刘桐言[1]2017年在《FNDC5/Irisin改善肝脏糖脂代谢紊乱的作用及分子机制》文中研究指明2012年发现的irisin是一种新型肌肉因子,可以通过刺激解耦联蛋白-1(uncoupling protein-1,UCP1)的表达促进白色脂肪细胞转换成棕色脂肪细胞。Ⅲ型纤连蛋白组件包含蛋白 5(type Ⅲ domain-containing protein 5,FNDC5)是由两个纤连蛋白结构域、一个信号肽和一个嵌入细胞膜的疏水结构域构成的跨膜蛋白,FNDC5在细胞膜上发生水解生成irisin。小鼠FNDC5过表达可改善肥胖小鼠胰岛素抵抗和糖耐量异常。肥胖人群血清irisin浓度与肝脏甘油叁酯(triacylglycerol,TG)含量负相关。本论文分为两个部分,分别探讨了(1)irisin在2型糖尿病模型小鼠肝脏糖异生和糖原合成中的作用与机制;(2)FNDC5在小鼠肝脏脂肪酸氧化、自噬、脂肪从头合成及脂肪变性中的作用。一、Irisin减轻糖尿病模型肝脏糖异生、促进糖原合成的作用与分子机制1.背景高血糖和胰岛素抵抗是2型糖尿病典型特征。肝脏参与葡萄糖的代谢过程,是调节血糖的主要器官,在葡萄糖的贮存、分布和调节上具有重要意义。当血糖浓度升高时,肝脏通过糖原合成将血糖转变成糖原贮存于肝脏,并通过将过剩的葡萄糖转变为脂肪和加速磷酸戊糖循环等途径,维持血糖浓度相对稳定。相反,当葡萄糖供应不足、肝糖原储备减少时,肝脏可将乳糖、甘油及生糖氨基酸等通过糖异生作用转化为葡萄糖(剧烈运动和饥饿时尤为显着)。2型糖尿病时由于胰岛素抵抗和肝脏对血糖调控失衡,通常表现出糖异生异常增强,而肝脏糖原合成减弱。肝脏对糖异生和糖原合成调控的失衡进一步加重2型糖尿病血糖紊乱和胰岛素抵抗,形成恶性循环,因此逆转或抑制肝脏糖异生过度激活,增加肝糖原合成是防治2型糖尿病的重要策略之一。Irisin在2型糖尿病肝脏糖异生和糖原合成中是否发挥作用尚不明确,本研究主要探讨irisin对肝糖异生和糖原合成的作用及下游信号通路。2.目的本研究拟探讨irisin在胰岛素抵抗肝细胞和2型糖尿病模型小鼠肝脏糖异生和糖原合成中的作用及分子机制,并探讨小鼠皮下给予irisin对葡萄糖代谢紊乱和胰岛素抵抗的治疗作用。3.方法人肝癌细胞系(HepG2)培养在含25mM葡萄糖、10%FBS和1%双抗(100 units/ml青霉素,100μg/ml链霉素)的DMEM培养基中并保持37℃、5%的C02和饱和湿度。小鼠原代肝细胞培养在含10%生长因子,10%FBS和1%双抗的专用原代肝细胞培养基中。动物实验采用C57BL/6J小鼠,6周龄雄性C57BL/6J小鼠适应环境1周后,将其随机分为叁组,各7只,Ctrl组腹腔注射10mmol/l柠檬酸盐缓冲液并给予正常饮食(14.7 kJ/g,13%脂肪含量)。另外两组小鼠都接受单次小剂量腹腔注射链脲霉素(strePtozocin,STZ)合并高脂饮食以诱导2型糖尿病模型,3周后,给予这两组小鼠高脂饮食(21.8 kJ/g,60%脂肪含量),8周后将这两组糖尿病成模小鼠皮下微量渗透泵的形式分别给予生理盐水或irisin,期间小鼠维持高脂饮食状态,2周后叁组小鼠进行取材和急性实验。采用酶联免疫吸附测定法(enzyme-linked immunosorbent assay,ELISA)测定irisin和胰岛素水平。用葡萄糖脱氢酶偶联反应和乳酸脱氢酶偶联反应分别测定葡萄糖-6-磷酸酶(glucose-6-phosphatase,G6Pase)和磷酸烯醇丙酮酸竣激酶(phosphoenolpyruvate carboxykinase,PEPCK)活性。蛋白质免疫分析技术(Western blotting)检测蛋白 PEPCK,G6pase,糖原合成酶(glycogen synthase,GS),磷酸化 GS,糖原合成酶激酶-3(glycogen synthase kinase-3,GSK3),磷酸化GSK3,蛋白激酶B(ProteinkinaseA,Akt),磷酸化Akt,磷脂酰肌醇-3激酶 100α(Phosphoinositide 3-kinase 100α,PI3K100α)和 PI3K100β,叉头转录因子1(Forkhead box O1,FOXO1),磷酸化FOXO1和磷酸甘油醛脱氢酶(glyceraldehyde phosphate dehydrogenase,GAPDH)表达。用 real-time PCR(RT-PCR)法检测 PEPCK、G6pasemRNA 水平。采用过碘酸希夫染色(Periodic Acid-Schiff stain,PAS)染色法检测小鼠肝脏糖原含量;葡萄糖耐量(Glucose tolerance test,GTT)和胰岛素耐量(Insulin tolerance test,ITT)实验检测小鼠葡萄糖代谢和胰岛素抵抗情况;用葡萄糖氧化还原试剂盒和糖原检测试剂盒分别检测单位时间内肝细胞产糖量和糖原生成含量。4.结果(1)Irisin 减少葡萄糖胺(Glucosamine,GlcN)和棕榈酸(palmitate)对 HepG2细胞PEPCK、G6Pase mRNA和蛋白表达以及单位时间产糖量的促进作用。(2)Irisin通过促进GSK3蛋白磷酸化,抑制GS蛋白磷酸化,增加GlcN和棕榈酸诱导肝细胞肝糖原合成作用,增加肝糖原贮存量。(3)GlcN预处理HepG2细胞显着减少PI3K P100α和PI3K P100β蛋白的表达,irisin刺激HepG2细胞24h可升高PI3K P100α蛋白表达,对PI3K P100β蛋白表达无明显作用。Irisin通过增强PI3K/Akt信号通路抑制FOXO1活性。Irisin与胰岛素均可增加肝细胞Akt和FOXO1磷酸化,表明irisin和胰岛素均可激活PI3K/Akt信号通路。(4)Irisin对糖异生作用的抑制效应可被PI3K抑制剂LY294002或Akt抑制剂MK2206所阻断;Irisin通过促进GSK3蛋白磷酸化,抑制GS蛋白磷酸化从而增强胰岛素抵抗HepG2细胞糖原合成作用,增加肝糖原贮存,该效应可被PI3K抑制剂或Akt抑制剂所阻断。(5)链脲霉素(streptozocin,STZ)/高脂饮食(Highfatdiets,HFD)诱导 2 型糖尿病小鼠血清和肝脏irisin水平均低于对照组小鼠,皮下微量渗透泵给予irisin(STZ/HFD-irisin组)明显增高血清和肝脏irisin水平,但对小鼠的体重、饮食量和尾动脉收缩压并无作用。(6)STZ/HFD小鼠空腹血糖水平明显高于Ctrl组小鼠,血清胰岛素水平无差异,微量渗透泵给予irisin可降低STZ/HFD小鼠空腹血糖,改善葡萄糖耐量和胰岛素抵抗,增加肝脏糖原合成与贮存,而对血清胰岛素水平无影响。(7)皮下给予irisin通过PI3K/Akt信号通路下调小鼠肝脏PEPCK和G6Pase蛋白和mRNA表达;增强GSK3磷酸化,减弱GS磷酸化,从而改善STZ/HFD诱导的2型糖尿病小鼠肝脏糖异生过度增强和肝脏糖原合成减少。5.结论Irisin通过PI3K/Akt/FOXO1信号通路下调PEPCK和G6Pase活性,抑制糖异生作用;通过PI3K/Akt/GSK3信号通路增强GS活性,促进糖原合成。长期皮下给予irisin可以改善2型糖尿病小鼠高血糖症和胰岛素抵抗。二、FNDC5促进小鼠肝脏自噬和脂肪酸氧化、减轻脂肪从头合成的作用与分子机制1.背景非酒精性脂肪肝(Nonalcoholic fatty liver disease,NAFLD)以肝细胞中甘油叁酯(triacylglycerol,TG)过度增加为其主要特征。脂肪酸氧化(fatty acid oxidation,FAO)是在供氧充足的情况下发生在线粒体的氧化反应,脂肪酸经活化生成乙酰辅酶A(acetyl-CoA),acetyl-CoA转移至线粒体,在线粒体中生成酮体或进行β氧化,最终经叁羧酸循环彻底被氧化成二氧化碳和水,并释放出大量能量供机体利用。自噬是溶酶体介导的一种细胞死亡方式,是具有高度保守性的自我保护机制。自噬以囊泡的形式吞噬受损和需降解的自身细胞质蛋白或细胞器,形成自噬小体,自噬小体与溶酶体融合形成自噬溶酶体,降解其所包裹的内容物,以此实现细胞和细胞器的代谢和更新。FAO和自噬功能减弱以及脂肪从头合成(de novo lipogenesis)加强是肝脏脂质过度沉积的重要影响因素。因此寻找调控FAO、自噬或脂肪从头合成的靶分子成为治疗肝脏脂肪变性的重要策略之一。Ⅲ型纤连蛋白组件包含蛋白 5(Fibronectintype Ⅲ domain-containing protein 5,FNDC5)是由一个信号肽、两个纤连蛋白结构域和一个嵌入细胞膜的疏水结构域构成的Ⅰ型膜蛋白。尾静脉注射FNDC5全长腺病毒可减轻饮食诱导肥胖小鼠体重。有氧运动可使骨骼肌中FNDC5表达增多,FNDC5在细胞膜发生水解生成irisin,irisin进入循环并通过血液到达脂肪组织,具有促使皮下白色脂肪组织发生棕色变性的作用,并参与调节有氧运动介导的各种代谢改变。本实验室前期研究发现慢病毒过表达FNDC5可显着增强高脂饮食诱导肥胖小鼠能量消耗,减轻高糖血症和胰岛素抵抗,并可促进脂肪组织脂解。然而FNDC5是否参与肝脏脂肪变性、自噬以及脂肪酸氧化(fatty acid oxidation,FAO)的调控仍然未知。2.目的本研究拟探讨FNDC5在脂肪酸氧化、自噬、脂肪从头合成以及肝脏脂肪变性中的作用及分子机制,并探讨尾静脉注射FNDC5过表达腺病毒对肝脏脂肪变性的作用。3.方法使用4-8周龄雄性C57/BL6J(WT)小鼠和以C57/BL6J小鼠为背景的FNDC5敲基因(FNDC5-/-)小鼠。胶原酶消化法分离WT和FNDC5-/-小鼠原代肝实质细胞。4周龄WT和FNDC5-/-小鼠喂养12周高脂饮食诱导肥胖小鼠模型。酶联免疫吸附测定法(enzyme-linked immunosorbent assay,ELISA),Western blot和RT-PCR确认FNDC5基因敲除有效性。采用酶法测定血清和细胞组织中甘油叁酯(triacylglycerol,TG)、总胆固醇(total cholesterol,CHO)、游离脂肪酸(non-esterified fatty acid,NEFA)、丙氨酸转氨酶(alanine aminotransferase,ALT)、谷草转氨酶(glutamic-oxalacetic transaminase,AST)浓度。RT-PCR 检测 FAO、自噬和脂肪从头合成基因(Hmgcs2,Cpt1,Acox1,Ehhadh,Acsl1,Peci,Cyp4a10,Cyp4a12;UNC51-like kinase 1(Ulk1),Ulk2,Atg5,Atg8,Atg10;Srebplc,Dgat1,Fasn,Scd1)表达水平。Western Blot 和免疫组化法检测 AMPK/mTORC1(AMPK、S6、raptor)及自噬相关蛋白(p62,LC3B,ULK1)表达水平。油红O染色法检测肝脏组织和细胞脂肪沉积。采用14C放射性元素标记法测定FAO速率。mRFP-GFP-LC3B自噬双标腺病毒转染,观察自噬流发生。4.结果(1)与同龄WT小鼠相比,8周龄FNDC5-/-小鼠基础状态下肝脏出现轻度脂肪沉积,禁食后肝脏出现严重脂肪沉积。禁食后FNDC5-/-小鼠血清NEFA、TG以及NEFA水平显着高于WT小鼠。(2)FNDC5-/-小鼠基础状态与禁食后肝脏FAO相关基因表达均低于WT小鼠,AMPK 激动剂(AICAR)和 PPARα激动剂(WY14643)增加 FNDC5-/-小鼠 FAO基因的表达,减少肝脏脂质沉积;AMPK siRNA加重WT和FNDC5-/-小鼠肝脏及肝细胞脂质沉积,表明AMPK/PPARα介导FNDC5对自噬的调控作用。(3)mTORC1抑制剂雷帕霉素(rapamycin)可增加FNDC5-/-小鼠肝脏FAO基因表达,减少FNDC5-/-小鼠肝脏脂肪从头合成基因表达和小鼠肝脏TG含量。(4)饥饿或氨基酸剥夺处理明显减少WT小鼠肝脏和肝细胞自噬蛋白p62表达,增加LC3B蛋白表达以及自噬流的发生,而营养剥夺刺激对FNDC5-/-小鼠自噬作用影响不大。氨基酸剥夺处理或二甲双胍(metformin)可时间依赖性增加WT小鼠肝细胞AMPK、ULK1和raptor磷酸化,但对FNDC5-/-小鼠作用较弱。AMPK激动剂AICAR可增加WT和FNDC5-/-小鼠肝细胞自噬作用,AMPK siRNA减少WT和FNDC5-/-小鼠肝细胞自噬发生。(5)雷帕霉素处理可降下调FNDC5-/-小鼠肝脏和肝细胞中p62蛋白表达,上调LC3B蛋白表达。雷帕霉素处理显着增加WT和FNDC5-/-小鼠肝细胞自噬流发生,减少血清肝脏损伤指标(AST,ALT)水平。雷帕霉素对棕榈酸诱导的小鼠肝细胞脂质沉积的改善作用依赖于自噬基因Atg5。(6)FNDC5-/-/HFD小鼠肝脏质量和肝脏质量/体重比率高于WT/HFD小鼠,而两组小鼠体重和饮食量无差异。FNDC5基因缺失加重HFD诱导引起的肝脏脂质沉积、血清AST、ALT水平上调、FAO基因表达下调和脂肪从头合成基因表达上调。(7)外源性FNDC5时间和剂量依赖性增加小鼠肝细胞FAO基因表达,且在100nmol/L和24h作用达到峰值。外源性FNDC5通过AMPK/mTORC1信号通路减少FNDC5-/-小鼠肝细胞TG含量、促进自噬发生并改善棕榈酸诱导的脂肪沉积。(8)尾静脉注射FNDC5过表达腺病毒通过AMPK/mTORC1信号通路有效增强HFD诱导肥胖小鼠减弱的FAO和自噬,改善肥胖小鼠肝脏脂质沉积。5.结论FNDC5基因缺失小鼠肝脏FAO、自噬作用减弱;脂肪从头合成作用加强,肝脏脂肪变性加强。FNDC5通过AMPK/mTORC1信号通路增加FAO和自噬,减少脂肪从头合成,进而减少肝脏脂肪沉积和损伤。FNDC5可能成为治疗肝脏
朱进[2]2016年在《Glycogen synthase kinase 3β在大鼠脑缺血再灌注损伤过程中的作用及机制研究》文中研究指明背景:氧化应急损伤是脑缺血再灌注病理改变过程中的一个重要组成部分。核转录因子(NF-E2-related factor 2,Nrf2)在这个损伤过程中对神经元起到了保护作用。Glycogen synthase kinase 3β(GSK-3β)被证明能够在中枢神经系统外修饰Nrf2在细胞中的胞浆结合蛋白(Kelch-like epichlorohydrin-associated protein1,Keap1),导致更多Nrf2从细胞核释放到胞浆,引起下游蛋白的一系列变化。从而加重细胞的损伤。但是还没有研究讨论GSK-3β在脑缺血再灌注中是否对中枢神经系统神经元有类似的损伤作用。也没有研究表明,在脑缺血灌注过程中,GSK-3β与Nrf2的相互作用关系。目的:构建氧化应激损伤的体内外模型,从分子、细胞及动物水平探讨GSK-3β在氧化应激损伤中对脑神经元的作用机制和相关信号传导的影响。方法:(1)培养取自新生SD大鼠脑组织的皮质神经元。建立原代神经元氧糖剥夺/复氧(Oxygen-glucose deprivation/reoxygenation,OGD/R)模型。(2)构建GSK-3βRNAi慢病毒载体和GSK-3β过表达慢病毒载体,并感染OGD/R模型。根据是否进行GSK-3β干扰(GSK-3βRNAi)和是否建立OGD/R,进行分组。并加入对照组、vector组(空白质粒转染组)、GSK-3β过表达(GSK-3βoverexpression)组、姜黄素治疗(curcumin-treated)组、vector+氧糖剥夺/复氧(vector+OGD/R)组、GSK-3βRNAi+氧糖剥夺/复氧(GSK-3βRNAi+OGD/R)组、姜黄素治疗+氧糖剥夺/复氧(curcumin-treated+OGD/R)组、轻肌蛋白B治疗+氧糖剥夺/复氧(leptomycin B-treated+OGD/R)组和GSK-3β过表达+轻肌蛋白B治疗+氧糖剥夺/复氧(GSK-3βoverexpression+leptomycin B-treated+OGD/R)组。(3)荧光显微镜下观察各组细胞形态和转染效率,用q RT-PCR检测确定干扰和过表达。(4)采用比色法细胞繁殖定量检测MTS试剂盒和LDH试剂盒检测细胞活性及细胞损伤程度。采用超氧化物歧化酶(superoxide dismutase,SOD)试剂盒和丙二醛(Malondialdehycle,MDA)试剂盒检测神经元的SOD和MDA的水平,分析细胞内氧化应激状态。采用Western Blot及免疫荧光的方法,进一步检测GSK-3β的表达与Nrf2水平之间的关系。(5)建立成年雄性SD大鼠大脑中动脉阻塞模型(middle cerebral artery occlusion,MCAO模型)在动物体内模拟脑缺血再灌注损伤过程。构建化学合成的GSK-3βRNAi片段,于造模前48小时行侧脑室注射。(6)观察在MCAO模型建立后,GSK-3βRNAi对大鼠的神经功能、脑梗死面积、脑组织含水量及梗死灶皮质神经元形态学的影响。通过对比各组大鼠脑组织匀浆中SOD、MDA的水平,评价在大鼠脑缺血再灌注氧化应激损伤中GSK-3β的作用。采用Western Blot及免疫荧光的方法,进一步检测GSK-3β的表达与Nrf2水平之间的关系。结果:GSK-3βRNAi减轻了OGD/R模型中神经元的损伤和减轻了细胞活性。并导致总Nrf2、核Nrf2,以及Nrf2下游蛋白sulfiredoxin1(Srx1)和thioredoxin1(Trx1)的升高。相反的,过表达GSK-3β后,得到相反的结果。脑室内注射GSK-3βsi RNA慢病毒片段能减轻MCAO模型神经功能损伤,减小脑梗塞面积和含水量。提高了MCAO模型脑皮质Nrf2、Srx1和Trx1水平。结论:GSK-3β通过改变Nrf2核内外分布,促进Nrf2转移到胞浆,降低Nrf2及其下游蛋白Srx1和Trx1水平,加重脑缺血再灌注损伤。这些结果为脑卒中的治疗提供了新的思考方向。
张晓建[3]2014年在《中国荷斯坦公牛KATNAL1和GSK3α/β基因的遗传变异及其与精液品质的相关性分析》文中研究指明在现代奶牛群体改良体系中,种公牛是影响奶牛群体遗传品质的主要因素,而繁殖性状是种公牛生产的重要经济性状,是决定种公牛站经济效益的关键因素。公牛的精液品质性状属于低遗传力的数量性状,受多基因调控,通过常规育种手段选育周期长、效率低,迫切需要新的育种技术和手段。分子育种技术已成为世界生物育种科学的发展潮流,而高繁殖力公牛的定向育种则是奶牛育种产业发展的重要方向。根据国内外组学研究和本实验室的基因芯片前期分析结果,结合基因生理生化功能,本研究确定KATNAL1 和 GSK3α/β基因为公牛精液品质性状相关的候选基因。从启动子、可变剪切、miRNA以及SNP等水平上,探求可用于中国荷斯坦种公牛精液品质性状选育的功能性SNPs,并尝试探讨基于这些功能性SNPs的分子调控机理。主要研究结果分述如下：1.中国荷斯坦公牛KATNAL1基因可变剪切体鉴定与表达分析KATNAL1基因在精子发生过程中发挥着重要作用。采用RT-PCR方法初步鉴定KATNAL1基因的不同可变剪切体,并探索其在成年公牛、小公牛的不同组织中的表达规律,采用RT-qPCR方法测定了不同剪切体以及总mRNA在成年公牛和小公牛睾丸中的表达量。结果显示：除了主转录本KATNAL1 (KATNAL1-TV1)之外,新发现一转录本KATNAL1-TV2(登录号为KF709430),该转录本在基因的第二内含子有68bp保留；生物信息学预测发现,新转录本翻译起始位点退后,可翻译364aa的蛋白,并缺少MIT结构域；RT-PCR结果表明,KATNAL1基因nRNA的表达存在组织差异性, KATNAL1,总转录本(KATNAL1-G)在肝脏、肾脏和睾丸组织中高表达,且成年牛高于小牛组织的表达量；qRT-PCR结果表明,成年牛睾丸中的KATNAL1-G、KATNAL1-TV1 和 KATNAL1-TV2达量分别显着高于小牛睾丸组织对应基因的表达量(P<0.05)；成年公牛睾丸中KATNAL1-TV1的表达量显着高于KATNAL1-TV2表达量(P<0.05),但在小牛睾丸中差异不显着(P>0.05),这表明KATNALl mRNA的表达存在有明显的时间特异性。2.中国荷斯坦公牛KATNAL1基因启动子活性分析与功能SNPs鉴定研究发现KATNAL1-TV2启动子区域和保留的的内含子附近区域各有一SNP c.163-210 T>C (rs 836312085) 和 c.323+6655 T>C (rs135559540);生物信息学预测发现：在KATNAL1-TV2启动子区域由于c.163-210 T>C新出现一个DeltaE结合位点,由于c.323+6655 T>C而使保留的内含子近端增加了SRSF1和SRSF2两个剪切因子的结合位点,而这两种变化都可促进KATNAL1-TV2转录本的形成。通过基因克隆、DNA测序和双荧光素酶基因报告系统等技术构建了不同启动子缺失片段的荧光素酶报告载体,转染MLTC-1细胞,测定双荧光素酶活性,鉴定出KLTNAL1的两个启动子的核心区域,并验证了c.163-210 T>C-C可增强启动子活性；分别用Bi-PASA和RFLP两种方式进行SNP基因分型,关联性分析发现,两个位点的CC型个体在精子畸形率上都显着高于其它两种基因型；单倍型组合关联分析发现,H1H1个体精子活力显着高于H1H4、H2H4、 H3H3、H3H4、H4H4 (P<0.05);单倍型组合H1H1个体的精子畸形率显着低于单倍型组合H1H4、H2H4、H3H4和H4H4(P<0.05)。总之,新发现的2个SNP可以作为中国荷斯坦公牛精液品质性状选育潜在的功能性分子标记。3.中国荷斯坦公牛KATNAL1基因3'UTR SNP对bta-miR-22-5p调控靶基因表达的影响成熟miRNAs可按照两种方式(非完全匹配和完全匹配)与靶基因mRNA的3’端非翻译区(3’UTR)的特定序列结合,造成mRNA翻译抑制或降解。本研究利用RT-PCR和克隆测序技术,在牛KATNAL1 mRNA 3-UTR区域检测到*399A>C SNP位点。利用nicroRNA靶标预测软件分析显示bta-miR-22-5p与KATNAL1基因3-UTR野生型和突变型的结合能力不同；分别将AA和CC两种基因型的3’UTR部分片段连入PMIR-ReportTM Luciferase报告载体中,和bta-miR-22-5p真核表达载体共转染MLTC-1细胞,通过双荧光素报告系统检测发现*399 A>C显着降低了与KATNAL1基因3-UTR的结合能力(P<0.05)；RT-qPCR结果显示AA基因型个体KATNAL1基因表达量显着低于AC和CC两种基因型个体(P<0.05)。但是,与之相悖的是,SNP*399 A>C通过关联分析与精液品质性状无关联性。因此,需要进一步研究niRNA的调控机制,并选择更大样本群进行关联分析,以确定该SNP位点能否作为中国荷斯坦公牛精液品质性状选育潜在的功能性分子标记。4.中国荷斯坦公牛GSK3β基因可变剪切体鉴定与基因表达分析可变剪切可以改变基因编码区组成,产生不同的蛋白质,改变基因功能。为初步探索GSK3β基因转录本在公牛睾丸中的表达规律,利用RT-PCR扩增出了含有完整编码框的牛GSK3β的部分cDNA序列,新发现叁种可变剪切体,分别命名为(GSK3β2 (E11b保留)、GSK3β3 (E11缺失)和GSK3β4(E9缺失);利用RT-qPCR技术对GSK3β进行定量分析,发现GSK3β基因的表达在小公牛和成年公牛中存在组织差异性和时间表达特异性,而且GSK3β4在睾丸中是主转录本；通过生物信息学分析,GSK3β基因不同物种间具有高度的同源性和相似的潜在功能,四种转录本C端有差异。这为进一步研究不同转录本在精子发生过程中的作用奠定了一定的基础。5. Pre-miR-320b序列中SNP G12A通过靶向调控GSK3β与中国荷斯坦公牛的鲜精密度存在关联miRNA基因SNP可能影响miRNA的表达水平,导致靶向调控能力的变化,最终造成生物体性状的变化。本研究证实在Pre-miR-320b上存在一个SNP G12A (rs43416688),通过基因分型和关联性分析,发现G12A-AA基因型个体在鲜精密度上显着高于GA基因型个体(P<0.05)；通过多个生物信息学软件预测发现GSK3β基因可能是bta-miR-320b的靶基因；利用mimics. inhibitor、 pre-miR-320b-G、pre-miR-320b-A 和 PMIR-GSK3p-3'UTR克隆表达载体按照不同组合共转染MLTC-1细胞,测定双荧光素酶活性分析发现GSK3β基因是bta-miR-320b的靶基因,而且SNP的等位基因A对于bta-miR-320b的成熟是不利的；通过颈环法RT-qPCR试验检测miRNA的表达发现,mimics 和 inhibitor可以在细胞水平上作为bta-miR-320b的模拟物和抑制剂进行过表达或者抑制表达的研究,而且pre-miR-320b-G加工为成熟的bta-miR-320b 和 pre-miR-320b-A的效率高(P<0.05)；另外,在睾丸组织中,AA基因型成年公牛和小公牛的bta-miR-320b表达要显着低于相对应个体的GA基因型(P<0.05),小牛bta-miR-320b表达显着高于成年表达量(P<0.05),说明pre-miR-320b-GA在体内加工要比pre-miR-320b-AA高效,同时也说明bta-miR-320b的表达有时间差异性；利用RT-qPCR试验检测靶基因GSK3β的表达发现,AA基因型成年公牛和小公牛睾丸中的GSK3β mRNA水平上的表达要显着高于相对应的GA基因型(P<0.05),成年公牛睾丸中GSK3β的表达量要显著高于小公牛(P<0.05)说明睾丸中miR-320b 和GSK3β基因的表达既受G12A的影响,又有时间表达差异性。因此,我们推测SNP G12A对精液品质性状的影响可能由bta-miR-320b通过靶向调控GSK3β的表达来实现。6.中国荷斯坦公牛GSK3α基因核心启动子的分析和功能性SNPs的鉴定启动子作为基因必不可少的元件可以影响基因转录的起始和表达的强度,而基因编码区和内含子上的SNPs可通过不同方式影响基因的表达和功能。本研究利用生物信息学方法预测基因的启动子区,并通过构建不同启动子缺失片段的荧光素酶报告载体,经转染和双荧光素酶活性测定,确定了GSK3α基因的核心启动子区和负调控区域；生物信息学预测发现负调控区域存在c-MYC、USF和YY1等负调控元件,而且GSK3α基因启动子处在一个CpG岛中；不同活力来源精子的GSK3α基因负调控区域DMR甲基化试验表明GSK3α基因启动子都是低甲基化,而且,在负调控元件GATA的CpG位点上,低精子活力个体精子GSK3α甲基化水平显著高于高精子活力个体(P<0.05)；全基因SNP筛选发现g.+4321 A>G和g.+7207 A>G两个SNPs,分别位于第四内含子和第八外显子上,后者为同义突变。经分型和关联分析发现,g.+4321 A>G的3种基因型对精液品质性状无显着影响(P>0.05),g.+7207 A>G-GG基因型个体鲜精活力和冻后活力显着高于AA型个体(P<0.05),单倍型组合H2H2、H2H4和H4H4个体鲜精活力和冻后活力都显着高于其它单倍型组合个体(P<0.05)。因此我们推测GSK3α基因可以通过启动子甲基化差异和功能性SNPs来影响表达和功能,最终影响公牛的精子活力。
李国华[4]2016年在《PI3K-PKB/Akt-GSK-3β信号通路在FGF-2心肌保护中的作用研究》文中研究说明缺血性心脏病是导致人类死亡的重要原因,探索对抗缺血受损心肌的保护方法及其机制是心血管领域的一个研究重点与热点,具有十分重要的理论与应用价值。缺血性心脏病及其术后并发症(如再灌注损伤)存在不同程度的心肌细胞凋亡。心肌细胞凋亡是心肌缺血再灌注损伤(ischemia reperfusion injury,IRI)的主要病理机制之一,它与心肌IRI的发生与发展密切相关。心肌细胞凋亡的数量决定心肌损伤的程度,严重时可引起心功能障碍,甚至心功能衰竭。在缺血再灌注时,通过抑制心肌细胞凋亡可以显着缩小心肌梗死面积和有效减少心功能紊乱的发生。研究表明,成纤维细胞生长因子(Fibroblast growth factors,FGFs)能促进细胞的增殖、迁移,促进血管新生,改善心肌血供,对抗心肌坏死和凋亡,对缺血心肌具有较好的保护作用,可为对抗缺血引起的心肌损伤提供新思路。FGFs是具有22个成员的肝素生长因子家族,其中成纤维细胞生长因子-2(Fibroblast growth factor-2,FGF-2,又称碱性成纤维细胞生长因子(Basic Fibroblast growth factor,b FGF))的作用倍受关注。FGF-2是多功能生长因子,能促进细胞增殖、分化和迁移,具有强大的促血管新生作用。研究表明,FGF-2是一种重要的内源性细胞保护物质,具有明显的心肌保护作用。本课题组和其他研究者的实验表明,FGF-2对缺血心肌的保护作用与其结合FGF受体1(FGFR1),激活蛋白激酶C(protein kinase C,PKC)及丝裂原活化蛋白激酶(mitogen activated protein kinases,MAPKs)等细胞内信号通路相关。但PKC和MAPKs种类的多样性及其亚类功能的不一致性使得这两类蛋白激酶在介导FGF-2引起的心肌保护作用中情况变的复杂,而且FGF-2的心肌保护效应也难以完全用PKC、MAPKs的激活来解释。因此,寻找FGF-2心肌保护作用的其它机制显得十分必要和重要。糖原合成酶激酶-3(glycogen synthase kinase-3,GSK-3)是一种在体内广泛表达的多功能丝/苏氨酸蛋白激酶。GSK-3可分布在细胞质基质、线粒体和细胞核,而线粒体和细胞核中GSK-3活性要比细胞胞浆中的更高。人的GSK-3具有GSK-3α和GSK-3β2个亚型。GSK-3α/β分别存在与其功能密切相关的2个非常重要的磷酸化位点——Tyr279/Tyr 216和Ser21/Ser9。在细胞静息状态时,以Tyr279/Tyr216磷酸化为主,使GSK-3α/β保持激活状态,如Ser21/Ser9发生磷酸化,则抑制GSK-3α/β活性。大量的研究显示,GSK-3β在心肌保护中具有非常重要的意义。各类具有心肌保护作用的信号通路汇聚于GSK-3β,使GSK-3βSer9磷酸化,抑制GSK-3β活性,从而缩小心肌梗死面积,拮抗心肌细胞凋亡,改善心功能,对抗心率失常,发挥心肌保护作用。酪氨酸激酶受体FGFR1激活后,通常会激活PLC-PKC,Ras-MAPKs和PI3K-PKB/Akt信号通路。研究表明,PI3K-Akt/PKB-GSK-3β信号通路在心肌保护中扮演重要角色。心肌缺血预处理(Ischemic preconditioning,IPC)、心肌缺血后处理(Ischemic postconditioning,IPost C)、硫化氢及一些药物的抗心肌缺血再灌注损伤(ischemia reperfusion injury,IRI)作用都与激活PI3K-PKB/Akt-GSK-3β信号通路有关。文献表明:FGF-2可以通过激活PI3K-PKB/Akt-GSK-3β信号通路,拮抗慢性内质网应激所诱导的神经细胞凋亡;促进人胚神经干细胞向运动神经元细胞分化;使前列腺癌细胞发生上皮细胞间质转型(epithelial-mesenchymal transitions,EMT)。PI3K-PKB/Akt-GSK-3β信号通路能否介导FGF-2的心肌保护作用?目前不清楚。因此,本研究提出“FGF-2可能通过激活PI3K-PKB/Akt-GSK-3β信号通路发挥心肌保护作用”的科学假设。为验证这一假设,首先采用大鼠离体心脏缺血/再灌损伤模型和心肌细胞缺氧/复氧损伤模型,观察FGF-2对心肌梗死面积、心功能和心肌细胞凋亡的影响及PI3K-PKB/Akt-GSK-3β信号通路的变化;然后采用心肌细胞缺氧/复氧损伤模型,探索GSK-3β如何介导FGF-2抗心肌细胞凋亡的作用。通过这些研究,旨在揭示FGF-2心肌保护作用的新机制和新途径,进一步阐明这一重要的内源性细胞保护物质的生理与病理意义,为缺血性心脏病的治疗提供新思路和新的干预环节。第一部分FGF-2心肌保护作用的新机制探索:PI3K-PKB/Akt-GSK-3β信号通路的作用目的:探索PI3K-PKB/Akt-GSK-3β信号通路在FGF-2心肌保护中的作用方法:1.观察PI3K-PKB/Akt-GSK-3β信号通路在FGF-2对抗大鼠离体心脏IRI的作用。利用Langendorff心脏灌流系统建立大鼠离体心脏缺血再灌注损伤(IRI)模型,47只SD大鼠随机分为7组,每组6~7只:(1)缺血再灌注组(I/R):K-H液灌流平衡30min,接着K-H液再灌流5分钟,停灌30分钟,复灌60分钟;(2)I/R+LY294002组(LY294002):在I/R的基础上,在停灌前5分钟和复灌的全程使用含有15μM的PI3K特异性抑制剂LY294002 K-H液灌流;(3)I/R+SH-5组(SH-5):在I/R的基础上,给予含有10μM PKB/Akt抑制剂SH-5的K-H液灌流,SH-5的使用方式与LY294002相同;(4)I/R+SB216763组(SB216763):在I/R的基础上,在再灌注前5分钟和整个再灌注内给予含有3μM GSK-3β抑制剂SB216763的K-H液灌流;(5)I/R+FGF-2组(FGF-2):在I/R的基础上,在复灌最初10分钟给予含有FGF-2(10μg/heart)K-H液灌流;(6)I/R+FGF-2+LY294002组(FGF-2+LY294002):FGF-2与LY294002分别按FGF-2组和LY294002组的方式与剂量给与;(7)I/R+FGF-2+SH-5组(FGF-2+SH-5):FGF-2与SH-5分别按FGF-2组和SH-5组的方式与剂量给与。采用1%氯化叁苯基四氯唑(TTC)染色检测心肌梗死面积;全自动生化分析仪测定冠脉流出液LDH活性;生物信息采集系统记录左心室收缩压(LVSP)、左心室舒张压(LVDP)、左室内压最大变化速率(±dp/dtmax);TUNEL结合DAPI染色检测心肌组织细胞凋亡情况;Western blot检测各组Akt、p-Akt(Ser 473)、GSK-3β和p-GSK-3β(Ser9)蛋白水平。2.观察PI3K-PKB/Akt-GSK-3β信号通路在FGF-2对抗心肌细胞缺氧/复氧(hypoxia/reoxygenation,H/R)损伤的作用。(1)观察FGF-2对正常心肌细胞Akt和GSK-3β活性的影响。用10 ng/ml FGF-2分别处理H9c2心肌细胞0、5、10、20、30、60分钟,采用Western blot检测Akt、p-Akt(Ser 473)、GSK-3β和p-GSK-3β(Ser9)蛋白表达。(2)观察H/R对心肌细胞损伤及Akt与GSK-3β活性的影响。首先将体外培养的H9c2心肌细胞随机分为:(1)正常组;(2)缺氧90分钟组;(3)缺氧90分钟,复氧120分钟组。采用CCK-8比色法检测心肌细胞存活率。然后将H9c2心肌细胞依次缺氧0、0.5、1、2小时,在缺氧2小时的基础上,再依次复氧0.5、1、2、12和24小时,Western blot分别检测Akt、p-Akt、GSK-3β和p-GSK-3β的表达水平。(3)观察FGF-2对H/R心肌细胞损伤及Akt与GSK-3β活性的影响。H9c2心肌细胞随机分为:(1)正常组;(2)H/R组;(3)H/R+FGF-2组。采用CCK-8比色法检测心肌细胞存活率;流式细胞术和TUNEL检测心肌细胞凋亡率;Western blot分别检测Akt、p-Akt、GSK-3β和p-GSK-3β的表达水平。(4)观察PI3K-PKB/Akt-GSK-3β信号通路在FGF-2对抗H/R所诱导心肌细胞损伤的作用。首先,将体外培养的H9c2心肌细胞随机分为:(1)正常组(Control);(2)H/R组;(3)H/R+FGF-2组(FGF-2);(4)H/R+FGF-2+LY294002组(FGF-2+LY294002);(5)H/R+FGF-2+SH-5组(FGF-2+SH-5)。以含10ng/ml FGF-2的DMEM培养液培养心肌细胞30分钟后,缺氧90分钟,复氧120分钟,其中10μmol/L LY294002或5μmol/L SH-5在缺氧前1小时加入。复氧结束后,采用CCK-8比色法检测心肌细胞存活率;TUNEL和流式细胞术检测心肌细胞凋亡;采用Western blot检测Akt、p-Akt、GSK-3β和p-GSK-3β蛋白表达。然后,观察GSK-3β-WT、具有较高激酶活性的GSK-3β-S9A突变体和激酶活性丧失的GSK-3β-K85R突变体对心肌细胞GSK-3β和p-GSK-3β蛋白表达的影响。将V5Tag标记的pc DNA3/GSK-3β-WT、pc DNA3/GSK-3β-S9A、pc DNA3/GSK-3β-K85R质粒扩增,抽提和测序。接着将pc DNA3/GSK-3β-WT、pc DNA3/GSK-3β-S9A和pc DNA3/GSK-3β-K85R分别转染心肌细胞。质粒成功转染48小时后,采用Western blot检测各组细胞V5Tag的表达水平。随后实验分组:(1)空白对照组(Con);(2)空载体组(Vec);(3)GSK-3β-WT组(WT);(4)GSK-3β-S9A组(S9A);(5)GSK-3β-K85R组(K85R)。采用Western blot方法检测GSK-3β和p-GSK-3β(Ser9)蛋白表达。最后,观察FGF-2对H/R心肌细胞中凋亡相关蛋白的影响。将GSK-3β-WT、GSK-3β-S9A突变体和GSK-3β-K85R突变体成功转染心肌细胞,实验分组:(1)正常组(Control);(2)H/R组;(3)H/R+GSK-3β-K85R组(H/R+K85R);(4)H/R+GSK-3β-S9A组(H/R+S9A);(5)H/R+FGF-2组;(6)H/R+GSK-3β-S9A+FGF-2组(H/R+S9A+FGF-2)。采用Western blot检测细胞胞浆和线粒体中Bax蛋白表达,Bcl-2、32KD Caspase-3和17KD Caspase-3蛋白表达。结果:1.离体心脏灌流研究发现,在复灌时给予FGF-2,心肌梗死面积较缺血再灌注组减少42.3%(P<0.01),冠脉流出液中LDH活性降低32.8%(P<0.01),LVSP增加25.8%,LVDP增加38.5%,±dp/dtmax绝对值分别增加35.9%和52.0%(均P<0.01),心肌细胞AI(apoptosis index)降低52.3%(P<0.01),p-Akt/Akt、p-GSK-3β/GSK-3β比值分别增加112.5%和112.1%(均P<0.01)。PI3K特异性抑制剂LY294002和PKB/Akt抑制剂SH-5可以对抗FGF-2的心肌保护作用,FGF-2+LY294002组心肌梗死面积较FGF-2组增加40.2%(P<0.05),冠脉流出液中LDH活性增加25.6%(P<0.05),LVSP降低12.6%,LVDP降低17.2%,±dp/dtmax绝对值分别降低13.9%和22.4%(均P<0.05),p-Akt/Akt、p-GSK-3β/GSK-3β比值分别下降27.7%和27%(均P<0.05);FGF-2+SH-5组心肌梗死面积较FGF-2组增加29.5%(P<0.05),冠脉流出液中LDH活性升高20.0%(P<0.05),LVSP降低10.1%,LVDP降低13.4%,±dp/dtmax绝对值分别下降9.9%和17.5%(均P<0.05),p-Akt/Akt、p-GSK-3β/GSK-3β比值分别降低19.2%和20.3%(均P<0.05)。在复灌时给予GSK3β抑制剂SB216763,心肌梗死面积较缺血再灌注组减少43.6%(P<0.01),冠脉流出液中LDH活性降低41.1%(P<0.01),LVSP增加29.9%,LVDP增加46.6%,±dp/dtmax绝对值分别增加40.7%和58.7%(均P<0.01),p-GSK-3β/GSK-3β比值增加129.2%(P<0.01)。与缺血再灌注组相比,LY294002组和SH-5组心功能、心肌梗死面积、冠脉流出液中LDH活性、p-Akt/Akt、p-GSK-3β/GSK-3β比值变化无显著差异(均P>0.05)。2.缺氧和H/R可以抑制心肌细胞活力(与正常组相比,P<0.01)。FGF-2可以明显提高H/R心肌细胞存活率,拮抗H/R所诱导心肌细胞凋亡(与H/R组相比,所有P<0.05);LY294002和SH-5可以对抗FGF-2的以上作用(与FGF-2组相比,所有P<0.05)。3.在正常心肌细胞研究发现,FGF-2可以动态调节心肌细胞Akt和GSK-3β的活性;缺氧可以短暂性激活Akt,H/R先激活后抑制Akt的活性;缺氧可以短暂性抑制GSK-3β的活性,H/R先抑制后激活GSK-3β;FGF-2显着促进H/R心肌细胞p-Akt和p-GSK-3β蛋白表达(与H/R组相比,所有P<0.01),其作用能被LY294002或SH-5拮抗(与FGF-2组相比,所有P<0.05)。4.测序结果显示,GSK-3β-WT基因序列是正确的,GSK-3β-S9A突变体的9位丝氨酸确实被丙氨酸取代,GSK-3β-K85R突变体的85位赖氨酸确实被精氨酸取代;本实验所采用的方法可以将GSK-3β-WT、GSK-3β-S9A和GSK-3β-K85R有效转染心肌细胞;GSK-3β-WT组、GSK-3β-S9A组和GSK-3β-K85R组p-GSK-3β/GSK-3β比值明显降低,以GSK-3β-S9A组最低(与空白对照组相比,P<0.05)。5.H/R促进Bax由细胞胞浆转入线粒体,激活Caspase-3及抑制Bcl-2蛋白的表达(与正常组相比,P<0.05);FGF-2和GSK-3β-K85R突变体可以抑制H/R的以上作用(与H/R组相比,P<0.05);GSK-3β-S9A突变体可以逆转FGF-2对H/R的抑制作用(与H/R+FGF-2组相比,P<0.05)。结论:1.FGF-2能拮抗大鼠心肌I/R损伤和心肌细胞H/R损伤,具有良好的心肌保护作用;2.PI3K-PKB/Akt-GSK-3β信号通路的激活介导FGF-2拮抗的大鼠心肌I/R损伤和心肌细胞H/R损伤,是FGF-2心肌保护作用新的分子机制。第二部分线粒体GSK-3β蛋白Ser9的磷酸化在FGF-2抗心肌细胞凋亡中的作用目的:探索GSK-3β介导FGF-2抗心肌细胞凋亡的机制。方法:1.观察GSK-3β在H/R心肌细胞凋亡中的作用。H9c2心肌细胞随机分为:(1)正常组(Normal);(2)H/R组;(3)H/R+Control si RNA组(Control si RNA);(4)H/R+GSK-3βsi RNA组(GSK-3βsi RNA);(5)H/R+SB216763组(SB216763)。心肌细胞成功转染GSK-3βsi RNA 48小时后或预孵育3μM GSK3β选择性抑制剂SB216763 30分钟后,接着缺氧90分钟,复氧120分钟。复氧结束后,采用TUNEL结合DAPI染色检测各组心肌细胞凋亡情况。2.观察GSK-3β蛋白Ser9的磷酸化在FGF-2对抗H/R心肌细胞凋亡中的作用。将GSK-3β-S9A和GSK-3β-K85R质粒成功转染心肌细胞,实验分组:(1)正常组(Normal);(2)H/R组;(3)H/R+GSK-3β-K85R组(GSK-3β-K85R);(4)H/R+GSK-3β-S9A组(GSK-3β-S9A);(5)H/R+FGF-2组(FGF-2);(6)H/R+GSK-3β-S9A+FGF-2组(GSK-3β-S9A+FGF-2)。采用TUNEL结合DAPI染色检测各组心肌细胞凋亡情况。3.观察FGF-2对线粒体p-GSK-3β(Ser9)蛋白表达的影响。首先,观察FGF-2对细胞GSK-3β蛋白表达的影响。心肌细胞随机分为:(1)正常组(Vehicle);(2)FGF-2组。采用免疫荧光检测GSK-3β蛋白表达。接着,观察FGF-2对细胞p-GSK-3β(Ser9)蛋白表达的影响。心肌细胞随机分为:(1)正常组(Vehicle);(2)LY294002组;(3)FGF-2组;(4)FGF-2+LY294002组。采用免疫荧光检测p-GSK-3β(Ser9)蛋白表达。最后,观察FGF-2对线粒体和细胞胞浆GSK-3β和p-GSK-3β(Ser9)蛋白表达的影响。心肌细胞随机分为:(1)正常组(Vehicle);(2)FGF-2组。采用Western blot检测线粒体和细胞胞浆中GSK-3β和p-GSK-3β(Ser9)蛋白表达。4.观察GSK-3βsi RNA对H/R心肌细胞凋亡相关蛋白表达的影响。H9c2心肌细胞随机分为:(1)正常组;(2)H/R组;(3)H/R+GSK-3βsi RNA组。采用Western blot检测Bcl-2、细胞胞浆和线粒体Bax蛋白表达。结果:1.GSK-3βsi RNA和SB216763可以拮抗H/R心肌细胞凋亡(与H/R组相比,P<0.05)。2.FGF-2和GSK-3β-K85R突变体抑制心肌细胞凋亡(与H/R组相比,P<0.05),GSK-3β-S9A突变体逆转FGF-2对H/R心肌细胞凋亡的抑制作用(与H/R+FGF-2组相比,P<0.05)。3.FGF-2对心肌细胞GSK-3β蛋白表达无影响,FGF-2促进心肌细胞p-GSK-3β(Ser9)蛋白表达,而且主要以线粒体p-GSK-3β(Ser9)表达为主。4.GSK-3βsi RNA可以减轻H/R对Bcl-2蛋白表达的抑制作用,阻止Bax由细胞胞浆转入线粒体(与H/R组相比,P<0.05)。结论:1.线粒体GSK-3β蛋白Ser9的磷酸化在FGF-2抗心肌细胞凋亡中
何金杰[5]2017年在《OLA1抑制GSK-3β的活性维持小鼠脂肪含量稳定》文中进行了进一步梳理研究目的:Obg-likeATPase 1(OLA1)是一种GTP酶,属于TRAFAC(翻译因子相关)类,Obg-HfIX超家族中的YchF亚群,具有水解GTP和ATP的活性,结合核糖体调节蛋白质翻译,在细胞信号转导、胞内运输、细胞应激及胚胎发育中起着重要作用。本课题组前期研究表明OLA1缺失可以引起小鼠不全性围生期死亡,仅约20%Ola1-/-小鼠得以存活,而这些小鼠成年后表现为"个头小"。本研究拟进一步分析并寻找成年小鼠"个头小"的原因,并通过建立组织特异性敲除小鼠的模型以便研究OLA1在特定组织器官中的功能。研究内容和方法:采用基因捕获及Cre-loxP技术分别建立Ola1基因全身及组织特异性敲除的小鼠(Ola1-/-、AKO),以野生型小鼠(Ola1+/+)为对照,观察基础状态及饮食诱导下小鼠表型的变化。采用原代培养方法建立小鼠胚胎成纤维细胞系(MEF),并用反相蛋白芯片技术(Reverse Phase Protein Assay,RPPA)从中筛选与OLA1相互作用的蛋白。结合Ola1-/-小鼠表型以及RPPA结果,筛选出相关分子并于细胞、组织水平验证。随后,我们将对OLA1调节相关靶蛋白功能的分子机制进行初步的探索。研究结果:前期我们课题组已经报道了Ola1全身敲除小鼠表现为胚胎发育迟缓及围生期高致死率,表明OLA1在生长发育中的重要作用。通过对成年小鼠的进一步分析发现:相比于野生型小鼠,Ola1-/-小鼠仍表现为体型减小,各器官组织成比例减小,但脂肪组织减少更明显,尤其是白色脂肪组织,呈现明显"瘦"的表型。那么引起Ola1-/-小鼠白色脂肪组织减少的原因是OLA1影响了脂肪组织代谢,抑或是其他?于是我们从两个方面进行了验证。首先,我们采用Cre-loxp技术构建了Ola1基因脂肪组织特异性敲除(Adipose Tissue Specific Knockout,AKO)小鼠模型。与其对应野生型小鼠相比,在普通饮食及高脂饮食诱导下,AKO小鼠脂肪组织含量及相关代谢指标与野生型小鼠相比均无明显差异。这些结果表明OLA1不直接影响脂肪组织的代谢相关功能如脂肪组织新生,脂肪组织OLA1缺失不影响小鼠脂肪含量。另一方面,通过间接能量消耗测定、进食监测及小鼠认知行为相关实验,我们发现Ola1-/-小鼠能量消耗增加,进食减少,自主活动明显增加,认知记忆能力下降。据此,我们认为Ola1-/-小鼠脂肪组织含量减少的原因在于自主活动增加、进食减少所致的全身能量消耗增加。接着,我们利用RPPA技术比较了 Ola1+/+与Olal-/-MEF细胞中蛋白的差异性表达,发现GSK-3β的表达及活性在Ola1-/-MEF中明显增高。随后应用western blotting我们验证了在OLA1缺失或下调的细胞中及胚胎组织中GSK-3β蛋白水平及活性增高。同时IHC结果表明Ola1-/-小鼠的胚胎及成年脑组织中GSK-3β亦增高。Ola1-/-小鼠脑中GSK-3β表达及活性增高可以导致其自主活动增加,进食减少,使全身能量代谢失衡,作为能量储存载体的脂肪组织含量减少。随后我们以MEF细胞为基本工具,应用qRT-PCR、polysome profiling分别从转录水平、翻译水平研究了 OLA1对GSK-3β表达的调控,并结合放线菌酮追踪试验(CHX Chase Assay)评估OLA1对GSK-3β蛋白稳定性的影响,结果提示OLA1缺失后GSK-3β蛋白质稳定性增加进而引起蛋白水平上调。进一步,体外激酶抑制试验显示OLA1可以直接抑制GSK-3β的活性;免疫共沉淀结果表明OLA1和GSK-3β之间有直接的结合作用。综上所述,我们的研究首次阐明OLA1作为一种GTP酶,可以通过直接的相互作用促进GSK-3β的降解并抑制其活性。结论与创新1.在前期本课题组所报道的全身性Olaal基因敲除小鼠表型的基础上,本研究进一步发现了成年Ola1-/-小鼠的表型特征:作为能量存储载体的脂肪组织含量减少,呈现出明显"瘦"的体型。2.本研究成功构建了 floxed Ola1 E2小鼠品系(Ola1f/-),为研究Olal基因在特定组织器官背景下的功能提供了基础,并且构建了脂肪组织特异性敲除小鼠品系——AKO小鼠。AKO小鼠表现为正常的围生期存活率,没有生长发育迟缓。AKO小鼠在普通饮食和高脂饮食诱导后,均未表现出脂肪组织含量的变化。这些结果表明OLA1在脂肪组织相关代谢过程中没有直接的作用。3.本研究发现GSK-3β是OLA1作用的靶蛋白之一。OLA1可通过以下两种机制调节GSK-3β的活性:调节GSK-3β的稳定性影响其总蛋白水平;直接和GSK-3β相互作用抑制其激酶活性。通过阐明Ola1-/-小鼠脑中GSK-3β活性过度升高而导致其自发活动增加,进食减少,全身能量消耗增加,从而发现了 OLA1在机体能量代谢平衡中的间接作用。4.本研究进一步为OLA1在肿瘤中的研究提供了基础。GSK-3β参与许多信号通路如Wnt信号通路从而,而Wnt信号通路与多种肿瘤相关如结直肠癌等。因此,GSK-3β可作为桥梁为研究OLA1与其他相关肿瘤发生发展的关系奠定基础。
吴建军, 王顺春[6]2018年在《治疗2型糖尿病新靶点——糖原合成酶激酶3及其抑制剂的研究进展》文中研究指明糖原合成酶激酶3(GSK-3)是一种表达于多种组织的多功能丝氨酸/苏氨酸类蛋白激酶,涉及体内多种细胞信号转导途径。更多研究证实,GSK-3的活性异常在T2DM的发生发展中扮演重要角色,多种GSK-3抑制剂在T2DM模型上表现出显着的抗糖尿病作用,作为治疗T2DM的新靶点正成为研究热门领域。本文就GSK-3的生物学特征、与T2DM的关系以及GSK-3抑制剂的最新研究进展做一综述。
李媛媛[7]2007年在《商陆皂苷甲抗炎免疫作用相关基因GSK3β和PIN的功能研究》文中提出商陆皂甙甲(Esculentoside A,EsA)是中药商陆中含量最高的皂苷。近二十多年的研究表明EsA具有广泛的药理作用。前期研究发现商陆皂甙甲有显着的抗炎免疫作用,EsA能抑制淋巴细胞和巨噬细胞释放多种细胞因子和介质,如白介素-1(Interleukin -1,IL-1)、白介素-2(Interleukin -2,IL-2)、白介素-6(Interleukin -6,IL-6)、肿瘤坏死因子(Tumor necrosis factor,TNF)、前列腺素E2(Prostaglandin E2, PGE2)、血小板活化因子(Platelet activating factor, PAF)、免疫反应性纤维结合素(Immunoreactive fibronectin-γ,IFN-γ)和一氧化氮(Nitric Oxide,NO)等,而这些因子在炎症和免疫反应中都起到重要的作用。同时,EsA能够抑制巨噬细胞的吞噬作用,并对小鼠的自身免疫性疾病有作用。基因芯片结果显示EsA可能通过对NO、金属蛋白酶、转化生长因子-β(Transforming growth factor,TGF-β)、免疫亲和素等相关的基因靶群的调节而起抗炎及免疫调节作用。糖原合酶激酶-3β(Glycogen synthase kinase 3β,GSK3β)是一种使糖原合成酶磷酸化的多功能的丝氨酸/苏氨酸激酶,能调节许多细胞功能,包括细胞的生长,代谢,基因转录,蛋白翻译,细胞骨架组构、细胞周期进程以及细胞的脱噬作用等。最近研究发现GSK3β还能调控炎症过程,可能与老年性痴呆、糖尿病和肿瘤等疾病有关。此外,GSK3β还参与白介素-10(Interleukin -10,IL-10)和TNF等多种细胞因子和炎症介质表达的调节。Nitric oxide (NO)在心血管,免疫以及神经系统中是一个重要的信使分子, PIN可与NO合酶NOS特异性的结合,此外研究发现PIN与细胞骨架蛋白LC8为同一物质,能与转录调节子IκB,促细胞凋亡的Bcl-2家族蛋白Bim等相互作用,来调节许多细胞功能,包括细胞周期的调控,细胞的脱噬作用以及细胞极性的维持。本研究从ESA抗炎免疫调节作用相关基因靶群中挑选了glycogen synthase kinase 3 beta (GSK3β,AF156099)和protein inhibitor of nitric oxide synthase (PIN,AF020185)两条生物学功能尚不十分清楚的基因,克隆GSK3β和PIN全长cDNA,构建表达载体,然后转染小鼠巨噬细胞系RAW264.7,研究GSK3β和PIN高表达对小鼠巨噬细胞功能的影响,包括巨噬细胞吞噬功能、细胞因子(IL-1、IL-6、TNF)和炎症介质NO释放,从而证明其在炎症和免疫中的作用。主要研究结果如下:(1)构建了pcDNA3.1-GSK3β和pcDNA3.1-PIN真核表达载体,脂质体转染小鼠巨噬细胞RAW264.7,G418筛选获得GSK3β和PIN高表达细胞系;采用Western Blot方法验证发现,RAW264.7细胞转染pcDNA3.1-GSK3β后GSK3β表达显著高于细胞转染pcDNA3.1质粒对照。(2)采用中性红染色法测定GSK3β和PIN高表达的巨噬细胞的吞噬功能,结果显示高表达GSK3β和PIN能够抑制RAW264.7细胞吞噬功能;(3)采用Griess法测定GSK3β和PIN高表达的巨噬细胞的上清中一氧化氮(NO)含量,结果显示高表达GSK3β和PIN能够显着抑制LPS刺激RAW264.7细胞产生NO;(4)采用结晶紫染色法测定GSK3β和PIN高表达的巨噬细胞的上清中的肿瘤坏死因子(TNF)活性,结果显示高表达GSK3β和PIN能够显着促进LPS刺激RAW264.7细胞产生TNF;(5)采用Western Blot方法,分析GSK3β和PIN高表达的巨噬细胞中相关抗炎免疫因子IL-1,IL-6的蛋白表达的变化,结果显示GSK3β和PIN高表达显着促进LPS刺激RAW264.7细胞产生IL-6,但对IL-1表达无影响。以上结果表明,高表达GSK3β和PIN能选择性抑制LPS诱导的巨噬细胞吞噬功能和炎症介质NO的产生,促进致炎的细胞因子TNF和IL-6的产生,但对IL-1产生无影响,表明GSK3β和PIN具有调节巨噬细胞参与炎症反应的功能,提示ESA可能通过上调GSK3β和PIN基因表达来发挥抗炎免疫调节作用。
黄宏[8]2017年在《沈敏鹤主任治疗卵巢癌用药规律及复方附苓颗粒干预GSK-3β抑制卵巢癌转移的分子机制研究》文中研究说明目的卵巢癌是女性最常见的恶性肿瘤,在我国,卵巢癌在生殖系统肿瘤发病率中居第叁位,病死率居第一位。中医中药无论在抑制或杀伤肿瘤细胞还是术后调理,减轻放化疗不良反应,提高生活质量等方面,均可发挥重要作用。因此,整理、挖掘和研究历代中医古籍中的诊治理念和学术思想具有非常重要的现代价值。名老中医的学术思想和临证经验是中医药学术特点、理论特质的集中体现。挖掘沈敏鹤主任中医师治疗卵巢癌的用药规律和学术思想,为现代临床治疗卵巢癌提供指导。此外,总结使用频数较高的几味中药,为第叁部分实验研究方药选取提供依据。GSK-3β在肿瘤的发生发展中扮演了非常重要的角色,是潜在的肿瘤治疗靶点。选用沈老师常用的几味中药制成复方制剂,探究其干预GSK-3β抑制卵巢癌转移的分子机制研究,为进一步提高用药的疗效提供实验依据。方法第一部分:采用文献研究法和理论评述法,通过文献挖掘查找,资料的收集、鉴别、整理与研究,以时间为线索,分别从卵巢癌病名溯源与症状描述、证治概况以及病因病机等方面汇总,梳理并总结历代医家、各个时期的认识规律和学术特点。第二部分:纳入沈老师于浙江省中医院2014.1.1至2016.12.31期间门诊诊治卵巢癌患者,通过数据规范化处理,建立数据库,利用Excel2007软件分别对药味数、药物、处方证型,及频数最高的48种药物所属的性味、归经、分类等进行描述性分析。采用SPSS19.0统计分析软件对频数最高的48种药物进行系统聚类分析。第叁部分:经中药制剂室鉴定,制备成复方附苓颗粒。对hey和SKOV3细胞进行细胞培养,通过TGF-beta诱导EMT模型建立。通过抑制体外增值实验、软琼脂实验、细胞衰老实验、划痕实验、Tran swell实验、Western Blot实验观察复方附苓颗粒抑制卵巢癌细胞EMT转移的机制与Akt/GSK-3β信号通路的相关性。结论第一部分:中医学对肿瘤的认识最早可追溯到殷周时代,大多医家认为卵巢癌属于中医学"症瘕""肠覃" "石瘕""积聚"等范畴。先秦两汉时期是中医药体系初步形成的阶段,经典着作如《内经》、《金匾要略》等为后世医家治疗症瘕积聚奠定了基石。魏晋南北朝时期,其发展特点逐渐趋向专科化,王叔和、葛洪等对妇人症瘕作了详细论述。隋唐时期临证医学开始兴盛,医家逐渐重视对单病种的病因病机分析及病证论治,逐渐形成了理论体系。宋代的妇产科已形成为一门独立的临床学科,对妇人症瘕积聚的病因病机、辨证施治及预后等有了较全面的认识。明清时期是中医妇科发展的鼎盛时期,产生了数量相当丰富的妇科学专着。清末至民国时期,涌现了大批中医药期刊和经典专着的重刊,出现了"中西医汇通"的浪潮。新中国成立以后,出现了中西医结合治疗卵巢癌的综合模式。第二部分:沈老师处方精简,药味数多为7-12味。用药频数最多者为甘草,前48种高频药物中涵盖了桂枝茯苓丸、自拟复方附苓汤等,处方证型分布以"虚"证为主。高频药物的药性频数以温性药物为多,药味频数以甘、苦、辛为主,归经频数以脾经为多,药物的分类以补虚药为主。沈老师认为卵巢癌的根本病机为"虚",或夹"寒"、"瘀"、"湿"等,故而临证常用"补益"、"温散"、"活血"、"燥湿"之法,还强调"四时阴阳"、"性味配伍"、"脾胃养护"、"精神调适"、"服药宜忌"等方面。第叁部分:AKT/GSK3β轴不仅与抑制EMT有关,亦是抑增殖、促衰老等生物学功能的调控核心,故而复方附苓颗粒对卵巢癌细胞的多靶点效应可能是通过调控AKT/GSK3β轴来实现的。
Tian, Chunyu, Wang, Ya, La, Xiaojin, Li, Ji'an, Zhang, Biwei[9]2019年在《Spleen-kidney supplementing formula alleviates insulin resistance via regulating AKT/glycogen synthase kinase 3β pathway in rats with type 2 diabetic induced by high-fat diet》文中进行了进一步梳理人源糖原合成酶激酶-3β（Human Glycogen Synthase Kinase-3β）的性质研究及其抑制剂的高通量筛选模型建立
Bo, Zhao, Wen-wei, Gao, Ya-jing, Liu, Meng, Jiang, Lian, Liu[10]2017年在《The role of glycogen synthase kinase 3 beta in brain injury induced by myocardial ischemia/reperfusion injury in a rat model of diabetes mellitus》文中指出人源糖原合成酶激酶-3β（Human Glycogen Synthase Kinase-3β）的性质研究及其抑制剂的高通量筛选模型建立
参考文献：
[1]. FNDC5/Irisin改善肝脏糖脂代谢紊乱的作用及分子机制[D]. 刘桐言. 南京医科大学. 2017
[2]. Glycogen synthase kinase 3β在大鼠脑缺血再灌注损伤过程中的作用及机制研究[D]. 朱进. 重庆医科大学. 2016
[3]. 中国荷斯坦公牛KATNAL1和GSK3α/β基因的遗传变异及其与精液品质的相关性分析[D]. 张晓建. 南京农业大学. 2014
[4]. PI3K-PKB/Akt-GSK-3β信号通路在FGF-2心肌保护中的作用研究[D]. 李国华. 南华大学. 2016
[5]. OLA1抑制GSK-3β的活性维持小鼠脂肪含量稳定[D]. 何金杰. 浙江大学. 2017
[6]. 治疗2型糖尿病新靶点——糖原合成酶激酶3及其抑制剂的研究进展[J]. 吴建军, 王顺春. 中国糖尿病杂志. 2018
[7]. 商陆皂苷甲抗炎免疫作用相关基因GSK3β和PIN的功能研究[D]. 李媛媛. 第二军医大学. 2007
[8]. 沈敏鹤主任治疗卵巢癌用药规律及复方附苓颗粒干预GSK-3β抑制卵巢癌转移的分子机制研究[D]. 黄宏. 浙江中医药大学. 2017
[9]. Spleen-kidney supplementing formula alleviates insulin resistance via regulating AKT/glycogen synthase kinase 3β pathway in rats with type 2 diabetic induced by high-fat diet[J]. Tian, Chunyu, Wang, Ya, La, Xiaojin, Li, Ji'an, Zhang, Biwei. Journal of Traditional Chinese Medicine. 2019
[10]. The role of glycogen synthase kinase 3 beta in brain injury induced by myocardial ischemia/reperfusion injury in a rat model of diabetes mellitus[J]. Bo, Zhao, Wen-wei, Gao, Ya-jing, Liu, Meng, Jiang, Lian, Liu. Neural Regeneration Research. 2017
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