型，应用血清药理学方法，结合光镜荧光染色核形分析、透射电镜、流式细胞仪等检测手段，研究含中药兔血清对PC12细胞凋亡模型的保护作用。结果含等效剂量组中药兔血清(灌胃剂量为肉从蓉生药1.6眺g)、2倍等效剂量组中药兔血清(灌胃剂量为肉从蓉生药3.2叭g)‘处理的PC12细胞经MPP+作用后，凋亡率分别为1 0.2土0.60%，2名士0.21%; 第四军医大学硕士学位论文与空白兔血清组(18.6士0.67%)相比有显着统计学差异(尸<0.05)。结论肉从蓉可能具有拮抗MPP+导致的细胞凋亡作用。实验四:目的建立MPP+诱导的原代培养新生鼠中脑DA能神经细胞凋亡模型，并探讨肉从蓉对中脑DA能神经细胞的保护作用和机制.方法采用血清药理学的方法，肉从蓉含药血清培养DA能神经细胞，观察培补肝肾复方含药血清对MPP+损伤DA能神经元细胞存活时间、存活率的影响、及细胞形态学的变化。经MPP+处理后，用流式细胞仪检测，观察肉从蓉对凋亡细胞的保护作用。结果浓度为加0阿。比的侧田P+使DA能神经细胞发生典型的凋亡，等效剂量培补肝肾中药复方含药血清(灌胃剂量为3眺g)可延长MPP+损伤DA神经细胞的存活时间，提高细胞的存活率。流式细胞仪结果显示等效剂量肉从蓉含药血清(动物灌胃浓度生药1 .6glkg)培养液组DA神经细胞凋亡率为9.80士 0.51%，空白模型组的凋亡率为24.20士1.09%，光镜下计数每视野凋亡阳性细胞数显示:含等效剂t肉从蓉含药血清及2倍等效剂量肉从蓉含药血清培养液组明显低于模型组，经统计学分析差异显着(尸<0.05)。结论肉从蓉药能有效减轻MPP+对体外培养损伤的DA能神经细胞的损害作用，其机制与抗凋亡作用有关。
郑刚, 骆文静, 张雪平, 徐文, 陈景元[5]2004年在《MPP~+对PC12细胞体外生长增殖的毒性作用》文中指出目的 :研究不同剂量 1 甲基 4苯基 吡啶离子(MPP+ )对大鼠嗜铬细胞瘤PC1 2细胞生长增殖的抑制作用 ,探讨MPP+ 多巴胺能神经毒性机制 .方法 :PC1 2细胞体外培养 ,以 1 0 0～ 70 0 μmol/LMPP+ 进行染毒 .MTT法测算MPP+ 作用 1～ 7d对PC1 2细胞的抑制情况并绘制生长曲线 ;取 4d为作用时间 ,细胞计数法观察MPP +对细胞的抑制率 ;透射电镜观察细胞形态学变化 ,流式细胞仪检测细胞凋亡率及细胞周期改变情况 .结果 :细胞生长曲线的改变证实MPP+ 对PC1 2细胞的生长增殖有显着抑制作用 ,而且呈时间 剂量 效应关系 .细胞生长抑制试验结果显示 1 0 0～ 70 0 μmol/LMPP+ 对细胞的抑制率为 0 .2 2～ 0 .6 6 (P <0 .0 1 ) ;透射电镜观察发现MPP+ 可诱导PC1 2细胞发生凋亡的形态学改变 ,同时伴有线粒体肿胀 ;流式细胞仪检测显示 1 0 0 ,30 0 μmol/LMPP+ 作用后 ,细胞总凋亡率比对照组分别增加 0 .5 1和 0 .6 2 (P <0 .0 1 ) .结论 :MPP+ 对PC1 2细胞的生长增殖有明显的抑制作用 ,而诱导细胞凋亡可能是MPP+ 产生多巴胺能神经毒性的重要机制之一 .
佚名[6]2010年在《第十四届中国神经精神药理学学术会议论文摘要》文中研究指明2010年10月15-18日,南京神经损伤001大黄酚聚氰基丙烯酸丁酯纳米囊对脑缺血再灌注小鼠学习记忆障碍的保护作用李超,张丹参,薛贵平(河北北方学院药理学教研室,河北张家口075000)
邓琦[7]2015年在《绞股蓝多糖对MPP~+致PC12细胞损伤的保护作用及其机制研究》文中认为目的:探讨绞股蓝多糖(Gynostemma pentaphyllum polysaccharides,GP)对1-甲基-4-苯基吡啶离子(1-methy14-phenylpyridinium,MPP+)诱导的褐家鼠肾上腺嗜铬细胞瘤PC12细胞损伤的保护作用及其机制,从而为帕金森病预防和治疗提供实验依据。方法:以MPP+损伤PC12细胞为帕金森病细胞模型,将培养的PC12细胞分为3组:空白对照组、MPP+组、GP+MPP+组。对照组给予无血清的RPMI-1640培养基培养;MPP+组给予1mMMPP+处理24h;GP+MPP+组给予50μg/mlGP处理2h,随后给予1m MMPP+处理24h。倒置显微镜下观察细胞形态改变并进行细胞计数和绘制细胞生长曲线,用流式细胞仪分析细胞周期变化,采用四甲基偶氮唑盐(MTT)法检测各组PC12细胞存活率,比色法检测PC12细胞释放的乳酸脱氢酶(Lactatedehydrogenase,LDH)活性,流式细胞术检测细胞凋亡,细胞色素C试剂盒检测细胞色素C水平,荧光定量法检测caspase-3和caspase-9活性,Westernblotting检测Cleaved caspase-3、Bax、Bcl-2和PARP蛋白表达水平。结果:①1mMMPP+可导致PC12细胞数目变少,形态变圆,50μg/mlGP可以使PC12细胞数目增多;②1mMMPP+可导致PC12细胞密度下降,增长缓慢,50μg/mlGP可以使PC12细胞密度上升,增长速度加快;③1mMMPP+可导致PC12细胞细胞增殖指数(PI)降低;50μg/mlGP可以使PC12细胞细胞增殖指数(PI)升高;④1mMMPP+可导致PC12细胞存活率下降;50μg/ml GP可以使PC12细胞存活率增加;⑤MPP+导致PC12细胞显着释放LDH,50μg/ml GP降低PC12细胞释放LDH;⑥1mMMPP+导致细胞凋亡率明显增高,50μg/mlGP使细胞凋亡率显着下降;⑦1mMMPP+孵育细胞24h显着增加caspase-3(P<0.01)和caspase-9活性(P<0.01)及Cleaved caspase-3的表达(P<0.01),GP+MPP+组细胞中caspase-3(P<0.01)和caspase-9(P<0.01)活性较MPP+组显着为低;Cleaved caspase-3的表达(P<0.01)较MPP+组显着为低;⑧与空白对照组比较,1m MMPP+孵育细胞24h降低了Bcl-2/Bax比率(P<0.01),而GP+MPP+组Bcl-2/Bax比率较MPP+组高(P<0.01)。⑨与空白对照组比较,MPP+组PC12细胞中PARP蛋白裂解比例增加,而GP+MPP+组PARP蛋白水平裂解比例降低。结论:GP对MPP+致PC12细胞损伤具有保护作用,其机制是通过调控Bcl-2和Bax蛋白表达和线粒体途径抗MPP+诱导的PC12细胞凋亡。
陈海云[8]2016年在《新型川芎嗪衍生物的设计、合成、神经保护活性及其作用机理研究》文中研究表明研究目的神经退行性疾病是因各种原因引起神经元发生进行性损害,导致结构和功能障碍的一类疾病的总称,包括阿尔茨海默病(Alzheimer’s disease,AD),帕金森病(Parkinson’s disease)、亨廷顿病(Huntington’s disease,HD)、肌萎缩性侧索硬化症(Amyotrophic lateral sclerosis,ALS)等。目前,针对各种神经退行性疾病还没有广谱的治疗策略和制剂;除了用于增加或减少神经递质水平的药物外,现用临床药物往往治标不治本。神经退行性疾病的病理学与氧化应激、线粒体机能障碍、兴奋性毒性、Ca2+内流、免疫炎症、自噬及金属离子等联系紧密。由于其发生受诸多因素影响,因此仅针对单个途径或者单个靶标给药难以得到满意的疗效,当前“一个药物一个靶点”的主流模式无法从根本上治疗此类疾病,今后药物化学的研究必然向“多功能、多靶点”(MFDs、MTDs)的模式转变。在此背景下,本课题采用药物合成化学中的“前药”、“拼合”及“电子等排”等原理,以具有多功能、多靶点效应的天然中草药川芎的主要成分川芎嗪为结构母核,设计并合成了一系列新型川芎嗪衍生物。其中,化合物CT-011及化合物CT-006因具有较好的综合效应,有望成为治疗神经退行性疾病如AD、PD的候选药物分子。研究方法化学合成,波谱解析(ESI-MS、1H NMR、14C NMR及EA),体外非细胞体系自由基清除筛选,体外IAA氧化损伤模型筛选,MTT检测细胞存活率、LDH细胞毒性测试及Hoechst/TUNEL凋亡实验,荧光探针检测各种自由基、线粒体膜电位(?Ψm)及Ca2+内流实验,荧光报告基因实验,Western blot,免疫荧光,实时荧光定量PCR,APP/PS1双转基因小鼠实验,MPTP小鼠实验。研究结果本课题共设计并合成了14个新型川芎嗪衍生物,其中,大部分川芎嗪衍生物都具有良好的自由基清除及细胞保护作用,且呈现出一定的浓度依赖性;而CT-011和CT-006在体外非细胞体系自由基清除及IAA氧化损伤实验中显示出更好的自由基清除能力及神经保护活性,故本课题确定CT-011及CT-006作为目标化合物进行了深入的活性及其作用机理研究。本课题研究发现:1)CT-011对多种因素(IAA/t-BHP/glutamate)诱导的细胞损伤均具有很强的保护活性。这得益于其独特的多功能作用机理:(1)能直接清除和抑制神经细胞内自由基的过量生成;(2)通过激活PI3K-Akt、抑制GSK3β通路保护glutamate诱导的神经细胞损伤;(3)可激活glutamate损伤小脑颗粒细胞PGC1α-Nrf2-ARE信号通路,上调其编码的内源性抗氧化蛋白HO-1的表达。2)CT-006对多种因素(IAA/t-BHP/glutamate/MPP+)诱导的神经细胞损伤均具有很强的保护活性。其独特的多功能作用机理表现为:(1)能直接清除和抑制神经细胞内自由基的过量生成;(2)能抑制Ca2+内流;(3)通过激活PI3K-Akt、抑制GSK3β信号通路保护MPP+诱导的神经细胞损伤;(4)在i PS诱导分化的多巴胺能神经元可激活MEF2D-PGC1α和Nrf2-ARE信号通路。3)CT-006能显着改善APP/PS1小鼠的认知功能及MPTP诱导PD小鼠的运动行为学受损。CT-006在PD小鼠模型能显着提高纹状体内多巴胺及其代谢产物含量,增加黑质区多巴胺神经元数目,CT-006作用明显强于临床药物Rasagline。初步作用机理研究显示CT-006可在小鼠体内能抑制CDK5、激活MEF2D-PGC1α信号通路保护多巴胺神经元。结论激活MEF2-PGC1α及Nrf2-ARE信号通路可能是与多种神经退行性疾病神经保护治疗的新靶点。合成的化合物CT-011及CT-006因具有多功能、多靶点效应,有望成为治疗神经退行性疾病如抗AD、PD多靶点的候选药物分子。
柳春晓[9]2017年在《神经细胞凋亡/变性中Akt/AMPK-mTOR和PP5/PP2A-MAPK信号转导及调控分子机理研究》文中研究指明本研究采用细胞培养、台盼蓝染色、TUNEL和DAPI染色、MDC染色、荧光蛋白标记、RNA干扰、DNA剪切、免疫组化、Western Blot分析等细胞和分子生物学技术及方法;以PC12细胞、小鼠原代神经元以及C57BL小鼠和SD大鼠为实验对象;系统地研究了在体和/或离体PD模型中以及离体镉染毒模型中神经细胞凋亡及自噬异常发生机理;解析了 Akt/AMPK-mTOR和PP5/PP2A-MAPK信号转导在神经细胞凋亡中的作用及其调控分子机理。结果如下:1 动物PD模型大脑SNc和海马回神经元凋亡涉及AMPK激活和Akt失活及mTOR通路抑制MPTP注射诱导C57BL小鼠PD亚急性模型及鱼藤酮灌胃构建SD大鼠PD模型。采用Western Blot检测脑组织Akt,AMPK、mTOR、Caspase-3和PARP等蛋白表达,免疫组化分析脑中SNc及海马回神经元TH+细胞表现,以及DAPI和TUNLE染色评估细胞凋亡。结果显示,MPTP和鱼藤酮诱导PD动物模型的脑组织mTOR信号通路均抑制而Cleaved-caspase-3和Cleaved-PARP显着增加;AMPKα磷酸化升高而Akt磷酸化下降;大脑SNc区的TH+细胞数目显着减少;脑组织神经元凋亡与对照组比较差异显着。提示:PD发生中大脑AMPK激活和Akt失活及mTOR通路抑制,进而导致神经元凋亡/变性。2神经细胞PD模型Ca2+/CaMKⅡ转导与线粒体H202交互作用抑制mTOR通路导致凋亡PC12细胞和原代神经元、或分别感染shRNA 4E-BP1、shRNA CaMKⅡ和shRNA GFP 的 PC12 细胞、或分别感染 Ad-mTOR-wt、Ad-S6K1-ca 和 Ad-GFP的PC12细胞,用不同浓度鱼藤酮(0-1μM)处理24h或者用1μM鱼藤酮处理不同时间(0-24h),或用 BAPTA/AM(30 μM)、EGTA( 100 μM)、KN93 ( 10 μM)、过氧化氢酶(CAT) (350 U/ml)或Mito-TEMPO (10 μM)预处理1 h后暴露1μM鱼藤酮 24 h,或分别用 TTFA (10 μM)和 Antimycin A (50 μM)与 1 μM 鱼藤酮共处理24h。采用Ca2+荧光探针Fluo-3/AM分析细胞内Ca2+变化、H2DCFDA探针分析细胞内H202水平,TUNEL染色评估细胞凋亡,Western Blot分析CaMKⅡ、mTOR、4E-BP1、S6K1以及Caspase蛋白表达变化。结果显示,鱼藤酮诱导神经细胞[Ca2+]i升高,藉此介导CaMKⅡ磷酸化,进而导致mTOR通路抑制和细胞凋亡;鱼藤酮诱导过量线粒体H2O2产生引发[Ca2+]i升高刺激CaMKⅡ磷酸化,进而导致mTOR通路抑制和神经细胞凋亡;过表达mTOR、持续激活S6K1 或沉默 4E-BP1 强化 CAT、Mito-TEMPO、BAPTA/AM 或 EGTA 抑制鱼藤酮诱导[Ca2+]i升高。提示:Ca2+信号转导和线粒体H2O2之间交互作用是鱼藤酮抑制mTOR信号通路导致神经细胞凋亡所必需的。3神经细胞PD模型自噬抑制涉及不依赖mTOR通路的AMPK激活机制PC12细胞和原代神经元或分别用Ad-dn-AMPKα、Ad-LacZ和Ad-GFP-LC3感染的PC12细胞,以不同浓度6-OHDA (0-240 μM)、MPP+ (0-1.5 mM)或鱼藤酮(0-1 μM)处理 24h,或用 6-OHDA (120μM)、MPP+ (1 mM)或鱼藤酮(1 μM)处理不同时间(0-24 h),或用Compound C (10 μM)预处理1 h后再用 6-OHDA (120μM)、MPP+ (1 mM)或鱼藤酮(1 μM)处理 24h。采用 MDC染色,GFP-LC3 标记自噬斑点,Western blot 检测 AMPKα、mTOR、4E-BP1、S6K1、α-Synuclein、LC3、p62/SQSTM1 和 Cleaved-caspase-3 蛋白表达变化。结果显示,6-OHDA、MPP+、鱼藤酮均以浓度和时间依赖的方式激活AMPKα、抑制mTOR通路,并导致自噬标志蛋白LC3-Ⅱ减少和自噬受体p62蛋白表达增加。暗示:神经细胞PD模型中自噬抑制涉及不依赖mTOR通路的AMPKα激活机制。4神经细胞PD模型存在阻断Ulk1-Beclin 1及Atg5-Atg12途径抑制自噬PC12细胞和原代神经元以不同浓度6-OHDA(0-240 μM)、MPP+(0-1.5 mM)或鱼藤酮(0-1 μM)处理 24h,或用 6-OHDA (120μM)、MPP+ (1 mM)或鱼藤酮(1μM)处理不同时间(0-24h),或用Ad-mCherry-GFP-LC3感染的PC12细胞或采用CRISPR/Cas9下调Ulk1表达的PC12细胞用6-OHDA (120 μM)、MPP+ (1 mM)或鱼藤酮(1 μM)处理24h,评估串联mCherry-GFP-LC3标记自噬斑点细胞表现,Western Blot检测Ulk1、Beclin 1、Ambra1、Atg5和Atg12蛋白表达或免疫共沉淀分析Beclin 1与Ambra1相互关系。结果显示,6-OHDA、MPP+和鱼藤酮均以浓度和时间依赖的方式抑制神经细胞Ulk1 (Ser757和556)和Beclin 1 (Ser14)磷酸化,以及Atg5-Atg12复合物表达减少。提示:神经细胞PD模型中,神经细胞存在Ulk1-Beclin 1途径抑制导致基础自噬降低;Atg5-Atg12复合物缺乏使得LC3酯化受阻与神经细胞自噬抑制有关系。5 白藜芦醇保护抗镉诱导神经细胞凋亡性死亡PC12细胞和原代神经元接种在6孔板中(5×105/孔),选用25、50、100μM的白藜芦醇预处理细胞1 h,然后暴露10和20 镉8 h或24 h,观察细胞形态、台盼蓝染色检测活细胞数量、DAPI和TUNEL染色评估细胞凋亡表现;Caspase-3/7 活性分析、Western Blot 分析 Cleaved-caspase-3 表达。结果显示,在PC12细胞和原代神经元中,100 μM白藜芦醇明显阻止镉引起的细胞形态皱缩、细胞活性下降及Cleaved-caspase-3和细胞凋亡增加。提示:白藜芦醇保护抗镉诱导神经细胞凋亡性死亡。6白藜芦醇通过抑制mTORC1和mTORC2信号通路抗镉诱导神经细胞凋亡PC12细胞和/或原代神经元、或分别用shRNAmTOR、shRNARictor、shRNA Raptor、shRNA S6K1 和 shRNA GFP 感染的 PC12 细胞、或用 Ad-4EBP1-5A、Ad-dn-Akt、Ad-myr-Akt 和 Ad-LacZ 感染 PC12 细胞,用白藜芦醇(100 μM)预处理1 h、或用PP242 (1 μM)或Akt抑制剂X (20 μM)预处理1 h然后再用白藜芦醇(100 μM)预处理1 h,接着暴露镉(10 μM)处理8 h或24 h。台盼蓝染色检测活细胞数量、TUNEL染色评估细胞凋亡、Western Blot相关蛋白表达。结果显示,mTOR下调强化白藜芦醇抗镉诱导神经细胞凋亡;PP242预处理提高白藜芦醇抑制抗镉诱导神经细胞凋亡;下调Rictor、Raptor或Rictor/Raptor有力地逆转镉诱导神经细胞凋亡,且增强白藜芦醇活性抑制作用;沉默S6K1、异位表达4EBP1-5A增强白藜芦醇抑制镉诱导细胞凋亡作用;Akt抑制剂X或钝化Akt活性也强化白藜芦醇抗镉神经毒性,而持续激活Akt抵抗白藜芦醇对镉诱导细胞凋亡的抑制作用。提示:白藜芦醇通过抑制镉激活mTORC1介导S6K1和4E-BP1通路及mTORC2介导Akt通路保护神经细胞抗凋亡。7白藜芦醇通过PP2A和PP5抑制镉激活Erk1/2和JNK通路抗神经细胞凋亡PC12细胞和原代神经元、或分别用Ad-dn-c-Jun、Ad-MKK1-K97M、Ad-PP2A、Ad-PP5和Ad-GFP感染的PC12细胞,用白藜芦醇(25、50和/或100μM)预处理1 h、或用U0126 (5 μM)或SP600125 (20 μM)预处理1 h然后再用白藜芦醇(100 μM)预处理1 h,接着暴露镉(10和/或20 μμM)处理4h或24 h。台盼蓝染色检测活细胞数量、DAPI染色评估细胞凋亡、Western Blot相关蛋白表达。结果显示,白藜芦醇抑制镉诱导JNK、Erk1/2和p38通路激活;JNK抑制剂SP600125或Erk1/2抑制剂U0126预处理提高白藜芦醇抑制镉诱导神经细胞凋亡,这进一步被异位表达dn-c-Jun或MKK1-K97M增强白藜芦醇抑制镉诱导细胞凋亡作用证据支持;白藜芦醇逆转镉失活PP2A和PP5;过表达PP2A或PP5能够有力地增强白藜芦醇抑制镉诱导JNK和/或Erk1/2通路激活及神经细胞凋亡。提示:白藜芦醇通过抑制镉失活PP2A和PP5阻滞镉激活JNK和Erk1/2通路抗神经细胞凋亡。
新吉乐[10]2013年在《MPP~+诱导SH-SY5Y细胞慢性损伤帕金森病模型的建立及鹿茸多肽的保护作用》文中研究表明背景和目的帕金森病（Parkinson's disease，PD）是一种中老年常见的神经系统退行性疾病，其发病率的上升不仅严重影响患者的生活质量，而且给家庭和社会带来沉重的负担。PD的临床症状包括静态下震颤、反应迟钝、僵硬和姿势扭曲等。PD的主要病理特点是黑质致密部的多巴胺能神经元丢失，进而使纹状体内的多巴胺水平降低。目前，PD的发病原因尚不完全清楚。各类体内和体外实4验显示，PD的发病机制涉及线粒体功能障碍、氧化应激、泛素化蛋白酶体等途径。最近的研究表明，PD发病机制还涉及未折迭蛋白聚积引起的内质网应激，即内质网应激（endoplasmic reticulum stress, ER stress）介导的细胞凋亡参与PD的发病过程。因此，深入了解PD发病机制，探寻有效的神经保护剂是目前治疗PD的重要策略。PD发病机制的探讨和潜在治疗药物的筛选及评价，在很大程度上依赖于疾病相关体内外模型的建立及应用，特别是离体细胞模型的建立及应用。众所周知，PD是一种慢性疾病，具有缓慢、进展性的发病过程和特征，但是目前国内用于PD发病机制和药物筛选的离体细胞模型大多为急性损伤模型。我们的实践证明，采用常规急性损伤细胞模型已经不能客观反映PD缓慢、渐进性发展的规律和特征，必须建立PD稳定的慢性损伤的体外模型，以适应PD发病机制研究及探寻有效神经保护剂的需要。基于以上的理解，本研究首先以1-甲基-4-苯基吡啶离子（1-methyl-4-phenylpyridinium, MPP~+）作为诱导剂，以SH-SY5Y细胞作为模型载体，建立PD急、慢性细胞损伤模型，确定建立急、慢性细胞模型的最佳条件。在比较急、慢性SH-SY5Y细胞损伤的规律和特点基础上，利用慢性SH-SY5Y细胞损伤模型探讨内质网应激介导的SH-SY5Y细胞凋亡机制。并在上述研究基础上观察鹿茸多肽（Velvet antler polypeptides, VAPs）对SH-SY5Y细胞凋亡的干预作用及初步机制探讨，为进一步开发抗PD的药物提供科学依据和研究思路。方法1.以新鲜梅花鹿茸为原材料，通过胶体磨匀浆、硫酸铵沉淀、冷冻干燥等方法制备VAPs；进一步利用SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳（polyacrylamide gelelectrophoresis，PAGE）、激光解吸电离飞行时间质谱和氨基酸组成分析等技术初步分析鹿茸总肽的理化性质。2.采用MPP~+诱导人神经母细胞瘤SH-SY5Y细胞发生凋亡，设置不同浓度MPP~+分别作用24,48,72h，建立MPP~+急性损伤细胞模型；MTT法检测细胞活力，最终确定120.9μM MPP~+作用72h为建模浓度和时间。进而将培养的SH-SY5Y细胞分为空白对照组、MPP~+组和VAPs组。对照组给予细胞培养基培养，MPP~+组给予120.9μM的MPP~+处理，VAPs组给予不同浓度VAPs（62.5、125、250μg/mL）与120.9μM MPP~+同时处理。采用Hoechst33342染色检测细胞凋亡，罗丹明123染色检测线粒体膜电位（△Ψm），H2DCFDA染色检测细胞内活性氧簇（reactive oxygen species，ROS）的水平，Western blot和免疫细胞化学检测内质网分子伴侣重链结合蛋白/糖调节蛋白（Heavy-chain bindingprotein/glucose regulated protein78, Bip/GRP78）、CCAAT/增强子结合蛋白同源蛋白（C/EBP homologous protein, CCAAT/enhancer binding protein homologousprotein, CHOP）、磷酸化c-Jun氨基末端激酶/应激活化蛋白激酶（c-Jun N-terminalkinase/Stress-activated protein kinases, JNK/SAPK）、半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶12（caspase-12）等4种蛋白的表达情况。3.采用MPP~+诱导人神经母细胞瘤SH-SY5Y细胞发生凋亡，设置不同浓度MPP~+分别作用5,10,15天，建立MPP~+慢性损伤细胞模型；MTT法检测细胞活力。将培养的SH-SY5Y细胞分为空白对照组、MPP~+组和VAPs组。对照组给予细胞培养基培养，MPP~+组给予31.1μM的MPP~+处理，VAPs组给予不同浓度VAPs与31.1μM MPP~+同时处理。上述各组细胞均孵育5,10,15天后，采用MTT法检测细胞存活率。采用Hoechst33342染色检测细胞凋亡，罗丹明123染色检测△Ψm，H2DCFDA染色检测细胞内ROS的水平，Western blot检测GRP78、CHOP、磷酸化JNK（p-JNK）和caspase-12等蛋白表达情况。结果1.鹿茸总多肽（VAPs）所得VAPs为白色粉末状，水溶性较好，蛋白质含量为54%。VAPs分子量主要分布在10kDa和20kDa区域范围内。进一步将分子量10kDa区域的多肽进行质谱分析，其分子量在3000～11000Da范围内。VAPs主要由天冬氨酸、丝氨酸、谷氨酸、甘氨酸、丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、苯丙氨酸、赖氨酸、精氨酸和脯氨酸组成，没有检测到半胱氨酸、酪氨酸和色氨酸。2.急性损伤模型⑴120.9μM的MPP~+可以诱导SH-SY5Y细胞存活率下降，凋亡率增加。125、250μg/mL的VAPs可减少细胞凋亡，以72h到达最大保护效应。MPP~+导致△Ψm降低，ROS（活性氧簇）含量增加。125、250μg/mL的VAPs拮抗MPP~+诱导产生的△Ψm和ROS的变化。⑵MPP~+诱导caspase-12表达显着增加，不同浓度VAPs可使MPP~+诱导的Caspase-12表达有所降低。在MPP~+损伤的SH-SY5Y细胞未观察到GRP78、CHOP、p-JNK等内质网应激（ER）相关蛋白的显着表达。综上，MPP~+致SH-SY5Y细胞损伤的主要特征为线粒体功能障碍和氧化应激介导的细胞凋亡，VAPs对该损伤有拮抗和纠正作用。在MPP~+诱导的急性损伤模型中，MPP~+可使SH-SY5Y细胞内的caspase-12水平显着提高，但没有看到其它内质网应激相关蛋白的过表达。内质网应激相关蛋白沉默表达提示，在急性损伤模型中caspase-12的激活及诱导细胞凋亡并非借助于内质网应激相关途径的启动，可能主要介导线粒体凋亡途径及氧化应激凋亡途径。3.慢性损伤模型（1）建立了MPP~+作用SH-SY5Y细胞5天（IC50为31.1μM）、10天（IC50为22.1μM）和15天（IC50为10.4μM）的慢性损伤模型，500μg/mL VAPs能有效提高SH-SY5Y细胞5天、10天和15天的存活率。（2）在MPP~+慢性损伤SH-SY5Y细胞中，没有看到MPP~+急性损伤模型呈现的凋亡特征性改变和△Ψm的变化，VAPs也没有明显作用。但在MPP~+损伤5天的SH-SY5Y细胞内，ROS水平显着升高，VAPs能明显降低细胞内ROS含量。（3）免疫细胞化学和Western blot检测均显示，MPP~+作用5天的SH-SY5Y细胞中，内质网应激相关蛋白caspase-12、GRP78、CHOP和p-JNK表达水平显着提高，VAPs与MPP~+共孵育可明显对抗caspase-12、GRP78、CHOP、p-JNK表达的上调。在MPP~+诱导10、15天的SH-SY5Y细胞中则看不到上述内质网应激相关蛋白的变化，VAPs也没有相应的作用。结果提示，MPP~+致SH-SY5Y细胞慢性损伤的主要特征为内质网应激相关蛋白的激活，是一种功能性损伤。综上，在低浓度MPP~+（31.1μM）诱导5天的慢性损伤细胞模型中呈现出与高浓度MPP~+（120.9μM）诱导72小时急性损伤模型完全不同的损伤模式和特征性改变。研究表明，急性损伤模型是以线粒体功能障碍和氧化应激损伤介导的细胞结构性破坏，镜下看到大量凋亡细胞和细胞坏死残片。而慢性损伤模型则是以内质网应激和氧化应激介导的细胞功能性损伤，镜下没有典型的细胞凋亡和坏死。后者更接近于PD缓慢、进展性疾病的特点，是研究PD内质网应激相关机制的理想模型。鹿茸多肽对MPP~+诱发的SH-SY5Y细胞慢性损伤有保护作用，其机制可能是通过抑制内质网应激相关凋亡分子表达而实现的。
参考文献：
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