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香樟具有极高的园林观赏价值和经济价值，是徐州引种的常绿阔叶树种作为行道树最常用的树种。但是徐州地区，冬季漫长而寒冷，与香樟原产地气候差异较大。引种栽培实践证明:当年引种香樟如未能及时做好防寒工作，会有许多苗木在冬季低温死亡，而无法顺利越冬。通过本实验的研究，希望能初步阐明香樟某些抗寒机理并分析其抗寒能力的差异，以期客观地判断其抗寒力和在徐州周边地区推广应用的可行性，为园林生产和应用提供较可靠的理论依据
1实验材料与方法
1.1实验材料
香樟(CinnamomumcamphoraL.)：6年生
实验材料均来自于徐州师范大学校园内。
2实验方法
2.1材料采集
每月（2017年10月～2018年3月）分别于中旬集中取样，在20株香樟中随机采集位于中上部的当年生侧枝上的第2～5枚完好的叶片，采集50片左右。
2.3指标测定方法
2.3.1细胞膜相对透性的测定
细胞膜相对透性测定采用李振国[1]的方法,将供试植物叶片包在湿纱布内，放在带盖的搪瓷盆中。用自来水冲洗后，再用去离子水冲洗1~2次，用干纱布吸干表面水分，然后保存在湿纱布中。避开大叶脉用打孔器打取圆片，充分混匀后备用。每处理分甲乙两组，每组3次重复，每重复10个圆片，放入小玻璃杯中，加入20mL重蒸去离子水。甲组在室温下振荡2~3h。乙组在沸水浴中加温10~15min，以完全破坏质膜。将甲乙两组样品的组织外渗液分别倒入洁净小玻璃杯中，用电导仪测其电导率。电解质外渗率(REC)=甲组组织外渗液/乙组组织外渗液*100%。三次重复。
2.3.2SOD的测定[2]
称取0.5g叶片，液氮环境下研磨，2ml磷酸缓冲溶液（浓度0.1mol/L，pH7.4）提取SOD酶。4000rpm/min4℃冷冻离心15min。取上清液，用南京建成生物工程研究所SOD试剂盒测定酶活性。定义每毫克鲜重叶片在1ml反应液中SOD抑制率达50％时所对应的SOD量为一个SOD活力单位（U）。三次重复。
2.3.4游离脯氨酸(Pro)含量测定
采用酸性茚三酮显色法[2]。
3实验结果
3.1不同低温处理香樟叶片质膜相对透性的变化
香樟细胞质膜相对透性随温度下降而呈“S”型曲线变化，与温度成负相关（表1）；多重比较分析表明，香樟质膜相对透性随温度下降极显著上升（p<0.01）。由图1可知，香樟10月和3月细胞质膜相对透性在对照和-5℃之间处理之间，迅速上升；-5℃～-15℃之间细胞质膜相对透性骤增；-15℃～-25℃之间细胞质膜相对透性趋于平缓，-15℃和-20℃无显著差异、-20℃和-25℃处理之间无显著差异(P>0.05)。11月、12月、1月和2月在对照到-10℃处理之间，上升趋势缓慢；-10℃～-15℃处理之间，迅速上升；-20℃～-25℃处理又呈缓慢上升趋势。
图1低温胁迫对香樟叶片细胞质膜相对透性的影响
Fig.1EffectsoflowtemperaturestressonPlasmamembranepermeabilityinleavesofCinnamomumcamphoraL.MagnoliagrandifloraL.
表1细胞质膜相对透性与人工处理温度（0℃～-25℃）相关系数
通过图1发现，香樟在抗寒锻炼初期的10月和11月与抗寒锻炼后的3月从对照到-10℃细胞质膜相对透性骤增，并且-10℃细胞质膜相对透性都超过50%，在接下来的降温处理中，香樟质膜相对透性不断增大，最后香樟渗透率都在70%以上，表明香樟细胞膜已受到了严重的损伤，同时也可以看出膜的破坏是一个不可逆的过程。香樟经历抗寒锻炼的12月和1月与抗寒锻炼末期的2月却在-10℃～-15℃细胞质膜相对透性骤增，在接下来的降温处理中，变化幅度小，耐低温能力强。
3.2不同低温处理香樟SOD活性的变化
多重比较分析表明，香樟在不同温度处理下SOD活性变化呈双峰曲线，变化极显著(P<0.01)。香樟SOD活性与温度成正相关（表2），除了1月相关性较低，其他月份相关性均较高，表明香樟对低温较为敏感，提高SOD活性，是香樟适应低温的一条重要途径。由图2可知，10月香樟SOD活性在对照到0℃之间，呈上升趋势，0℃时SOD活性是对照的1.27倍；0℃到-10℃之间显著性下降(P<0.05)；-10℃到-25℃之间变化趋于平缓（p>0.05）。11月、1月和2月SOD活性从对照到-10℃之间和-15℃到-20℃之间都呈极显著性上升趋势(P<0.01)；-10℃到-15℃之间和-20℃到-25℃之间呈显著性下降趋势(P<0.05)。12月和3月SOD活性从对照到-5℃之间，显著性上升(P<0.05)，-5℃时SOD活性分别是对照的1.57倍和1.35倍；-5℃到-10℃急剧下降(P<0.01)；-10℃到-25℃之间变化不显著（p>0.05）。实验期间香樟SOD活性相对增大幅度的顺序为：1月>2月>11月>12月>3月>10月。
图2低温胁迫对香樟叶片SOD活性的影响
Fig.24EffectsoflowtemperaturestressonSODactivityinleavesofCinnamomumcamphoraL.
表2SOD活性与人工处理温度（0℃～-25℃）相关系数
许多研究[4,5,6]认为，植物在低温胁迫期间的SOD、POD活性均增加，抗寒性强的品种酶活性增加的多。本实验结果表明，受到低温胁迫后香樟叶片中的SOD活性均增加，香樟增大幅度最大是在全年平均温度最低的1月，出现最大值的温度是-10℃。11月份的降温启动了树木体内的低温适应机制，所以能够在最低温到来之前将SOD活性调整到最高，香樟在即时的低温刺激下被动调整的SOD活性。
3.3不同低温处理下香樟游离脯氨酸含量的变化
多重比较分析表明，香樟游离脯氨酸含量随温度下降而变化极显著（p<0.01），香樟游离脯氨酸含量都呈先升高后下降的变化趋势。由图3可知，香樟游离脯氨酸含量10月变化不明显，即在对照到-10℃之间，呈上升趋势，之后缓慢下降；11月、2月和3月均在-10℃达最大值，-10℃时分别是对照的2.47倍、1.66倍和2.0倍，-10℃到-20℃之间显著性降低（p<0.01），-20℃到-25℃之间基本维持不变；12月和1月最大值均在-15℃，-15℃时分别是对照的1.78倍和1.73倍，-15℃到-20℃之间显著性降低
（p<0.01），-20℃到-25℃之间缓慢下降（p>0.05）。六个月中游离脯氨酸含量相对增大幅度的顺序是：11月>3月>12月>1月>2月>10月。
图3低温胁迫对香樟叶片游离脯氨酸的影响
Fig.3EffectsoflowtemperaturestressoncontentoffreeprolininleavesofCinnamomumcamphoraL.
表3游离脯氨酸含量与处理温度（0℃～-25℃）相关系数
Table3Correlationcoefficientoffreeprolinandtreatmenttemperature（0℃～-25℃）
通过分析和比较香樟游离脯氨酸含量变化发现，香樟六个月在不同温度处理下变化较分散。相关分析表明，香樟游离脯氨酸含量与温度成正相关，说明增加游离脯氨酸，是香樟抵御冷害一个重要的方式。
参考文献：
[1]李振国.现代植物生理学实验指南.北京:科学出版社,1999.302～303LiZG.Experimentationguidesformodernplantphysiology.Beijing:SciencePress,1999.302~303(inChinese).
[2]李合生主编.植物生理生化实验原理和技术[M].高等教育出版社,2000(7):167～169.
[3]高爱农,姜淑荣,赵锡温,等.苹果品种抗寒性测定方法的研究[J].果树学报,2000,17(1):17～21.
[4]SchonerS,KrauseGH.Protectivesystemsagainstactiveoxygenspeciesinspinach:Responsetocoldacclimationinexeesslight[J].planta,1990,(8):353～359.
[5]张泽煌,黄碧琦.低温胁迫对茄子的伤害及茄子的抗寒机理[J].福建农业报，2000,15(l):40～42.
[6]彭吕操,孙中海.低温锻炼期间柑桔原生质体SOD和CAT酶活性的变化[J].华中农业大学学报,2000,19(4):384～387.