HCV和HBV的特异性T细胞免疫反应和分子机制研究

论文摘要

丙型肝炎是由丙型肝炎病毒（hepatitis Cvirus,HCV）引起的一种主要经血液传播的传染病,呈世界性流行。根据世界卫生组织报告,全球丙型肝炎的流行率平均为3%,估计有1.7亿人感染丙型肝炎病毒,每年新增感染者300万-400万例,死亡25万例,占所有传染病死因的第10位。丙型肝炎已经成为困扰全球公共卫生的一个重要问题。目前,由于HCV基因的多样性以及缺乏理想的动物和细胞感染模型,HCV疫苗研究仍面临很多难题。T细胞免疫在急性HCV感染中病毒是否能自发清除起到关键作用。研究表明,在自限性HCV感染的患者或黑猩猩中发生了强烈的HCV特异性CD8+T细胞应答,但在慢性感染的宿主中观察到较弱CD8+T细胞应答。为了探究T细胞在HCV感染自然进程中的特征,及T细胞免疫与疾病进程的相关性,我们招募河北省某村因献血感染HCV的聚集性人群为研究对象,其中的HCV感染者是1970-1990年左右因献血感染,没有接受过任何治疗。我们用NS3蛋白overlapping多肽库体外刺激PBMC,通过流式分析T细胞细胞因子分泌、记忆细胞分型及抑制性分子表达等,探究T细胞免疫在HCV病毒清除组和慢性感染组的特征及差异。结果表明,病毒清除组的CD8+T和CD4+T细胞因子分泌能力显著高于慢性感染组和健康对照组。两组HCV特异性CD8+T细胞主要以效应性记忆T细胞（TEM）和效应性T细胞为主（TEMRA）,而HCV特异性CD4+T细胞主要以效应性记忆T细胞（TEM）和中心记忆T细胞（TCM）为主。在抑制性分子的表达分析中,慢性感染者病毒特异性CD8+T细胞抑制受体的表达以PD-1高、TIM-3高表达为主要特征,其与以AST或ALT水平异常和形态病理学变化为特征的肝损伤相关。有趣的是,LAG-3在慢性感染者CD8+T细胞上的表达较低,与ALT或AST呈负相关。我们对长时期的HCV感染者的病毒特异性T细胞免疫的特征进行了研究,并有助于阐明免疫应答在相关临床过程中的作用。同时,我们也对慢性感染者感染的HCV病毒进行了分子水平的研究工作。我们对其感染的HCV病毒通过分子生物学实验进行基因分型,并利用一代测序和二代测序手段获得26条全基因组序列。根据基因分型结果,这些感染者感染的是HCV1b（17）、HCV2a（9）两种基因型。对于一代测序的全基因序列,我们根据MEGA7.0的进化距离分析发现,HCV1b间及HCV2a间的序列都有很高的同源性。通过与国内外序列进行系统发育进化树分析,HCV2a的序列相对聚集,聚集在一个独立的分支上,与国外测得的NDM228等株亲缘关系相对较近。HCV1b的17条序列相对分散。对各蛋白编码区也进行了系统进化分析,结果同全基因序列的分析基本一致。通过二代测序,我们获得的信息有原始reads、拼接序列、每条序列每个位点的测序深度、entropy、mutrate等。26条序列的拼接工作已经完成,数据分析还在进行中。我们在病毒“准种”、重要的T细胞表位和中和抗体表位的免疫逃逸突变等角度进行分析,结合临床数据,探究其与肝脏损伤程度的相关性。另外,MHC分子结构在T细胞免疫研究中起了很重要的作用。MHC分子可以限制TCR对多肽的识别,而且多肽与MHC之间的构象协调作用对于TCR的识别至关重要。如果将构像改变的关键氨基酸突变,就会导致pMHC复合物与TCR的结合变弱。同一 MHC-多肽可以被不同TCR识别,MHC-多肽复合物的柔性变化也是TCR可以交叉识别的原因之一。可以看出,MHC-多肽的结合能力以及它们的构象变化影响了TCR识别。我们通过对H-2Kd-HBV peptide复合物分子结构的分析,并结合HLA-B*4001的结构解析及分析,发现两个复合物结构中都有在一个带正电的氨基酸R和负电氨基酸E构成的两种不同形式的盐桥参与MHC与多肽的结合。我们对两个氨基酸进行了单突变和双突变,通过refolding、CD检测MHC与多肽结合的稳定性,以及H-2Kdtetramer对HBV特异性CD8+T的识别,结果证明了盐桥氨基酸的突变影响了多肽与MHC分子的结合能力及多肽-MHC复合物对TCR的识别。综上所述,本研究探究了 T细胞免疫在HCV感染自然进程中的特征和T细胞免疫与肝脏损伤程度的相关性,并对感染者感染的HCV病毒全序列进行了分析。另外,我们基于H-2Kd-HBV peptide HBc87-95和 HLA-B*4001-SARS N216-225复合物结构发现了盐桥在MHC与多肽结合及MHC-多肽复合物对TCR识别的重要性。该研究工作对HCV和HBV的预防和治疗具有一定的提示性和指导性。

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中文摘要

ABSTRACT

第一部分研究内容

第一章聚集性献血导致的HCV感染的T细胞免疫研究

1.1 前言

1.2 实验材料

1.2.1 主要实验仪器

1.2.2 主要实验试剂

1.3 实验方法

1.3.1 研究对象

1.3.2 血样的采集与处理

1.3.3 抗HCV抗体的定性检测

1.3.4 临床信息的获得

1.3.5 HCV基因分型

1.3.6 HCV RNA足量

1.3.7 HCV多肽库的设计与合成

1.3.8 HCV特异性T细胞的刺激及流式分析

1.3.9 统计分析

1.4 实验结果

1.4.1 研究对象的人口学特征

1.4.2 研究对象的临床特征

1.4.3 HCV慢性感染者的病毒特征

+T细胞及CD4⁺T细胞应答'> 1.4.4 HCV病毒清除组与HCV慢性感染组有持续的CD8⁺T细胞及CD4⁺T细胞应答

1.4.5 多因子分泌

1.4.6 HCV特异性T细胞的表型特征

1.4.7 免疫抑制分子的表达特点

1.4.8 T细胞免疫与肝功能

1.5 小结与讨论

第二章聚集性献血感染HCV的分子生物学研究

2.1 前言

2.2 实验材料

2.2.1 主要实验仪器

2.2.2 主要的试剂及耗材

2.3 实验方法

2.3.1 HCV RNA提取

2.3.2 RNA反转录

2.3.3 全序列引物设计及测序

2.3.4 序列组装及分析

2.3.5 二代测序

2.4 实验结果

2.4.1 HCV病毒基因组的各片段反转录PCR结果

2.4.2 HCV病毒5'/3' RACE扩增结果

2.4.3 全基因序列拼接

2.4.4 序列同源性分析及进化分析

2.4.5 二代测序

2.5 小结与讨论

第三章盐桥在HBV特异性多肽呈递和T细胞识别中的作用机制研究

3.1 前言

3.2 实验材料

3.2.1 实验主要仪器

3.2.2 主要实验耗材及商品试剂

3.2.3 实验试剂及其配方

3.2.4 实验动物、菌株、载体

3.3 实验方法

3.3.1 实验所用的多肽合成和载体构建

d-HBV多肽免疫小鼠及脾细胞的获得'> 3.3.2 H-2K^d-HBV多肽免疫小鼠及脾细胞的获得

3.3.3 ELISPOT实验

d和HLA-B^*4001分子的表达与纯化'> 3.3.4 H-2K^d和HLA-B^*4001分子的表达与纯化

3.3.5 HLA-B*4001-peptide（GETALALLLL）的结晶条件的筛选

3.3.6 HLA-B*4001 Χ-射线衍射及结构解析

d-HBVpeptide的热稳定性'> 3.3.7 圆二色谱实验检测H-2K^d-HBVpeptide的热稳定性

d-HBV peptide四聚体的制备及流式染色'> 3.3.8 H-2K^d-HBV peptide四聚体的制备及流式染色

3.4 实验结果

d分子和HLA-B^*4001-分子的蛋白纯化'> 3.4.1 H-2K^d分子和HLA-B^*4001-分子的蛋白纯化

d/HLA-B^*4001野生型/突变体与多肽的结合能力'> 3.4.2 探究H-2K^d/HLA-B^*4001野生型/突变体与多肽的结合能力

d野生型及突变体结合多肽识别TCR'> 3.4.3 探究H-2-K^d野生型及突变体结合多肽识别TCR

d和HLA-B^*4001形成的两种不同的盐桥'> 3.4.4 H-2K^d和HLA-B^*4001形成的两种不同的盐桥

3.4.5 盐桥对MHCI和结合肽的结构构象的影响

3.4.6 潜在盐桥广泛存在不同脊椎动物中

3.5 讨论

第二部分文献综述

第四章 HCV病毒及细胞免疫概述

4.1 HCV病毒的流行病学及临床

4.1.1 HCV的流行

4.1.2 HCV的临床表现

4.1.3 HCV病毒的检测和实验室诊断

4.1.4 HCV的防控及治疗

4.2 HCV病毒的基本特征

4.2.1 HCV病毒的形态特征

4.2.2 HCV病毒的基因组成及全基因组测序

4.2.3 HCV病毒的生活周期

4.2.4 HCV病毒的传播及变异

4.3 HCV病毒感染的免疫反应特征

4.3.1 血清学反应

4.3.2 T细胞免疫

第五章 MHC分子结构免疫学概述

5.1 MHC的概念

5.2 MHC的抗原呈递及T细胞识别

5.2.1 MHCⅠ类途径

5.2.2 MHCⅡ类途径

5.2.3 外源抗原的MHCⅠ类途径交叉呈递

5.3 MHC及相关分子的结构特征

5.3.1 MHCⅠ类分子的结构特征

5.3.2 MHCⅡ类分子的结构

5.3.3 非经典的MHCⅠ类分子结构

5.4 MHC分子结构在T细胞免疫研究中的应用

5.4.1 MHC结构研究对于MHC分子分类的影响-HLA超级型及其意义

5.4.2 MHC分子对TCR识别的限制性

5.4.3 MHC交叉呈递和TCR交叉识别的结构基础

全文总结

参考文献

附录1 缩略表

作者简历及攻读学位期间发表的学术论文

致谢

文章来源

类型: 博士论文

作者: 纪伟

导师: 高福,刘军

关键词: 细胞免疫,识别,盐桥

来源: 中国疾病预防控制中心

年度: 2019

分类: 基础科学,医药卫生科技

专业: 生物学,基础医学

单位: 中国疾病预防控制中心

分类号: R392

总页数: 189

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