夹心平板技术在海洋细菌资源挖掘中的初步应用及三株新菌的分类鉴定

论文摘要

宏基因组和单细胞测序方法不仅可以检测到环境中未培养微生物所含有的未知基因,而且可以发现这些未培养微生物潜在的重要代谢功能和生态位;但是,这些以基因或基因组为基础的技术不能对培养物进行全面仔细的研究,获得菌株的纯培养仍然是非常必要的;为了解决这个问题,目前己开发出多种未培养细菌的培养方法,但对细菌的纯培养中仍有许多困难亟待解决,如分离效率的下降,优势菌群对其他物种的影响,细菌细胞间信息的交流对生长的影响分离过程中所涉及的高端仪器的使用问题等。本文以实验室常用的培养基和可培养细菌为基础,结合自然界中细菌个体之间会产生相互作用的现象,设计了夹心平板技术,并且通过对海洋细菌的多样性研究对本方法进行了初步的验证。夹心平板技术中,夹心培养基共分为上、中、下三层;下层为实验室常用的2216E培养基,上层为改良的1/10 2216E培养基,中间用可培养细菌作为夹心菌株;通过对夹心菌株的涂布面积,夹心菌株的处理方式,上层培养基琼脂的浓度等方面的优化,最终确定夹心菌株在下层培养基表面涂布区域的直径约为70mm,上层培养基的琼脂浓度为4%（w/v）,并且直接将上层培养基倾倒在夹心菌株表面。采用夹心平板法对威海近海沉积物中的细菌多样性进行研究,结果表明:实验组S25、S63、S69和S70在其夹心菌株的作用下可以使表面细菌的多样性增加,而S08、S09、S12、S38和S39组在其夹心菌株的作用下可以使表面细菌的多样性降低;在属水平,各实验组中优势菌群丰度变化较为明显的是Psychrobacter、Ruegeria、、Microbulbifer、Aequorivita和Bacillus五个属;在潜在新物种方面,各组在夹心菌株的作用下均可以增加新菌的比例,尤以S08、S25、S38、S39、S69 和 S70 组最为明显,并且Flavbbacteriaceaae、Moraxellaceae、Rhldobacteraceae、Halomonadaceae和Phyllobacteriacea 等科的潜在新物种在各组之见差异性较为明显;通过纯培养,共得到481株菌,分布于Actinoba和Pria、Bacteroidetes、Firmicutes和Prottobacter 4 4个门中,其中共有149株潜在新物种,新种124株,新属新种24株,新科新种1株;并且,通过对分离菌株的筛选和验证,得到17株具有生长依赖现象的菌株。此外,本文对三株新菌进行了多相分类。菌株M1309T分离于威海海参养殖池沉积物,为革兰氏阴性菌,杆状且具有滑动性;生长温度范围16-42℃,最适生长温度为37℃;生长pH范围为6.5-8.0,最适pH为7.0-7.5;生长盐度范围为 2.0-6.5%（w/v）NaCl,最适盐度为 2.0-3.0%（w/v）NaCl;根据 16S rRNA基因序列构建系统发育树,发现菌株M1309bT属于Winogradskgella属,与其最相似的物种为Winogradskyella porferorum JCM 12885T,相似度为95.5%;通过对菌株M1309T的化学特征分析,发现其呼吸醌型只有一种为MK-6,主要脂肪酸种类为iso-C15:0、iso-C15:1G和iso-C17:03-OH,主要极性脂为PE、两种AL和三种未知的脂肪酸L;基因组DNA含量为36.1mol%;根据表型的特异性和系统发育的差异性,认为菌株M1309T为Wnogradskye为 属的新物种,并将其命名为Winogradskyella tangerina;模式菌株为 M1309T（=KCTC 52896T= MCCC 1K03310T）。菌株ELS1360-T分离自内蒙古湖泊沉积物,为革兰氏阴性菌、兼性好氧、运动形式为滑动、菌体为杆状、菌落为粉红色;在不含NaCl的R2A培养基上,温度为33℃,pH为6.5-7.0时生长最佳;根据16S rRNA基因序列,菌株ELS1360T与菌株Hymenobacter luteus JCM 30328T和Hymenobacterlatericoloratus JCM 30327T最为相似,相似度分别为96.9%和96.8%,与Hymenobacter属的其他成员的相似度均在90.3-96.7%之间;通过发育树分析菌株ELS1360T属于Hymenobacter属,并且与菌株Hymenobacterluteus JCM 30328T和Hymenobacte lericoloratul JCM 30327T聚在一枝;呼吸醌型为MK-7;主要脂肪酸为iso-C15:0,Summed feature 3和C16:1ω5c;主要极性脂为PE、APL和未知的脂肪酸L;基因组DNA的G+C为57.1mol%;通过系统发育、表型、基因型和化学分类学分析,认为菌株ELS1360T是Hymenobacte是属的一个新物种,并命名为Hymenobacter sediminis;模式菌株为ELS1360T（=KCTC62449T=MCCC 1H00319T）。菌株N24T分离自西安温泉水,为革兰氏阴性菌、具有滑动性、杆状（宽约0.4-0.8μm,长约1.8-7.8μm）;最适生长温度为33℃,最适生长pH为7.0;可以产生胞外多糖;通过系统发育树分析,发现菌株N24T在Chitinophagaceae科中形成单独的一枝,最相似的属为Flavisobacter、Cnuella、Niveitalea、Flavitalea、Flaviaiaturariibacter和Niatella,16S rRNA基因的相似度为91.7-93.9%;主要脂肪酸种类为iso-C15:0（31.8%）、iso-C17:0 3-OH（16.1%）和iso-C15：1 G（12.9%）;极性脂成分为PE、两种AL和六种未知的脂肪酸L;呼吸醌型为MK-7;基因组DNA的G+C含量为49.3mol%;通过系统发育、表型、基因型和化学分类学分析,认为菌株N24T是Chitinophagaceae科的一个新属新种,并命名为Paracnuella aquatica;模式菌株为N24T（=KCTC62083T=MCCC 1H00301T）。

论文目录

文章来源

类型: 硕士论文

作者: 王冲

导师: 刘春利,杜宗军

关键词: 夹心平板技术,未培养细菌,依赖型菌株,多相分类

来源: 山东大学

年度: 2019

分类: 基础科学

专业: 生物学

单位: 山东大学

基金: 国家自然科学基金(项目号31370057,31400102和31770002),山东省海洋经济创新发展区域示范项目(项目号2150299),威海市海洋经济创新发展示范城市项目—海洋微生物酶与活性物质研发公共服务平台

分类号: Q93

总页数: 114

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