秦海明[1]2003年在《新型细胞芯片的构建及初步应用》文中提出前言 近年来，随着后基因组时代的到来，生物芯片技术得到了迅猛发展，而且已经成为现今生物学的关键技术。包括基因芯片、蛋白芯片、细胞芯片在内的不同功能的生物芯片相继问世。基因芯片是一种提取生物分子信息的有力工具，利用基因芯片可大规模进行DNA或RNA信息分析。它不但可以应用于疾病发病机理、功能基因组学等方面的基础研究，还可以用于遗传病检测、感染性疾病检测、肿瘤相关基因检测等多方面的疾病诊断及法庭证物、环境保护、药物筛选等多方面应用。蛋白芯片可以将蛋白质以阵列的方式固定在经化学或生物酶处理的表面上，也可将受体蛋白、抗体等固定在表面上，未知分子可以利用与芯片不同位点亲和力来分析。蛋白芯片可以进行免疫分析，研究蛋白质与蛋白质相互作用。组织芯片技术是美国国家人类基因研究所的Kononen教授等建立的一种新的高产出的芯片技术，它可以将数十个甚至上千个不同个体的临床组织标本按预先设计的顺序排列在一张玻片上进行分析研究，是一种高通量、多样本的分析工具。 人体是由细胞组成的，细胞正常结构和功能的异常，必然导致细胞乃至人体各组织器官的结构和功能的紊乱，并由此引起疾病。要正确认识各类疾病，探讨疾病的病因，以达到治疗和预防目的，显然细胞学在临床医学的研究中是十分重要的。我们设计了一种新型的细胞芯片，其原理是充分利用玻片的硬度高，透明性好的特点，应用细胞膜表面不同的抗原物质，与包被在玻片上的不同抗体发生特异性结合，通过一次实验可以将被测细胞悬液中不同膜表型的细胞分离、固定在同一张玻片的不同特定区域，保持了细胞的完整性及活性，又可通过简单的操作一次将多细胞悬液进行免疫分群。可以按照不同临床需要，设计不同的抗体组合，进一步降低成本，提高疾病的检出率，更好的为广大的病人服务。 材料与方法 将CDZ，CD3，CD4，CDS，CD7，CDS，CDg，CD10，CDlla，CD13，CD14，CD15，CD19，CD20，CD22，CD30，CD33，CD34，C侧，CD44v6，CD45，CD45RA，CD66e，CD68，HLA－DR等抗体按照需要固定于醛基玻片上，形成微阵列，构建出细胞芯片A、细胞芯片B（白血病兔疫分型）和细胞芯片C（淋巴瘤免疫分型）叁种细胞芯片。从 20例健康志愿者、20例淋巴细胞白血病病人 0．5－Illil全血中和20例淋巴瘤病人胸水中分离出的单个核细胞，其中一部分用丫陡橙预染 5 dn，经 PBS洗涤 3次后与细胞芯片杂交，与细胞芯片杂交，形成特异性选择细胞群。将杂交后的细胞芯片进行胎盘兰染色、瑞氏染色、CD3－Cys＋CD4－FITC＋CDS－RPE叁色荧光染色、巴氏染色等并观察结果。 结 果 该芯片能选择性的结合不同免疫表型的细胞。胎盘兰染色显示活细胞数＞95呢；瑞氏染色细胞形态良好，杂交点边缘整齐，背景干净；荧光染色显示特异性良好。急性淋巴细胞白血病病人与健康志愿者的淋巴细胞免疫表型有十分明显的差别人淋巴细胞白血病中 3例 CD3＋、2例 CD4＋、2例 CD7＋和 1例 CDS＋＊淋巴细胞白血病中二例 CD10＋、5例 CD19＋、3例 CD20＋和2例HLA－DR＋，并显示了明显的单克隆增生的恶性肿瘤的性质，符合临床诊断。淋巴瘤病人胸水中有大量幼稚淋巴细胞，其中3例CD3＋、4例 CD4＋，属 T细胞淋巴瘤，3例 CD19＋、7例 CD20＋、3例 CD22＋，属 B细胞淋巴瘤，阳性点上的细胞与非阳性点上细胞无论在细胞数量、细胞大小、形态规则性上都有明显的不同，用显 ·2·微镜观察更是明显。 结 论 众所周知，形态学在细胞学检查中的重要作用是任何一种方法取代不了的。可以看到，我们的细胞芯片所捕获的细胞很均一，纯度高，而且是单层细胞，十分严格的被限定在特异性区域。通过扫描电镜的观察，细胞保存十分完好，能清楚的看到淋巴细胞膜上的皱稻和刺状突起，所以可用于进行更为深人的研究。在一张小小的玻片上可以根据需要排布多种抗体，能将细胞自动分成不同类群。本实验方法所需的细胞数量要比卜dssa的要少得多，因为他的试验样品的细胞在 6 X 10勺L时，很少甚至没有杂交信号被检测到。我们的试验可以使细胞的量减少到 10VL或更少，只要增加摇晃次数就可富集同类细胞。尤其对于象血液、胸腹水等细胞种类很多的细胞悬液，十分有效。即使细胞数量很少，所产生的信号不足以被仪器扫描到时，也可以使用普通光学显微镜直接观察结果。本实验是利用了蛋白质的氨基端（NH＊可与醛基（CHO）发生共价结合，将蛋白质固定在醛基玻片上，在玻片上形成CD抗体微矩阵。我们选用玻片做为载体，使操作简单易行，它的突出优点透明性好，可以用普通光学显微镜直接观察细胞形态，实现了免疫学与形态学相结合。本实验所构建的细胞芯片在白血病免疫分型中应用的优势是十分明显的。急性白血病是一种单克隆增生性疾病，由于某种原因，某一蛋白大量增生。大量异常细胞仅集中在某一抗体点上，而其
许慧[2]2017年在《微流控技术脑肿瘤微环境仿生构建及初步应用》文中研究指明脑微环境是体内一种复杂的、动态的微系统,其功能异常与脑肿瘤的发生、发展和转移密切相关。传统体外模型难以反映体内脑微环境复杂结构和功能特点。本论文以前沿微流控芯片为核心技术,以常见脑肿瘤研究为对象,通过体外多细胞、多成分和多条件因素调控,模拟构建脑肿瘤复杂微环境,研究多种化学因子和生物力学等因素对脑肿瘤侵袭和转移的影响及调控机制,以期为脑肿瘤研究提供一种全新思路,分述如下:一、设计并构建了一系列基于微流控芯片的脑肿瘤微环境仿生新体系,分别用于研究叁维环境下肿瘤血管外渗、肿瘤侵袭和肿瘤脑转移等动态过程,并开展了体外构建复杂叁维动态血脑屏障的方法学研究和抗肿瘤药效评价,为研究脑肿瘤的发生、发展和机制研究奠定了基础。二、利用脑微血管炎症仿生芯片,研究了流体剪切力作用下,肺癌细胞在炎性脑微血管内皮细胞表面的滚动和粘附现象,考察了生物化学因素和机械力学因素对肿瘤细胞外转移的影响,验证了 Rho/ROCK信号通路对肺癌细胞外转移的调控机制,为研究循环肿瘤细胞转移入脑提供了新方法。叁、利用肿瘤侵袭仿生芯片,研究了缺氧条件对脑胶质瘤细胞运动行为的影响,结果证实缺氧条件可促进脑胶质瘤细胞在叁维基质中的侵袭和上皮间质化行为,并且能够促进缺氧诱导因子(HIF)通路下游EMT和血管新生相关基因的表达,提示了缺氧条件通过HIF信号通路促进脑胶质瘤细胞的运动和侵袭,为研究脑肿瘤发展机制提供了新的思路。四、创新性构建体外复杂的叁维动态血脑屏障芯片体系,包含多种脑细胞、叁维基质和流体等多种核心要素,具备近生理条件的结构和功能;在此基础上,研究了复杂脑微环境条件下,肿瘤脑转移和脑胶质瘤发展的动态过程,并考察了多种临床抗肿瘤药物穿越血脑屏障的能力。为体外脑肿瘤微环境的仿生构建和抗肿瘤药物评价提供了新方法,也为探索脑肿瘤的发生机制提供了新思路。
杨国淋[3]2016年在《用于诊断四种禽呼吸道疫病病毒可视化芯片的构建及初步应用》文中指出禽流感、新城疫、鸡传染性支气管炎和传染性喉气管炎是鸡群常见的四种呼吸道疫病。它们的发病症状和剖解病理变化相似,病死率较高,给养鸡业带来严重的经济损失。因此,对于四种疫病的鉴别诊断对防控具有重要意义。本研究是在传统基因芯片技术的基础上结合不对称PCR技术,将生物素标记的不对称PCR扩增产物与寡核苷酸芯片杂交,然后与辣根过氧化物酶(Horseradish Peroxidase,HRP)包被的链霉亲和素反应,用二氨基联苯胺(Diaminobenzidine,DAB)对该杂交体系显色后,阳性信号能够以肉眼可见的棕色斑点呈现。该研究建立的可视化寡核昔酸基因芯片技术可以对禽流感、新城疫、鸡传染性支气管炎和鸡传染性喉气管炎进行同时鉴别诊断,为鸡呼吸道疫病的临床诊断提供了新的技术。1.AIV的NP基因重组质粒的构建及寡核苷酸探针的设计根据Genbank中收录的基因序列,对AIV的保守基因NP,设计一对特异性引物,目的片段的长度为272 bp。以分离株H9为材料提取RNA,经反转录得到cDNA。然后以cDNA为模板,经PCR扩增获得NP基因扩增产物。将所获得的PCR产物经胶回收后与pMD19-T载体连接,然后转化到大肠杆菌DH5a,经PCR扩增和核酸序列测定鉴定,成功克隆出AIV-NP基因的重组质粒；同时成功复苏本实验室前期保存的NDV的F基因、IBV的N基因和ILTV的TK基因的冻干重组质粒菌。以AIV-NP、NDV-F、IBV-N和ILTV-TK靶基因核酸序列片段的正义链为模板,用Oligo7.0软件设计两条寡核苷酸探针,长度为40 bρ左右,Tm值为80℃左右,探针经BLAST分析,确定各探针的特异性良好。2. AIV-NDV-IBV-ILTV共检可视化芯片的构建及条件优化基因芯片的制备：用微阵列芯片喷样系统晶芯(?)Smart ArrayerTM 16在尼龙膜上喷制芯片。喷制前先将尼龙膜在超纯水中浸泡30 mmin待干燥后,将寡核苷酸探针与点样缓冲液充分混合,调整探针到合适浓度后,将探针点制到芯片上,待探针完全固定后,在紫外灯下交联30 min,然后将制备好的芯片在4℃下密封保存。不对称PCR扩增技术：优化生物素标记的上游引物与未标记的下游引物的浓度比例,提高扩增的循环次数,控制模板浓度,用高浓度的琼脂糖凝胶在低电压条件下检测扩增的单链情况。结果表明,在反应体系中当生物素标记的上游引物与下游引物在10：1时,所获单链产物最多。芯片制备与检测技术条件的优化：对芯片制备和芯片检测技术中的各项检测条件进行优化。结果表明：当喷样次数为1次；探针浓度为25 μ M；杂交时间为1 h；杂交温度为50℃；浓度为1.0mg/mL Streptavidin HRP Conjugate稀释2000倍;DAB显色时间为5 min时,芯片检测技术的结果最佳,确立了共检芯片技术检测的标准条件。3. AIV-NDV-IBV-ILTV可视化共检可视化芯片的质量评价本研究对构建的AIV-NDV-IBV-ILTV共检可视化芯片进行了特异性、敏感性和保存期研究。结果表明,本研究所构建的芯片特异性良好；敏感性试验结果显示最低可检测出靶基因浓度为1.0×10-5μ g/μl；随机抽取保存不同时间的3张芯片进行检测,结果该芯片在保存180 d时仍可检测；采用本研究所构建的可视化芯片技术和实验室常规的RT-PCR/PCR技术同时对采自川渝地区的96份临床组织样品进行检测,结果两种方法的检测结果符合率为100%。本研究构建的AIV-NDV-IBV-ILTV共检可视化芯片,为鸡病诊断提供了新的技术。
秦海明, 赵雨杰, 侯伟建, 刘健[4]2002年在《构建新型细胞芯片的初步研究》文中研究表明目的本试验设计了一种全新概念的细胞芯片。利用抗原抗体特异性反应原理,将细胞膜表面标志CD抗原与玻片上固定的CD抗体进行反应,既保持了细胞的完整性及活性,又可以将不同细胞进行分群。方法将CD3,CD4,CD8抗体固定于醛基玻片上,形成微阵列,从全血中分离出的单个核细胞与之杂交,形成选择性细胞群。将细胞芯片进行胎盘兰染色,瑞氏染色,CD3-Cy5+CD4-FITC+CD8-RPE叁色荧光染色并观察结果。结果该芯片能选择性的结合不同免疫表型的细胞。胎盘兰染色显示活细胞数>95%;瑞氏染色细胞形态良好,杂交点边缘整齐,背景干净;荧光染色显示特异性良好。结论本实验所设计的新型细胞芯片初步试验已达到预先要求。能根据细胞表面不同的免疫标志进行细胞分群,可以为以后制作大规模,高通量的细胞芯片做准备,确定了其可行性,并提出了全新意义的细胞芯片模型。
马超[5]2017年在《微流控肝小叶样叁维微组织仿生构筑》文中研究指明肝脏是人体最大的内脏器官,发挥着诸多重要功能,如代谢、合成、免疫和解毒等。肝组织工程,由来自两个方面的需求驱动,在过去的叁十年间经历了快速发展。第一个方面来自临床上肝脏移植。肝移植是治疗终末期肝衰竭等肝脏疾病的唯一的有效手段。然而,肝移植治疗手段受制于肝供体的短缺、移植后的免疫排斥和移植耗费巨大等问题。这些情况使得体外构建功能性肝组织移植体尤为重要。另一方面,当前药物开发过程中,药物诱导肝损伤是难以预料的不良反应,导致药物开发效率低下、成本提升。当前,医药企业依赖于二维肝细胞培养模型和实验动物模型进行体外和体内药物分析。然而,二维细胞模型难以再现体内肝脏的叁维生理微环境;实验动物模型具有工作繁重、耗费巨大、动物福利等问题,且与人体在代谢通路上存在物种差异,获得的结果无法推广到人体试验中。因此,医药企业也迫切寻求优势的体外肝脏模型进行药物肝毒性的临床前预筛选,加快药物筛选进程和提高药物筛选效率。为了满足上述需求,本研究提出并验证了两种基于微流控芯片技术的策略,实现了肝组织体外工程化构筑。简言之:策略一构建了肝小叶样肝脏芯片,并将其应用于药物肝毒性和药物-药物相互作用诱导的不良反应分析;策略二研发了气动辅助微模塑方法,实现了肝小叶样载细胞微凝胶的制备。本研究的完成为体外药物肝毒性分析提供了模型支持,同时也为多尺度的肝组织工程技术的发展提供了新的思路。本论文所得到的研究结果如下:1.本研究利用AutoCAD软件设计了一种模拟肝小叶的多层微流控芯片,并结合光刻技术和多层软蚀刻技术制备了符合设计的仿生微流控芯片。自上而下观察,该芯片具有四层结构,分别为流动层、控制层、支持层和载玻片层。其中,流动层具有细胞培养微腔室,腔室内分布有多重微柱阵列;控制层集成有气动控制系统,用于实现肝细胞和内皮细胞的共定位和区域化接种。通过对芯片加工过程中流动层与控制层的键合时间的探索,本研究制备出了具有结构完整、性能良好、层与层之间紧密粘合的集成仿生微流控芯片。不同压力驱动试验显示18 psi可以实现气动控制系统的成功运行,为后续构建肝小叶样肝脏芯片提供了关键参数。2.本研究通过顺序灌注肝细胞(HepG2)和内皮细胞(Human Aortic Endothelial Cells,HAECs)及程序化操作气动控制系统实现了肝脏芯片的成功构建。共聚焦图像显示,本研究所构建的肝脏芯片具有肝小叶样的组织形态,即HepG2细胞形成的肝细胞索样结构和HAEC细胞形成的肝血窦样结构。肝代谢酶活力分析显示,肝小叶样肝脏芯片具有较高的基础CYP-1A1/2和UGT酶活力,同时动态应答于CYP-1A1/2和UGT酶的诱导剂和抑制剂。药物毒性测试结果显示,肝小叶样肝脏芯片较好地响应于不同药物诱导的肝毒性,提示该芯片具有较高的药物代谢能力。3.应用肝小叶样肝脏芯片,本研究成功地分析了由不同药物组合间的相互作用诱导产生的肝毒性。预先使用可诱导或抑制CYP-1A1/2和UGT酶活力的药物处理肝脏芯片,之后使用另一种药物再次处理,结果显示后施加药物的肝毒性受到了前施加药物的影响。这些结果提示肝小叶样肝脏芯片可以为临床前的药物不良反应分析提供体外肝组织模型。4.作为本论文的另一部分,本研究提出了一种新型的载细胞微凝胶的制备方法,称作气动辅助微模塑(Pneumatic-aided micro-molding,PAM)。气动辅助微模塑利用微流控芯片中预先设计的微阀门实现限制区域内的凝胶固化,进而实现载细胞凝胶的可控制备。应用该方法,本研究实现了具有多种几何形状(叁角形、正方形和圆形)的、包裹不同细胞类型(HepG2细胞、NIH 3T3成纤维细胞和A549细胞)的、不同凝胶种类(胶原、明胶和琼脂)的微凝胶的可控制备。本研究通过调整微阀门的结构设计,实现了微凝胶中单个或多个特定形状微通道的整合以及多个微通道的特定布局。此外,使用微阀门系统实现两步气动辅助微模塑过程,本研究也成功地制备了包裹不同细胞种类的多组分或多区隔化的微凝胶。5.本研究构建了集成有气动辅助微模塑功能的微流控芯片,实现了肝小叶样载细胞微凝胶的制备。形态学观察显示,载细胞微凝胶呈现出肝小叶样的组织形态,即肝细胞(HepG2)为条索状分布,而内皮细胞(Human Umbilical Vein Endothelial Cell-C,HUVEC-C)与肝细胞间隔分布。基于肝小叶样微组织,本研究分析了扑热息痛的肝毒性和谷胱甘肽的肝保护作用。
张莉, 张惠静, 管潇, 曹文轩, 赖梦君[6]2011年在《功能化微流控细胞芯片的构建及初步应用》文中研究指明目的构建一个结构简单,并有利于细胞贴壁培养的微流控芯片系统。方法利用生物交联剂将RGD肽共价连接在芯片微通道表面,通过与细胞膜表面整合素家族的特异性识别,促进细胞的黏附与贴壁生长;考察不同浓度RGD的功能化效果。结果化学交联法能将RGD有效的固定在芯片微通道表面,形成均匀一致的RGD层。RGD功能化处理的细胞芯片具有良好的生物相容性,可在无CO2的室温条件下实现较长时间的细胞培养。结论表面修饰能实现RGD肽在微流控芯片材料表面的固定并保持其生物活性,有利于细胞在微通道中的贴壁培养。
毛瑞[7]2018年在《核酸现场检测关键技术研究及初步应用》文中研究指明癌症和传染性疾病等仍为人类健康生活的严重威胁,而相关的生物标志物的快速、准确检测是有效应对的前提。蛋白和核酸标志物是当前体外诊断的主要目标分子,而针对蛋白检测的免疫技术一般敏感性较差,故核酸分子靶标为对象的检测技术成为主流。核酸检测中成熟的PCR及其衍生技术因严格的温控和精密仪器等需求而限制了应用场景。而以环介导恒温扩增(LAMP)为代表的新技术具有简便、快速、高特异性和高灵敏性的优势。然而,LAMP等恒温扩增技术引物设计复杂并受到严格专利保护,制约了真正的应用。同时,微流控芯片的流体精准操控及规模化集成优势可将核酸检测步骤高度集成,将明显降低人工操作步骤、缩短检测时间,其固有的微型化优势亦使得便携式现场多靶标高通量的核酸分析成为可能。本研究以基于微流控芯片的多重多靶标核酸检测和新型核酸恒温扩增技术的研发为核心,结合快速样品前处理技术基本完成了现场核酸检测关键技术体系的构建。主要内容及结果如下:(1)以微流控芯片为核心,构建了基于LAMP技术的多重多靶可视化及荧光核酸的现场核酸检测平台,实现了应用于疟疾疫情防控的6指标同时检测可视化芯片研发及应用于中东呼吸道综合征病毒(MERS-CoV)的10指标同时检测荧光检测芯片研发,并探索配套常温储存试剂的冷冻干燥技术。(2)研发了基于竞争性互补配对的核酸恒温扩增技术(Competitive annealing mediated isothermal amplification of nucleic acids,CAMP),该技术利用混合引物的设计思路和DNA聚合酶的链置换活性,通过引物结合、延伸、解链、临近互补、再次延伸的循环,实现了恒温条件下核酸扩增的目的。该方法与LAMP技术相比,引物设计难度和目标核酸长度要求明显降低。此外,在CAMP中引入外引物和环引物可进一步提高核酸扩增速率。随后针对CAMP技术进行了反应体系中反应成分、引物设计、荧光试剂的优化,最终建立了 CAMP这一新型恒温扩增方法。(3)将新研发的CAMP技术应用于甲型H1N1流感病毒和犬病毒等病原的的检测获得了成功。随后利用已建立的微流控检测平台并结合快速核酸提取技术实现了鲤疱疹病毒的微流控CAMP现场检测的技术体系构建。(4)提出并验证了另一种基于螺旋环结构的核酸恒温扩增新方法(Helix loop isothermal amplification of nucleic acids,HAMP),同 CAMP 一样,具有良好的应用前景。
胡梅[8]2010年在《量子点—生物分子复合探针的构建及其在生物分析中的应用》文中进行了进一步梳理量子点是一种新型的半导体纳米颗粒,是纳米生物光子学重要的工具之一。量子点作为一种极具应用前景的信号探针,与传统有机荧光染料相比,具有宽而有效的激发谱,窄而对称的发射谱,高的荧光量子效率,优异的光化学稳定性,方便灵活的表面可修饰性,以及发射波长尺寸可调等优点。基于这些独特的光学性质,结合先进的分析检测技术和平台,量子点在生物分析中的应用日益广泛,包括细胞与组织标记、生物分子跟踪与检测、免疫反应分析等方面,并取得了许多重要成果。但是,纵观量子点在生物分析领域的应用,大部分的机理都是基于生物分子之间的特异性相互作用。因此,构建量子点-生物分子复合探针,使量子点具有特异性靶向作用的同时,保持其荧光强度和稳定性,并且尽量减少其他生物分子的非特异性吸附,这对于量子点在生物领域的应用,起着尤为关键的作用。随着现代医学技术的发展,医学检测中要求化验和检验的仪器具有更高灵敏度、更短检测时间、更小体积、便携化。而新近发展起来的生物芯片技术,即微流控芯片技术所具有的优点能够很好地满足这些要求。目前,微流控芯片主要应用于基因测序、蛋白质图谱分析等高、精、尖领域。随着微流控芯片技术的不断成熟和制作成本的不断降低,必将大规模地进入到常规医学检测领域,取代那些笨重而且操作复杂的化验、检验设备,进而促进医疗水平的进步。然而,目前微流控芯片的检测灵敏度和特异性仍然有待提高。我们课题组在水相合成高性能量子点方面有很好的基础,利用微波辅助水相量子点制备技术,制备了优良性能的水分散性量子点。基于这个优势,我们试图开展一些原创性、有实际意义的研究工作,将量子点信号探针和微流控芯片检测平台相结合,充分发挥两者的优势,克服彼此的缺陷：即量子点优异的荧光性能,有助于提高微流控芯片的检测灵敏度,并扩大其应用范围；微流控芯片技术的可控性、高通量,有利于提升量子点探针的标识能力。本文构建了一系列性能优良的量子点-生物分子复合探针,并将这些复合探针用于微流控芯片,对生物分子进行检测。具体研究内容如下：1.构建了一种新型的微流控芯片检测体系。这种微流控芯片是由PDMS片层和芯片基片组成。借助此微流控技术平台,实现了生物分子在固相表面的固定组装、识别、捕获、检测等一系列的生物反应过程。此芯片制作成本低,易于操作,可实现不同种类、不同浓度的生物分子在微流控芯片上的快速分析。与传统的微阵列芯片相比,这种微流控芯片技术能够更好地保持生物分子的活性,样品消耗量很少,不需要昂贵的点样仪,对环境也没有严苛的要求,并且流体具有可控性,有利于提高生物分子之间的结合效率,提高检测灵敏度和特异性。2.构建了量子点-亲和素复合探针,并将这种探针用于微流控蛋白质芯片。基于静电相互作用,将带相反电荷的量子点和亲和素自组装,形成了量子点-亲和素复合探针,并将这种纳米生物复合探针作为信号探针,用于微流控蛋白质芯片,对肿瘤标志物进行检测。通过实验条件的不断改进和优化,克服了PDMS微通道和基片对蛋白质的非特异性吸附,减小了量子点对蛋白质的非特异性吸附,降低了芯片的背景信号,提高了量子点在芯片上的信号强度。实验结果表明,相对于传统的荧光染料(FITC),采用量子点作为信号探针,无论是信号强度,信号稳定性,还是检测灵敏度,都有明显的提高。这是首次将量子点引入到微流控蛋白质芯片中。量子点在微流控芯片上的优异表现,证实了我们所构建的检测体系,充分地融合了量子点和微流控技术的优势,为蛋白质的检测和分析提供了一个新颖而有效的途径。3.构建了量子点-免疫球蛋白复合探针,并将这种探针用于微流控蛋白质芯片。基于共价偶联的机理,将量子点和免疫球蛋白(羊抗鼠二抗)连接,形成了量子点-免疫球蛋白复合探针。详细地探讨了共价连接对量子点荧光强度和稳定性的影响,制备得到了有效且稳定的量子点生物探针。本文将这种量子点生物探针,用于微流控蛋白质芯片,采用夹心免疫分析法,实现了缓冲液和血清中肿瘤标志物的高特异性、高灵敏度检测；采用反相免疫分析法,实现了混合样品的多元检测和多色成像。对于真实样本和复杂样本的有效检测,预示着这种检测体系在临床检测和蛋白质组学研究领域具有强大的应用潜力,为理论研究向实际应用转换提供了有利的技术支撑。4.构建了量子点-DNA-生物素-链霉亲和素复合探针,并将这种探针用于微流控蛋白质芯片。本文提出了一种新型的以DNA作为“桥梁”的蛋白质在量子点表面可控组装的策略。作为验证实验,我们设计并制备了量子点-DNA-生物素-链霉亲和素(QD-DNA-biotin-STV)纳米生物复合物。实验表明,组装得到的复合物具有很高的荧光强度、稳定性,以及生物分子的活性。将这种量子点复合探针作为信号探针,用于微流控蛋白质芯片,实现了肿瘤标志物的高特异性、高灵敏度检测。检测限达到50fM,比有机荧光染料的检测限低4个数量级；比量子点-亲和素复合探针的检测限低一个数量级。这种组装策略避免了对量子点和生物分子的破坏,非常温和、可控、有效,具有很高的普适性,将在生化分析和临床应用中有广泛的应用前景。5.构建了量子点-DNA复合探针,并将这种探针用于微流控DNA芯片。基于配体交换的原理,巯基修饰的DNA部分取代量子点表面的巯基配体,制备得到量子点-DNA复合探针。通过控制组装条件,得到了不同组装密度的量子点-DNA复合探针。构建了基于双色量子点的FRET体系,实现了靶DNA均相检测。首次将量子点-DNA探针应用于微流控DNA芯片,实现了靶DNA的非均相检测。实现结果表明,检测具有比较高的灵敏度,检测限达到了50fM。除此之外,这种检测体系能够有效地区分完全互补序列、单碱基错配、非互补序列,具有很强的特异性和选择性,为DNA的检测提供了一种全新而有效的检测途径。6.发展了一种基于量子点的葡萄糖非标记检测法。首先证实了过氧化氢对量子点的荧光淬灭效应。基于葡萄糖氧化酶对葡萄糖的氧化催化反应,伴随有过氧化氢生成,因此通过监测量子点荧光强度的变化,检测葡萄糖的浓度。实验表明,这种检测方法对浓度为微摩尔/升到毫摩尔/升的葡萄糖都能有效地检测,检测限为1.8μM。另外,基于同样的检测原理,采用96孔板作为检测平台,实现了标准样品和血液样本中葡萄糖的检测。检测结果与商品化血糖仪的测量值进行比较,证实了这种检测方法具有比较高的可信度。这种检测体系,不需要繁琐的化学修饰过程,也不需要复杂的检测仪器和昂贵的试剂,可以预见,这种基于量子点的葡萄糖非标记检测方法在生化分析和临床检测中有较大的应用潜力,并且经过进一步的设计和改进,有望发展成为一种便携式、低成本的血糖仪。
余佳文[9]2003年在《压电生物芯片在抗肺癌药物筛选中的初步应用》文中研究说明近年来，生物芯片技术已逐步发展成为现代科学技术的热点研究领域。目前国内外已研发的生物芯片包括基因芯片、蛋白质芯片和细胞芯片、电子芯片、叁维芯片、流过式芯片和缩微芯片、寡核苷酸芯片(又称ONA芯片)、cDNA芯片(又称CDA芯片)、多肽芯片、质谱芯片等。上述生物芯片技术在分子生物学，疾病的预防、诊断和治疗，新药开发，环境污染监测和食品卫生监督等诸多领域均有应用，特别是近年来在药物研发领域的应用，越来越引起人们的高度关注。 本文主要根据压电生物芯片的技术原理，利用频率信号变化的检测实现对基因杂交过程的原位和实时定量监测，并对压电生物传感器芯片在抗肺癌药物的筛选中的应用进行了初步探讨。P53基因是基因研究最为广泛深入的抑癌基因，是肿瘤突变率最高的基因，对药物敏感性影响研究国外已有报道。对于耐药性预测、治疗方案实施都有潜在临床指导和治疗应用价值。因此我们选用P53基因做探针，人类肺癌细胞系801-D做筛选模型，将设计好的DNA探针修饰在传感器上，然后把提取的特异性基因片段经PCR扩增后配成适当浓度的溶液，在一定的环境条件下让其杂交，根据是否发生杂交反应和杂交信号的强弱即可进行定性和定量分析。并将配方药物作用于药物筛选模型，然后检测P53基因。实验结论显示：①在液相条件下，所使用的压电生物芯片实时分析仪较为稳定，谐振频率能稳定在±3Hz左右。在1h左右的时间内，能满足探针在金电极表面的自组装，探针的固定达到比较好的效果；②从Sauerbrey方程式及实验可以看出，石英晶片在气相和适当的液相中振荡时，△F与△m呈简单的线性关系，因此石英晶片可用来做非常敏感的质量检测器(质量微天平)，其检测限可以达到ng级，甚至pg级水平；③叁个配方药物作用于肺癌细胞后，p53基因分析分析测试的实时图像用压电芯片(核心是压电生物传感器)检测肺癌细胞经过肺癌配方药物作用后，其p53基因的变化，来考查药物是否有效，收到显着效果，压电基因检测结果与PCR扩增方法结果基本一致。 随着药物筛选在分子水平上不断深入，本文所介绍的压电传感器芯片技术是一种有益的尝试，压电芯片不仅可实现基因杂交过程的原位和实时监测，而且可同时检测多组标本，大大地缩短了样品分析时间、不需对探针标记，降低了成本，但仍有许多不足。因此，蛋白质芯片、细胞芯片在药物筛选领域将成为有广阔应用前景的未来发展趋势。总之，生物芯片技术在药物靶点发现与药物作用机制研究、超高通量药物筛选、毒理学研究、药物基因组学研究以及药物分析中的应用必将推动药业发展。
樊佳新[10]2017年在《基于微流控芯片技术的荆芥黄酮抗肺癌有效成分配伍规律及作用机制初步研究》文中研究说明目的本研究课题是国家“中药复方多组分配伍筛选集成化微流控芯片的构建及新药筛选”“十二五”“重大新药创制”科技重大专项(项目编号:2013ZX09507005-005)以及辽宁省教育厅一般项目(项目编号:L201605)的一部分。本文基于微流控芯片技术探讨荆芥黄酮诱导肺癌细胞凋亡的作用;分析荆芥黄酮组分的组成及配伍规律,并初步阐明荆芥黄酮诱导肺癌细胞凋亡的分子作用机制。为以药理药效为导向的质量控制模式及抗肺肿瘤类新药开发控制提供一定数据参考。方法1.采用软光刻、模塑法以及等离子键合技术构建一种用于体外抗肺肿瘤药效学筛选的芯片,并采用荧光色素试剂对该芯片的性能进行考察。2.在微流控芯片技术的基础上,以细胞凋亡坏死率(%)为考察指标,采用Hoechst33342/碘化丙啶(PI)双染技术开展不同产地荆芥药材及不同药用部位黄酮类组分对人肺癌细胞A549的药效学研究。3.采用高效液相色谱法进行荆芥药材黄酮类组分指纹图谱的建立及含量检测,灰色关联度分析软件进行谱效关系分析,HPLC-Q-TOF-MS对其药效相关性成分进行快速分析与鉴定,确定其药效相关性化学成分。4.以凋亡坏死率(%)为检测指标,对荆芥黄酮中药效相关性成分进行体外药效学的研究,并采用均匀设计的方法筛选出其体外抗肺肿瘤作用的最佳配伍比例。5.采用Annexin V-FITC/PI双染色法及PI单染色法进行流式细胞仪检测,探讨荆芥黄酮诱导人肺癌细胞A549周期分裂及凋亡坏死的影响。6.采用PCR以及Western Blot等相关技术,检测荆芥黄酮对人肺癌A549细胞中Micro RNA以及相关基因及蛋白的相对表达,双重角度阐释荆芥抗肺肿瘤的初步作用机制。结果1.本实验设计并制作了一种双层PDMS芯片。在第一PDMS薄膜层上集成有a、b、c、d、e、f、g、h共16个气动微阀,其中aa1为一对配合使用,共8对;8个液阀,分别为液阀A、B、C、D、E、F、G、H;第二PDMS薄膜层上有细胞培养腔4×4列椭圆形结构以及相应的流体通道结构,四个模块通过一个共用废液口。测试结果显示:集成有微阀结构的微流控芯片液阀及气阀均在72 h内具有良好的阀控隔离能力;芯片中肺癌A549细胞生长状态良好,细胞存活率能达到98%以上,可用于后期实验研究。2.基于微流控芯片技术进行荆芥黄酮类组分对人肺癌细胞A549的体外药效结果显示:荆芥黄酮类组分对人肺癌细胞均具有一定抑制作用,但作用强弱存在一定差异。在相同浓度和时间的条件下,安徽产地药效最好,凋亡坏死率达到(67.40±3.56)%;广东产地药效最差,凋亡坏死率仅为(10.91±1.26)%。而同一荆芥植株不同药用部位的体外药效实验显示其抗肺肿瘤的作用效果:叶>根>花>茎。3.本研究基于高效液相色谱法建立了荆芥黄酮类组分的指纹图谱,其中共有20个指纹色谱峰,通过相似度评价分析表明:不同产地药材间相似度存在一定差异性。S1(安徽)、S2(甘肃)、S5(河南-商丘)、S7(湖北)、S8(四川)、S9(云南)为第一类,相似度均达到0.95以上;S6(河南-亳州)为第二类,相似度均达到0.85以上;S3(广东)和S4(河北)为第叁类,相似度仅为0.36左右;谱效关系分析结果显示:20个共有峰所代表的化学成分与抗肺肿瘤作用有较高的关联性,顺序从强到弱依次为:19th>6th>10th>12th>20th>16th>11th>18th,初步鉴定6种单体化学成分分别为槲皮苷、橙皮苷、芹菜素、香叶木素、木犀草素、木犀草苷。4.采用高效液相色谱法对9种不同产地荆芥药材中关联系数较大的6种化学成分进行含量检测,其中总黄酮含量分别在7.58 mg·g-1至17.91 mg·g-1范围内,其中安徽产地含量最高。根据其含量检测结果9种产地荆芥药材聚类分析共聚为3类,安徽产地药材为第一类,河南-商丘与广东产地药材聚为第二类,其余6种产地药材聚为第叁类。5.6种单体成分在相同浓度的条件下,作用效果木犀草苷>槲皮苷>木犀草素>芹菜素>香叶木素>橙皮苷;均匀设计实验结果显示:12个配伍组均具有一定诱导肺癌细胞凋亡的作用,凋亡坏死率在(27.68±1.674)%-(81.00±5.154)%之间。其中配伍叁效果最佳;进而推测出木犀草素、木犀草苷、槲皮苷、橙皮苷、芹菜素、香叶木素按照3.06:2.90:2.04:4.17:0.12:2.75的比例配伍药效最佳。6.通过流式细胞仪检测结果显示:荆芥黄酮类组分及单体成分均具有一定诱导人肺癌细胞A549凋亡的作用,其中最佳配伍组作用最强凋亡坏死率为(67.9±1.2)%,荆芥黄酮高剂量组作用次之,凋亡坏死率可达到(52.5±0.7)%。其余各给药组强弱依次排序为:木犀草苷>槲皮苷>木犀草素>荆芥黄酮中剂量组>芹菜素>香叶木素>橙皮苷>荆芥黄酮低剂量组。此外,尚能显着抑制人肺癌细胞的分裂,抑制肺癌细胞G0/G1期及S期,増加S期细胞比例从而延缓肿瘤细胞的发展。7.PCR检测结果显示:荆芥黄酮作用于人肺癌细胞A549后,干预PI3K-AKT信号通路中部分关键分子的表达,micro RNA 126(mi R-126)和PTEN的表达上调,VEGF和PI3K的表达下调;6种单体成分及最佳配伍组中PTEN表达上调,VEGF和PI3K表达下调。8.Western Blot检测结果显示:荆芥黄酮作用于人肺癌细胞A549后,干预PI3K-AKT信号通路中部分关键分子的表达。不同程度的降低了VEGF、AKT、Bcl-2及Cyclin B1蛋白的相对表达,增加了PTEN及PI3K蛋白的相对表达;6种单体成分及最佳配伍组降低了AKT和Cyclin B1蛋白的相对表达,木犀草素能降低PI3K的表达,芹菜素、香叶木素以及橙皮苷能增加PI3K的表达。除橙皮苷和最佳配伍组外,均能增加PTEN的表达、降低Bcl-2的表达。结论1.本实验构建了一种用于抗肺肿瘤药效筛选的微流控芯片,以满足目前的实验需求。并凭借其操作灵活简单、实验成功率高、结果稳定、制作成本低等优势成功应用于不同产地荆芥和不同药用部位的体外药效学研究。2.基于微流控芯片技术的体外药效试验研究结果表明:由于产地不同所处的气候以及环境不同,对化学成分的分布造成一定影响,导致不同产地荆芥药材黄酮类组分体外抗肺肿瘤作用存在一定差异。其中安徽为荆芥药材主产地之一,其效果较佳;不同药用部位药效试验结果显示根部也具有一定诱导肺肿瘤细胞凋亡的作用,所以根入药可以扩大药用。所以针对不同产地以及不同药用部位的研究可为荆芥药材作为抗肺肿瘤类药物治疗的开发及合理利用提供一定理论依据。3.本研究通过高效液相色谱法以及灰色关联度软件得到荆芥黄酮类组分整体特征指纹图谱和药效贡献度较大的色谱峰,在此基础上并对其进行了多指标成分的含量检测。该方法稳定、可行,进一步为荆芥药材的质量控制以及评价体系提供一定的参考价值。4.本研究基于微流控芯片技术初步完成了荆芥黄酮类组分中6种单体成分的配伍规律研究,其结果显示:不同单体成分体外抗肺肿瘤作用存在一定差异,进一步说明各化学成分混合在一起所发生的药效结果并不是单体药效的简单迭加,此次均匀实验设计优选出的最佳配伍比例效果优于同等剂量的荆芥黄酮总组分,上述实验结果为后期联合用药的深入研究奠定前期实验基础。5.荆芥黄酮类组分、单体黄酮成分以及最佳配伍组在一定浓度范围内,均具有一定诱导细胞凋亡、抑制细胞分裂的作用,但是其作用点有所不同,荆芥黄酮作用于S期较显着,单体成分作用于G0/G1期、S期、G2/M期各异。说明单体成分相互作用部分协同增加抑制S期分裂,部分拮抗作用于G0/G1期和G2/M期。该实验结果进一步验证了中药多靶点的作用理念,说明中药发挥疗效是多种化学组分协同作用的结果。6.荆芥黄酮化学成分复杂,一方面,各给药组均不同程度地上调抑癌基因PTEN的表达,从而干扰PI3K/AKT信号通路,导致了PI3K以及VEGF下调,进而促进了肿瘤细胞的凋亡。另一方面,mi R126在PI3K/AKT以及VEGF两条信号通路中具有重要作用,VEGF是已经被证实的mi R-126的作用靶点,荆芥黄酮干预了相关蛋白的表达,参与了机体代谢网络的调控。揭示出荆芥黄酮干预肺肿瘤细胞作用的重要途径,明确了荆芥黄酮体外抗肺肿瘤作用的初步作用机制。7.荆芥黄酮作用于PI3K-AKT信号通路,并且调控了相关蛋白的表达,值得注意的是:并非一种基因调控对应的一种蛋白。对于周期蛋白(Cyclin B1)不同给药组均具有一定作用。而凋亡蛋白(Bcl-2)只有配伍组作用不显着。初步推断荆芥发挥抗肺肿瘤的作用是各成分综合调控共同作用的结果,并不是简单的机制累积。
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