赵剑峰[1]2004年在《固氮菌突变种DJ35钼铁蛋白和UW3细菌铁蛋白的纯化、特性、晶体生长及鉴定》文中指出一、棕色固氮菌突变种DJ35固氮酶钼铁蛋白的纯化、体外重组及结晶研究棕色固氮菌(Azotobacter vinelandii Lipmann)突变种DJ35的菌体破碎后，所得的未经加热的粗提物经DEAE Cellulose 52柱层析后得到部分纯的钼铁蛋白(△nifE Avl)和铁蛋白(Av2) 。部分纯的△nifE Avl再经Sephacryl S-300和O-Sepharose Fast Flow柱层析进一步纯化，便首次得到SDS凝胶电泳检测为基本纯的△ nifE Avl。SDS-PAGE及Western blotting的结果表明，△nifE Avl具有与野生型棕色固氮菌钼铁蛋白(OP Avl)相同的亚基种类和组成(α2β2) 。质子还原活性测定表明，在与Av2进行活性互补时△nifE Avl不具有明显的质子还原活性，而与从OP Avl抽提出的FeMoco抽提液保温后便可与Av2实现活性互补。这表明，△nifE Avl是一种缺失FeMoco的钼铁蛋白。将△nifE Avl用过量的邻菲哕啉(o-phenanthroline)厌氧处理并经SephadexG-25柱层析分离后，便得到部分丢失Fe的△nifE Avl(?)。在同时存在Av2和MgATP发生系统的条件下，△nifE Avl(?)，而不是处理前的△nifE Avl，可为由KMnO4或Na2CrO4、 高柠檬酸铁、Na2S、Na2S2O4和二硫苏糖醇组成的含Mn或含Cr重组液(RS-Mn或RS-Cr)显着激活，但在缺少MgATP或Av2的条件下，RS-Mn和RS-Cr则不能激活△nifE Avl(?)。这就表明，RS-Mn和RS-Cr对△ nifEAvl(?)的激活都需要邻菲哕啉的预处理及Av2和MgATP的同时存在。从分别缺失nifZ和nifB点突变的固氮菌突变种DJ194和UW45中纯化得到的钼铁蛋白，△ nifZ Avl和NifB-Avl，经邻菲哕啉厌氧处理并经Sephadex G-25柱层析分离后，也分别得到部分丢失Fe的△ nifZ Avl(?)和NifB-Avl(?)。与A△nifE Avl(?)一样，这两种蛋白在Av2和MgATP同时存在时也可被RS-Cr和含Mo重组液(RS-Mo)明显激活。为获得可供X-射线衍射的△nifE Avl的大单晶，对组成蛋白质沉淀剂的各种化合物的种类和浓度、缓冲液的pH值、结晶方法及蛋白样品的批次、浓度等结晶条件进行了大量优化研究。首次获得了△nifE Avl的深棕色短斜四棱柱晶体，并对其蛋白组成进行了鉴定。二、铬铁蛋白中残存的棕色固氮菌细菌铁蛋白的晶体生长及鉴定从无铝、无氨而含铬的固氮培养基中生长的棕色固氮菌突变种UW3中纯化得到了部分纯的CrFe蛋白。在试图培养CrFe蛋白大晶体时发现，棕色晶体和砖红色晶体可同时或单独出现。SDS一和厌氧天然一队GE皆表明，棕色晶体主要由与Avl类似大小的亚基(一60 kD)组成，而砖红色晶体则主要由一20 kD亚基组成。western一blotting表明只有一60 kD亚基可与Op Avl的抗体发生反应，而一20 kD亚基则无这种反应。在部分纯的CrFe蛋白中，一20 kD的蛋白含量远低于一60 kD蛋白的含量，表明由这种小亚基组成的蛋白只是CrFe蛋白中的一种污染蛋白。用3，5一二氨基苯甲酸染色的天然电泳表明，形成砖红色和棕色晶体的蛋白是迁移率不同的两种含铁蛋白。质谱分析表明，该晶体蛋白为棕色固氮菌的细菌铁蛋白(AvBF)。分辨率为2.34A的X一射线衍射结果也表明，砖红色晶体属于H3空间群，晶胞参数为a=124.965入，b= 124.965入和c=287.406A。首次完成的结构解析也表明，这种砖红色晶体确为24聚体的AvBF。关键词:棕色固氮菌突变种DJ35和uw3;乙n产Avl;铬铁蛋白;细菌铁蛋白;纯化和特性;体外激活组装;晶体生长及组成鉴定/歹
边少敏[2]2005年在《棕色固氮菌突变株DJ35中钼铁蛋白和HBP59蛋白的研究—纯化、特性及晶体生长》文中研究指明我们从A. vinelandii突变株DJ35中纯化得到了△nifE Av1并通过与OP Av1相比较对其特性进行了研究虽然△nifE Av1以四聚体形式( 2 2)存在但却表现出两种天然电泳行为与OP Av1相比△nifE Av1中的金属含量较低每个蛋白分子仅含9.96个铁原子0.36个钼原子OP Av1和△nifE Av1的吸收光谱相似均在280 nm附近出现蛋白吸收峰在300-600 nm波长范围内光吸收普遍降低并无特征峰出现虽然△nifE Av1可见光区域CD谱的摩尔消光系数总比OP Av1小但在520 nm区域附近摩尔消光系数减少的相对值明显大于在450 nm附近摩尔消光系数减少的相对值△nifE Av1的EPR信号明显与OP Av1不同在g≈3.7处的EPR信号完全消失在g≈4.3和2.0处的EPR信号强度也分别降低了75%和50%以上△nifE Av1不能与Fe蛋白组成活性单位但被FeMoco激活后可与Fe蛋白组成活性单位除此之外我们还对△nifE Av1和△nifH Av1的结晶条件进行了筛选并得到了优质小单晶上述结果表明,△nifE Av1不含FeMoco但具有与OP Av1相同的P-cluster我们在纯化△nifE Av1的过程中发现一个类似OP Av1的β亚基的污染蛋白经MALDI-TOF质谱鉴定这种蛋白是棕色固氮菌中一预测基因的产物我们探索出一种纯化方法并首次得到80%电泳纯的蛋白将其命名为HBP59蛋白HBP59为一单体蛋白分子量约为59 kDa金属测定结果表明每个蛋白分子中含有0.42个铁原子HBP59蛋白的可见光谱表现出典型的血红素蛋白光谱特征还原态的HBP59蛋白在421 nm处有最大吸收峰同时在517 nm 556 nm处有两个伴随肩峰出现A421/A280仅为0.146 HBP59蛋白氧化后吸收峰发生蓝移最大吸收峰从421 nm移到413 nm 517 nm和55 nm处的肩峰消失A413/A280为0.168 HBP59蛋白的可见光区圆二色谱比较复杂正峰出现在420 nm, 406 nm, 379 nm和364 nm; 其摩尔消光系数分别为0.75 M~(-1) cm~(-1) 0.94 M~(-1) cm~(-1) 0.68 M~(-1) cm~(-1)和0.99 M~(-1) cm~(-1)负峰出现在433 nm和392 nm其摩尔消光系数分别为~(-1).13 M~(-1) cm~(-1)和-0.78 M~(-1) cm~(-1)血红素滴定实验结果说明每个HBP59蛋白分子结合了0.1个血红素但每个蛋白分子具有最大结合1个血红素的能力该蛋白对温度相对敏感高于40蛋白开始沉淀除此之外我们还对HBP59的晶体培养进行了初步探索上述结果说明HBP59是一个结合血红素的蛋白它在菌体内可能并未扮演贮藏血红素的角色而是可能参与血红素的运输或附着
王煌平[3]2006年在《棕色固氮菌突变株DJ194，DJ35和UW3固氮酶组分Ⅰ蛋白的研究》文中研究表明本研究以体外拆卸与重组的方法对金属原子簇缺失的固氮酶进行研究为主，再次证实固氮酶突变体金属原子簇体外拆装的可行性，同时，通过体外重组证实了不含FeMoco的蛋白污染的具高纯度的CrFe蛋白与MnFe蛋白新型固氮酶存在的可能性，为新型固氮酶的存在提供新证据。纯化出CrFe蛋白与MnFe蛋白并对其特性进行初步研究，此外，还进行△nifZ Av1制备物晶体生长研究。因而研究不仅具有深广度，也具有创新性。 用阴离子交换树脂DEAE-52和Q-Sepharose，以及凝胶过滤S-200或S-300柱层析，从棕色固氮菌(Azotobacter vinelandii)nifZ基因缺失的突变株(DJ194)纯化出纯度大于90％的△nifZ钼铁蛋白(△nifZ Av1)制备物，从nifE基因缺失的突变株(DJ35)中纯化出纯度较高的△nifE钼铁蛋白(△nifE Av1)制备物，以及从在含Cr或含Mn的培养基中固氮生长的nifH基因缺失的突变株(UW3)纯化出CrFe蛋白和MnFe蛋白。并对高纯度的△nifZ Av1制备物进行了晶体生长条件的优化研究。 我所在实验室首次证实从DJ194中纯化出的△nifZ Av1制备物为FeMoco含量正常(2个)，而P-cluster缺少一半(1个)的、失去一半活性的MoFe蛋白。在厌氧的条件下，用过量的邻菲啰啉(O-phenanthroline，O-phen)螯合其P-cluster中的Fe原子，经计算后，△nifZ Av1分子大约失去8个Fe原子，即为构成一个P-cluster([8Fe-7S]簇)中所有的Fe原子。经Sephadex G-25厌氧柱层析P-cluster金属原子簇中的Fe原子与O-phen螯合，得到完全无活性的△nifZ Av1(?)。但△nifZ Av1(?)，而不是未经O-phen处理的△nifZ Av1，可在Av2-MgATP复合体存在的条件下被含钼重组液显着激活。 从△nifZ Av1抽提的FeMoco可在体外激活完全缺失FeMoco而无活性的△nifE Av1和从另一突变株UW45纯化的nifB~-Av1。这表明我们纯化的这两种蛋白的确为正常的缺失FeMoco的固氮菌突变株蛋白。在厌氧的条件下，过量的O-phen也可从这两种蛋白的P-cluster中螯合出Fe原子。经Sephadex G-25柱层析得到△nifE Av1(?)和nifB~-Av1(?)，而不是未经O-phen处理的△nifE Av1和nifB~-Av1，在Av2-MgATP复合体存在条件下也为含钼、含铬和含锰重组液显着激活。 上述3种突变株蛋白的体外激活显然需要两个必需条件，即O-phen处理和在Av2及MgATP同时存在。前者也许使蛋白结构松散，而后者则可能使蛋白结构变成
赵颖[4]2005年在《含铬或锰的新型固氮酶的纯化，特性和结晶》文中研究说明以含MnSO4或Na_2CrO_4的无钼无氨的修改Burk’s培养基,培养不能合成含钼固氮酶体系的棕色固氮菌(Azotobacter vinelandii Lipmann)突变种UW_3,发现在一定浓度范围内, MnSO4或Na_2CrO_4的加入有助于促进其生长.菌体生长和C2H2还原活性曲线测定结果表明,这种促进作用很可能是通过Mn或Cr取代Mo,参与组装固氮酶中心原子簇,从而影响固氮活性而实现的.利用阴离子交换(DEAE-52和Q-Sepharose FF)和凝胶过滤(Sephacryl S-200)柱层析从两种菌体中纯化得到固氮酶组分Ⅰ蛋白(分别命名为MnFe蛋白和CrFe蛋白),并对其进行了特性研究.厌氧天然聚丙烯酰胺凝胶电泳(PAGE)和SDS-PAGE结果显示, 两种蛋白均为两种亚基组成的四聚体.亚基可以与OP MoFe蛋白抗体发生免疫反应,分子量分别略小于野生种OP MoFe蛋白的α和β亚基. CrFe蛋白的C2H2还原活性, Ar下放氢活性和固氮活性分别相当于OP MoFe蛋白的36%, 38%和43%,而MnFe蛋白活性相当于OP MoFe蛋白的50%左右,并且两种蛋白与OP MoFe蛋白具有相似的固氮电子利用率. 对两种蛋白金属含量的测定证实其中分别含有Mn和Cr,但仍存在少量Mo污染.与OP MoFe蛋白相比,这两种蛋白圆二色谱的摩尔椭圆率([θ])除在450nm较接近外,在可见光区的其它波长处均显着降低.与DT还原OP MoFe蛋白相似, CrFe蛋白和MnFe蛋白具有g≈4.3、3.7和2.0的特征EPR信号,但各处信号强度比例不同.在对污染Mo可能引起的信号进行校正后,CrFe蛋白的叁个信号强度分别相当于DT还原OP MoFe蛋白的20%, 0%和10%,而MnFe蛋白则分别相当于112%, 49%和65%.上述结果表明, CrFe蛋白和MnFe蛋白与OP MoFe蛋白金属原子簇的主要差异很可能在于FeMco (M=Cr, Mn或Mo)的M种类,而P-cluster结构和组成均未见大的差异.利用气相扩散悬滴法对MnFe蛋白和CrFe蛋白结晶条件进行了筛选和初步优化,确定了以Tris/Hepes, NaCl, MgCl_2和PEG 8000为主要变量的沉淀剂体系,寻找各组分对于晶体生长的最适浓度.以此为基础探讨了应用气相扩散坐滴法和液-液扩散法对两种蛋白结晶条件的优化.在一定条件下,两种蛋白分别通过液-液扩散法获得了优质大单晶. 对从CrFe蛋白和MnFe蛋白制备物中培养出的蛋白质晶体的SDS-PAGE鉴定显示,晶体由与OP MoFe蛋白相似的两种亚基组成.通过“神舟叁号”飞船搭载实验探讨了空间微重力对于厌氧蛋白质结晶的影响,结果表明,微重力有助于避免孪晶形成,并具有长期
参考文献：
[1]. 固氮菌突变种DJ35钼铁蛋白和UW3细菌铁蛋白的纯化、特性、晶体生长及鉴定[D]. 赵剑峰. 中国科学院研究生院（植物研究所）. 2004
[2]. 棕色固氮菌突变株DJ35中钼铁蛋白和HBP59蛋白的研究—纯化、特性及晶体生长[D]. 边少敏. 中国科学院研究生院（植物研究所）. 2005
[3]. 棕色固氮菌突变株DJ194，DJ35和UW3固氮酶组分Ⅰ蛋白的研究[D]. 王煌平. 福建师范大学. 2006
[4]. 含铬或锰的新型固氮酶的纯化，特性和结晶[D]. 赵颖. 中国科学院研究生院（植物研究所）. 2005