一株海洋假单胞菌的汞抗性及富集行为机制研究

论文摘要

Pseudomonas alcaligenes A1（类产碱假单胞菌）能在Hg2+质量浓度约为120mg/L的海水培养基中正常生长,其生物富集能力约为179.53mg/g。为了探究海洋细菌A1的高汞抗性以及富集行为机制,对该细菌进行了转录组分析。通过注释分析后发现,相对于无Hg2+胁迫下生长的A10,在Hg2+胁迫下生长的A11共有772个基因差异表达显著,包括上调基因663个,下调基因109个。BAGLEAN10002699,BAGLEAN10002700,BAGLEAN10002701,BAGLEA N10002702均为表达差异倍数较大且与汞抗性相关的功能基因,通过blast程序比对后发现,以上四个基因分别为merA,merP,merT,merR基因,均为汞操纵子上的关键功能基因,分别编码汞还原酶MerA、汞周质结合转运蛋白MerP、汞转运蛋白MerT以及汞调节蛋白MerR。其中merT,merP具有三个完整的重复拷贝,而merA,merR只有一个完整的重复拷贝。通过实时荧光定量反转录PCR技术检测merT,merP,merA,发现在不同汞离子水平下的转录水平为:merP>merT>merA。为了从细胞层面进一步研究海洋细菌A1的汞抗性以及富集行为机制,我们利用基因工程技术将目的基因定向克隆至pRSFDuet-1以及pACYCDuet-1质粒,并转化至宿主细胞E.coli BL21（DE3）中表达,成功构建了TP、TPA和A重组菌。通过分析抗性生长曲线发现,对照组E.coli BL21仅能在2mg/L Hg2+的LB培养基中生长,而重组菌TP、TPA、A具有一定的抗汞能力,分别最高能在60,40,20mg/L Hg2+的LB培养基中生长,但随着Hg2+浓度的增加,抗性菌株的迟缓期均不同程度地延长。三种重组菌TP、TPA、A与对照组E.coli BL21对Hg2+的平衡富集量分别为110.48mg/g,94.49mg/g,83.76mg/g和82.29mg/g。综上所述,海洋细菌A1可能主要通过merT和merP两个功能基因实现对汞的抗性以及富集功能。本研究对A1细菌的汞抗性以及富集行为机制所进行的探索将为海洋环境中重金属污染的生物治理奠定实验基础。

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摘要

Abstract

第1章文献综述

1.1 海洋环境重金属污染的研究概述

1.1.1 重金属污染及其危害

1.1.2 海洋重金属污染

1.2 微生物对于重金属的吸附与抗性机制

1.2.1 细胞外部

1.2.2 细胞表面

1.2.3 细胞内部

1.2.4 重金属抗性相关操纵子的研究

1.3 假单胞菌对于重金属生物修复的研究进展

1.4 研究内容、意义和创新点

1.4.1 研究内容

1.4.2 研究意义

1.4.3 创新点

第2章转录组学分析和实时荧光定量反转录PCR

2.1 引言

2.2 材料、试剂盒和仪器

2.2.1 菌株

2.2.2 人工海水的配制

2.2.3 培养基和试剂

2.2.4 实验仪器

2.3 实验方法

2.3.1 菌体的培养以及RNA的提取与鉴定

2.3.2 测序数据处理

2.3.3 差异表达基因分析

2.3.4 反转录PCR

2.3.5 绝对定量法实时荧光定量PCR

2.3.6 统计学分析

2.4 结果与分析

2.4.1 转录本组装以及功能注释

2.4.2 差异表达分析

2.4.3 实时荧光定量PCR

2.5 讨论

2.6 小结

第3章功能基因的克隆及重组菌的构建

3.1 引言

3.2 材料、试剂和仪器

3.2.1 实验菌株和载体

3.2.2 培养基

3.2.3 实验试剂

3.2.4 实验仪器

3.2.5 引物设计以及合成

3.3 实验方法

3.3.1 类产碱假单胞菌A1 基因组的提取

3.3.2 pACYCDuet-1,pRSFDuet-1 质粒的提取

3.3.3 目的基因的PCR扩增

3.3.4 重组载体的构建

3.4 结果与分析

3.4.1 编码基因merT,merP,merA的扩增

3.4.2 重组子的验证

3.4.3 测序结果验证

3.5 讨论

3.6 小结

第4章功能基因的验证及汞抗性和富集机制初探

4.1 材料、试剂和仪器

4.1.1 材料

4.1.2 试剂

4.1.3 培养基

4.1.4 主要仪器

4.2 实验方法

2+的生长抗性'> 4.2.1 重组菌对Hg²⁺的生长抗性

4.2.2 菌体制备

2+的平衡富集'> 4.2.3 重组菌对Hg²⁺的平衡富集

4.3 结果与分析

2+的抗性曲线'> 4.3.1 重组菌对于Hg²⁺的抗性曲线

2+的富集'> 4.3.2 重组菌对于Hg²⁺的富集

4.4 讨论

4.5 小结

第5章结论

5.1 主要结论

参考文献

附录

致谢

攻读硕士学位期间的研究成果

文章来源

类型: 硕士论文

作者: 凌文康

导师: 邓旭

关键词: 基因工程,转录组,转运蛋白,抗性机制,富集行为

来源: 深圳大学

年度: 2019

分类: 基础科学,工程科技Ⅰ辑

专业: 生物学,海洋学,环境科学与资源利用,环境科学与资源利用

单位: 深圳大学

分类号: X55;X172

总页数: 67

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