于兵[1]2009年在《肝脏干细胞向胰腺β细胞分化的研究》文中指出目前,糖尿病已成为严重威胁人类健康的重大疾病之一。根据胰岛素分泌的绝对和相对不足可分为Ⅰ型和Ⅱ型糖尿病,其中I型糖尿病的发病本质是产生胰岛素的胰岛β细胞被破坏所致。虽然临床上通过给患者服用降糖药或注射胰岛素可将患者的血糖控制在正常范围内,但这些治疗措施不能有效预防糖尿病所致的各种晚期并发症。近年来,胰腺或胰岛细胞移植被认为是根治糖尿病的最好疗法,但移植后的免疫排斥反应和供体的严重缺乏等问题限制了该疗法的实际应用。如今,随着对干细胞诱导分化和成体细胞转分化研究的深入,通过诱导分化或转分化获得可用于移植的胰岛素分泌细胞已成为糖尿病治疗研究的一个新的热点。研究表明通过强制表达某些组织特异性转录因子,可使一种组织类型的细胞转分化为另一种组织类型的细胞。在个体发育过程中,肝脏和胰腺都起源于前肠末端,发育上的同源性提示肝脏和胰腺在细胞增殖和分化调控等方面有很高的相似性。因此,人们推测肝脏来源的细胞可能会更容易的转分化为胰腺β细胞。目前已有证据表明,有些胰腺发育相关的转录因子(如Pdx1、NeuroD、Pax4、MafA等)可将肝原始细胞、成熟的肝细胞,甚至肝肿瘤细胞诱导分化为可分泌胰岛素的胰腺β细胞样细胞。这些研究成果一方面有望缓解糖尿病细胞治疗的细胞来源问题,另一方面也为糖尿病治疗提供了一个新的思路:即可在体内利用患者的肝干细胞或肝细胞的胰向分化来实现治疗目的。然而,目前人们还没有建立高效的、特异的诱导肝脏细胞向胰岛素分泌细胞转分化的技术体系。为此,本研究通过PCR的方法成功克隆了人胰腺转录因子Pdx1、Pax4、NeuroD和MafA基因,并将其插入到pAd-track-CMV穿梭载体中,然后在AdEasier-1细胞中重组产生重组腺病毒质粒,继而在293LP细胞中包装出感染性重组腺病毒。重组腺病毒以复合感染(multiplicity of infection,M.O.I)指数为20感染人胎肝干细胞(human fetal liver stem cells , hFLSCs),24小时后,荧光显微镜下观察显示几乎所有的细胞都表达报告基因GFP,RT-PCR和Western Blot检测显示外源基因在人胎肝干细胞中可转录和翻译。进一步将重组腺病毒悬液经尾静脉注入小鼠体内6天后,小鼠肝脏几乎所有的细胞都表达了GFP报告基因。这些结果表明,本研究已成功构建了胰腺转录因子Pdx1、Pax4、NeuroD、MafA的腺病毒表达载体,这为肝干细胞向胰腺β细胞分化或在小鼠肝脏中建立分泌胰岛素的细胞群的研究准备了条件。在此基础上,为了建立肝干细胞高效特异的向胰腺β细胞转分化技术体系,本研究将Pdx1、MafA、Pax4和NeuroD重组腺病毒分别或以不同组合感染小鼠肝原始细胞(liverepithelial progenitor cells, LEPCs),结果发现Pdx1和MafA感染LEPCs细胞3天后,部分细胞表达insulin1和insulin 2。该结果为进一步建立肝干细胞高效、特异的向胰腺β细胞转分化的技术体系的研究奠定了基础。
陈长浩[2]2004年在《胰腺发育相关基因PDX-1诱导肝细胞向胰腺细胞分化研究》文中提出糖尿病是继肿瘤、心血管疾病之后又一高死亡率的疾病，严重威胁着人类的身心健康，由于尚无满意的理论完全阐明其病因和发病机制，故对糖尿病治疗方法的探索和糖尿病机制的研究成为众多科研工作者关注的焦点。目前对糖尿病的治疗仍然是以药物治疗为主，不能从根本上解决糖尿病的问题。因此，现代医学对胰岛移植和基因疗法愈来愈关注。本文拟利用与胰腺发育密切相关的PDX-1基因诱导肝细胞向胰腺细胞分化，以期能够在糖尿病治疗中得到应用。这方面的研究将为糖尿病的治疗开拓一个新的思路。Ⅰ型及部分Ⅱ型糖尿病是由于胰岛β细胞凋亡异常增多而使得β细胞数目减少，致使胰岛素分泌不足而引起的。胰腺-十二指肠同源框1（pancreatic duodenal homeobox-1，PDX-1）作为胰腺发育过程中重要的转录因子指导胰腺的正常发育。PDX-1可以调节影响胰岛β细胞特性和功能的基因的表达，这些基因包括：胰岛素（insulin）、葡萄糖转移蛋白-2(glucose transporter2，GLUT-2)、葡萄糖激酶(glucokinase)、淀粉样多肽(amyloid polypeptide)等；同时它也调节生长激素在δ细胞和发育脑中的表达。PDX-1激活基因的转录是组织特异性的，这依赖于它与其它转录因子相互作用的能力。如在胰岛素的启动子中，PDX-1的DNA结合位点排列在E盒的附近，并结合E47蛋白和NeuroD1蛋白形成起始复合物，从而调节胰岛素基因的转录。PDX-1在胰腺的发育中有两个表达高峰期，第一个表达高峰期是在内胚层时，PDX-1决定哪一部分发育为胰腺，在第二个表达高峰期，PDX-1
陈长浩, 师迎旭, 付汉江, 朱捷, 傅学奇[3]2005年在《胰腺发育相关基因PDX-1诱导小鼠胎肝基质细胞向胰腺细胞分化》文中研究指明目的:利用胰腺发育相关基因PDX1-诱导小鼠胎肝基质细胞向胰腺细胞分化,探讨糖尿病治疗新方法。方法:构建含有胰腺发育相关基因胰腺-十二指肠同源框1(pancreatic duodenal hom eobox1,PDX1-)的真核细胞表达载体pmPDX1-,瞬时转染小鼠胎肝基质细胞,通过RT-PCR的方法,检测转染pmPDX1-质粒的小鼠永生化胎肝基质细胞的胰岛素、胰高血糖素、胰多肽和肝细胞生长因子受体c-m et的表达。结果:在mRNA水平上能够检测到胰岛β细胞所分泌的胰岛素、胰岛α细胞所分泌的胰高血糖素和胰腺PP细胞所分泌的胰多肽,表明转染了pmPDX1-质粒的小鼠胎肝基质细胞在向胰腺细胞分化的过程中,具备了转录表达胰腺的内外分泌因子的能力。对肝细胞生长因子受体c-m et的检测,提示分化的细胞没有完全失去肝细胞的特性。结论:通过导入PDX1-基因可以诱导小鼠胎肝基质细胞向胰腺细胞分化。
张慧茹[4]2005年在《仔猪胰腺干细胞的分离鉴定》文中认为近年来糖尿病的患病率日益增高,已成为继心血管疾病、肿瘤之后第叁大高发慢性病。快速、有效、长期地补充机体胰岛素分泌不足是糖尿病治疗的根本方案。目前采用叁种方法补充机体胰岛素分泌不足:传统皮下注射外源性胰岛素,虽然有效但很难阻止并发症的发生和发展,注射剂量经常与机体需要不相符,且每日每餐均需注射很繁琐;胰腺和胰岛器官移植,可解决胰岛素供需不符的问题,但移植器官难得、手术复杂、不良反应多;移植分泌胰岛素的干细胞,可以弥补上述两种方法不足,简易地注入人体成为自身胰腺细胞,一次给药长期有效,机体还可根据需要,调节产生胰岛素和其他辅助细胞因子等的多种细胞比例,避免并发症发生,干细胞增殖力强、数量充足、移植排斥反应低。但也是由于供体组织严重匮乏限制其应用发展,人们转向寻找异种动物胰腺组织作为供体组织来源时发现,猪繁殖性能强,组织来源充足,胰岛素结构和生物活性类似于人胰岛素,血糖调定点同人接近,猪胰腺细胞可在人血清中生存对人体无害,因此,仔猪胰腺干细胞可作为最佳的异种动物胰腺干细胞的供体细胞,对仔猪胰腺干细胞的研究是糖尿病治疗的新希望。本试验从仔猪胰腺干细胞分离培养、生物学性能测定及诱导分化多能性叁个方面进行研究,为仔猪胰腺干细胞的临床应用提供基础资料。1. 建立仔猪胰腺干细胞的分离方法和培养体系。取新鲜的仔猪胰腺组织,冰上操作,0.25%胰酶消化,形成小细胞团和单个细胞,过滤,低速、多次离心,或以5%BSA作离心液离心,均可获得高活力的胰腺细胞,用层粘连蛋白或明胶铺被培养皿,以低糖DMEM 培养液添加10%血清及10 mmol/L 烟碱作为基础培养液,培养2d 后,除去未贴壁细胞,更换为去除烟碱、添加10 ng/mL EGF的基础培养液,长期培养以促进胰腺干细胞体外增殖生长。证实仔猪胰腺内分泌祖细胞呈多突起细胞形态。2. 仔猪胰腺干细胞各项生物学特性。原代细胞以细胞团和单个细胞贴壁,细胞团中不断有细胞脱离、悬浮,保留的贴壁细胞和单个细胞生长,约7d 出现多突起内分泌祖细胞,克隆样生长,很快连接成网状;小圆细胞数量增多;多角形导管上皮干细胞增殖慢。电镜观察多突起细胞具50~80μm长突起、有极性、核质比大、细胞器不发达;小圆细胞为直径10~12μm、有微绒毛、胰岛素阳性;多角形细胞呈圆形、核质比大、可见胞质内细胞器和细小分泌颗粒。成功地分离到叁种形态的胰岛干细胞:多角形胰导管细胞、多突起内分泌祖细胞和小圆细胞。免疫组化鉴定,分离的细胞表达胚胎干细胞标志SSEA-1、SSEA-4、Oct4,也表达胰腺干细胞的标志PDX-1、CK7 等,证实分离的细胞具有胰腺干细胞特征。测定仔猪胰腺干细胞的生长曲线。分离培养的胰腺干细胞体外生长12~15d 可传代,
刘晓芳[5]2013年在《诱导人胚胎干细胞向胰腺内分泌细胞分化及其机制研究》文中指出糖尿病是由于分泌胰岛素的β细胞缺失或功能异常而引起的糖代谢异常疾病。目前，尽管多种药物尤其是胰岛素的应用对糖尿病的治疗效果有了很大改善，但还没有一种治疗手段可以完全治愈糖尿病，阻止其并发症的发生。除了Ⅰ型糖尿病的中β细胞总数的缺乏外，新近研究发现在Ⅱ型糖尿病患者胰腺中同样存在β细胞团减少的现象，因此通过胰腺或胰岛移植是根治糖尿病的唯一手段，但是供体胰岛的严重缺乏限制了其广泛开展。干细胞因其多向分化潜能和自我更新的特性，已被越来越广泛地应用于细胞替代治疗的研究中。然而，将干细胞真正用于糖尿病的临床治疗还面临许多问题。细胞数量和功能不足是干细胞治疗糖尿病所面临的主要挑战。尽管近年来，已经建立了使用生长因子和小分子化合物，将多能干细胞分化为胰腺内分泌细胞的方法，但是多能干细胞分化成为内分泌细胞需经过定型内胚层，胰腺祖细胞，内分泌祖细胞以及特定类型内分泌细胞五个阶段，诱导时间长，不可控制的因素多，所以，目前还没有一种方法可以获得足够数量、终末分化的功能性胰岛细胞。研究认为，胰岛的结构和胰岛细胞间的相互作用决定胰岛细胞的功能，叁维(threedimentional,3D)细胞培养技术可通过恢复细胞与细胞间的相互关系弥补2D培养技术的不足，本课题拟利用3D培养技术从组织结构、细胞间相互作用的角度进行研究，尝试解决替代细胞分化效率和功能成熟的问题。3D培养技术因其在体外构建与体内相近的细胞发育结构系统，成为研究细胞-细胞，细胞-基质间相互作用最直观的体外细胞培养模型，大量研究已证明，3D环境下的诱导分化效率高于2D环境，并且3D细胞培养可以恢复细胞的结构并提高细胞的功能。但是3D培养是否可以促进胚胎干细胞向胰岛细胞的分化，3D结构的细胞生长模式与胰岛细胞功能成熟之间的关系还不清楚。基于以上考虑，本课题分为两部分，第一部分的工作旨在探索3D细胞培养与胰岛细胞功能之间的关系；第二部分在第一部分工作的基础上，利用3D细胞培养技术，模仿体内胰岛生长微环境，探讨3D细胞培养对人胚胎干细胞（human embryonic stemcells, hESC）向胰岛细胞分化过程中的影响，并初步分析其作用机制，为体外获得有功能的种子细胞提供技术支持和理论基础。一、叁维细胞培养对胰岛细胞功能的影响及其机制研究：通过悬浮培养小鼠β细胞系MIN6细胞，形成类组织样结构的MIN6细胞团(3D-MIN6)，葡萄糖刺激胰岛素释放(GSIS)实验证实，3D-MIN6较2D-MIN6在葡萄糖刺激下可以释放更多的胰岛素，q-PCR显示3D-MIN6中胰腺内分泌细胞相关基因表达上调，提示3D细胞培养可以增强β细胞的基因表达和GSIS功能。RhoA和ROCK功能阻断实验表明，3D-MIN6细胞通过抑制RhoA/ROCK通路，使F-actin重构，易化胰岛素释的释放过程，另外，3D细胞培养和RhoA/ROCK功能阻断可使细胞缝隙连接蛋白36（Connexin36, Cx36）的表达增高，而通过siRNA技术阻断Cx36功能后，MIN6细胞的GSIS明显降低，即使抑制RhoA/ROCK活性也不能恢复MIN6的胰岛素释放功能，提示Rho/ROCK信号通路通过Cx36发挥调节胰岛素释放的作用。第一部分的研究表明3D细胞培养通过抑制RhoA/ROCK的活性，可以促进Cx36的表达，进而加强MIN6细胞的GSIS功能。二、诱导人胚胎干细胞向胰腺内分泌细胞分化及其机制研究：本研究首先利用细胞因子和小分子化合物组合建立了诱导hESC向胰腺内分泌细胞(pancreaseendocrine cell, PEC)的分化体系，通过27天的诱导，hESC来源的PEC可以合成内分泌激素胰岛素、胰高血糖素和生长抑素，并且能在Fosklin、KCL的刺激下分泌胰岛素，但是对与葡萄糖的刺激反应微弱。在此基础上，我们分别对诱导细胞进行了简单的悬浮3D培养和基质材料Matrigel包埋的3D细胞培养，与常规2D培养相比，3D培养加强了hESC来源的PEC的内分泌特异性，使胰岛素阳性细胞的分化效率提高到23.7%，细胞内胰岛素的含量明显增多，并且具备了GSIS的能力。通过对影响细胞间相互作用的粘着斑激酶(focal adhesion kinase, FAK)研究发现，3D组诱导细胞中FAK活性明显低于2D组，抑制FAK或其下游ROCK的表达，可以促进内分泌细胞定向分化的相关基因NGN3、NKX6.1、ISL1的上调表达，说明FAK和ROCK通路参与了3D培养促进内分泌细胞定向分化的过程。另外TGFβ信号通路已被证实具有调节内分泌细胞定向分化的作用，我们Western blot结果显示，下调FAK活性亦可抑制TGFβ下游Smad2的活性。在3D组诱导细胞中还发现Cx36表达明显上调，抑制FAK和ROCK通路同样可以提高Cx36基因合成和蛋白表达，说明3D培养通过FAK、ROCK信号通路调控Cx36的合成与表达，进而增强细胞GSIS的功能。小鼠体内试验证实移植入体内的PEC可以合成胰岛素并根据体内血糖水平调节其释放。综上所述，本课题的研究表明，3D细胞培养条件有利于小鼠β细胞系MIN6胰腺发育相关基因的表达和GSIS功能的发挥。在hESC向PEC的分化过程中，3D细胞培养通过抑制FAK及其下游信号通路ERK、ROCK、Smad2，可以提高PEC的分化效率和增强GSIS功能。该研究不仅为3D环境可以增强β细胞功能和促进hESC向PEC分化提供了新的理论和技术基础，也给糖尿病患者应用细胞替代治疗带来了新的希望。
乔海[6]2007年在《人胎儿胰岛样细胞团源胰腺干细胞分离和鉴定》文中提出糖尿病作为严重危害人类健康的叁大主要疾病之一,传统的药物及胰岛素替代疗法不能从根本上医治该病。近年来,随着成人胰岛移植的成功和对免疫抑制方案的改进,移植胰岛细胞已成为治愈Ⅰ型和部分Ⅱ型糖尿病的有效途径。但是,由于每个临床胰岛移植受体通常需要2～4个新鲜尸体胰腺,胰岛供体短缺的矛盾阻碍了胰岛细胞治疗糖尿病技术的推广和应用。胰腺干细胞(Pancreatic stem cells)是一类存在于胎儿和成年胰腺组织中的成体干细胞,能自我更新,具有多分化潜能,其特点是在自然分化过程中首先分化为胰腺组织的各种细胞。体外分离、克隆人类胰腺干细胞作为种子细胞,并定向诱导其分化为功能性胰岛细胞移植治疗糖尿病,是解决胰岛供体短缺的有效途径。本试验从人胎儿胰腺分离胰岛样细胞团(Islet-like cell clusters, ICCs),从中纯化出干细胞并进行扩增培养,对其表达特性及诱导分化等方面进行研究,从而优化胰腺干细胞分离、鉴定的方法和体系,为糖尿病研究和治疗提供种子细胞,为人胎儿胰腺干细胞的临床应用提供基础资料。本实验无菌取3-5月龄人胎儿胰腺,剪碎后用Ⅳ型胶原酶消化,RPMI1640+10%NBS培养获得胰岛样细胞团;挑出细胞团接种于明胶包被的玻璃皿中,低糖DMEM +10%NBS+10ng/mL EGF进行贴壁培养,当细胞长成单层后传代,以RPMI1640+10%NBS培养;传代4d后可见许多呈克隆样生长的上皮样细胞片,挑出用RPMI1640 +10%NBS扩增培养,获得纯化的上皮样细胞,现传45代,每代冻存106-108个细胞。随机取生长状态良好的第13代细胞,接种到96孔板中,采用MTT法测定并绘制细胞生长曲线。生长曲线显示,用20%血清培养时,其传代第叁天进入对数生长期,第五天达到平台期,在10%血清的培养液中生长则相对较慢。将第6代、11代、21代细胞分别接种于96孔板中,培养叁天后4%多聚甲醛(pH7.4)固定后进行免疫组织化学染色。细胞表达PDX-1、CK-19、PCNA、CK-7、CK-3、E-钙粘素、Nestin、Glucagon、Glut2、Vimentin、;不表达Insulin、Somatostatin、IAPP(Islet amyloid polypeptide)。提取第39代细胞总RNA进行RT-PCR分析,细胞也表达PDX-1,CK-7,CK-19,Nestin,胰高血糖素,β-半乳糖苷酶,Vimentin,Glut2,不表达NGN3,胰岛素,生长抑素,胰多肽,葡萄糖激酶等。悬浮培养时CK-19表达仍然比较强,但nestin表达明显减弱。将培养的第5代细胞上流式细胞仪检测,细胞表达CD29、CD44、CD166,不表达CD11a、CD14、CD34、CD45、CD90、CD105、CD117。第39代细胞仍稳定表达CD29、CD44、CD166;稳定不表达CD54、CD90、CD11a。而CD14、CD34、CD45、CD105、CD117、CD 71、CD34、CD45的表达不稳定。将第39代HFIECs用10μg/L 10mmol/NIC, 10μg/L bFGF, 10μg/L HGF诱导培养14d,可形成DTZ阳性的细胞团。胰岛素释放量在第20d达到最大,证明诱导细胞在20d成熟程度达到最高。本试验表明从人胎儿胰腺分离培养的胰岛样细胞团中能纯化出具有自我更新能力的上皮样细胞,其来源于胰腺导管,具胰腺干细胞特性。该细胞有望成为研究治疗糖尿病的种子细胞。
刘艳梅[7]2013年在《小分子化合物诱导大鼠肝干样细胞向胰腺内分泌前体细胞分化的研究》文中提出目的：用小分子化合物在体外诱导肝干样细胞分化为胰腺内分泌前体细胞，建立一种以肝干样细胞来源的胰腺内分泌前体细胞的非转基因的实验方法，为进一步建立肝干细胞高效、特异的向胰腺细胞转分化的技术体系的研究奠定基础。方法：选用5-氮杂胞苷（5-aza-2-deoxycytidine，5-AZA）,曲古霉素A（TrichostatinA, TSA）,维甲酸(Retinoic acid, RA),胰岛素转铁蛋白硒(Insulin, transferrin andselenite, ITS)等小分子化合物，分两步法直接诱导肝干样WB-F344细胞（WB细胞）分化为表达胰腺十二指肠同源框蛋白1(Pancreatic and duodenal homeoboxfactor1, PDX1)的胰腺内分泌前体细胞，用含有1uM-10uM10个不同浓度5-AZA分化培养基诱导WB分化，摸索诱导分化的最佳条件。倒置相差显微镜下观察细胞形态变化，用逆转录聚合酶链反应（RT-PCR）、免疫荧光和葡萄糖刺激试验对第一步诱导细胞（WB-1细胞）和胰腺内分泌前体细胞（WB-A细胞）进行鉴定。结果：1.显微镜观察：5-AZA5uM处理2d，TSA1d,约20%WB细胞由椭圆形或多边形向梭状细胞改变，此时细胞为WB-1细胞；WB-1经RA联合ITS诱导7d，细胞形态类似于WB-1细胞，但核浆比例增大，此时细胞为WB-A细胞。2. WB-1细胞RT-PCR结果：WB细胞不表达胰腺相关基因，表达ALB，AFP，GLUT2等基因。WB-1细胞中未表达PDX1及其它胰腺发育相关基因，肝细胞表达基因ALB，AFP和标志肝细胞去分化的基因C/EBP开始下调。3. WB-A细胞定量PCR和半定量PCR结果：5-AZA浓度为5uM时，获得的WB-A细胞PDX1表达量最高，标志肝干细胞分化的基因C/EBP下调；WB-A表达NGN3, Neurod, NKX2.2等胰腺内分泌前体细胞相关基因；Nestin持续表达，Insulin1表达上调。4. WB-A细胞免疫荧光：WB-A细胞PDX1阳性率约为5%; WB-A细胞Insulin阳性率为0.5%。5. WB-A细胞葡萄糖刺激试验：WB-A细胞对葡萄糖浓度变化无反应。结论：5-AZA, TSA, RA, ITS等小分子化合物能够诱导肝干样细胞表达PDX1,为胰腺内分泌前体细胞。为进一步建立肝干细胞高效、特异的向胰腺细胞转分化的技术体系的研究奠定了基础。
刘岚[8]2008年在《胚胎干细胞的分离培养与定向分化研究》文中研究表明目前,胚胎干细胞的研究主要集中在分离纯化、扩增技术和定向诱导分化几个方面。本研究以胚胎干细胞作为研究对象,研究内容共分以下两部分:第一部分主要是猪胚胎生殖细胞(EG)的分离培养研究。本实验室采用STO细胞作饲养层,在培养基中添加分化抑制因子的方法,已成功分离培养获得猪的EG细胞。为进一步探索猪EG细胞更为理想的培养体系,并获得能够稳定传代的EG细胞系,第一部分以叁个实验展开了对猪EG细胞体外培养条件的进一步研究。实验一研究了条件培养基对猪EG细胞分离培养的影响。在原代分离猪PGCs的过程中,可以同时分离获得猪胎儿成纤维细胞(PEF)和胎儿心脏成纤维细胞(EHF);经培养纯化后,提取这两种细胞的RNA并反转录;RT-PCR检测结果表明,PEF和EHF中均表达猪的LIF基因。因此,分别收集两种细胞的培养液制成条件培养基,用来培养猪的EG细胞。分别使用两种条件培养基或将条件培养基与STO饲养层细胞联合使用来分离培养猪的EG细胞,结果发现条件培养基必须与饲养层细胞联合使用,才能维持EG细胞的增殖未分化状态。实验二研究了Knockout培养基对猪EG细胞分离培养的影响。本实验共分叁组,其中实验组I为Knockout DMEM与Knockout SR组成的Knockout培养基,实验组II为Knockout DMEM/F-12+15%FCS的低渗培养基,对照组为DMEM+15%FCS的普通培养基,叁个实验组中均添加了细胞生长因子。结果表明实验组I与对照组都可以获得能够传代的EG细胞,实验组I培养效果好于对照组;而实验组II不能维持EG细胞稳定传代。因此,Knockout DMEM与Knockout SR组成的Knockout培养基可以用于分离培养猪的EG细胞。实验叁将PGCs与同源胎儿成纤维细胞共培养分离培养猪的EG细胞。培养获得的细胞经AKP染色,SSEA-1免疫荧光染色,转录因子Oct-4免疫荧光表达,核型分析,体外分化实验及电镜观察等多种方法进行鉴定,证明其具有胚胎干细胞的特征。因此,PGCs与同源胎儿成纤维细胞共培养的方法可以用于分离培养猪EG细胞。第二部分以小鼠ES细胞作为研究对象,分叁个实验对不同诱导剂在胚胎干细胞定向分化为胰岛素分泌细胞(IPCs)中的作用以及基因转染方法诱导ES细胞分化为IPCs进行了初步探讨。实验一研究了GLP-1在诱导小鼠ES细胞向IPCs分化中的作用。诱导一周后,经DTZ染色鉴定,阳性细胞很少;诱导两周后,提取细胞总RNA,经RT-PCR检测发现,GLP-1可以使与胰腺发育相关的重要基因Pdx1的表达量上调,但诱导两周仍未能获得大量IPCs。实验二研究了bFGF在诱导小鼠ES细胞向IPCs分化中的作用。诱导后提取细胞总RNA,通过RT-PCR未能检测到IPCs相关基因的表达。实验结果表明,在本实验条件下,向培养基中单一添加bFGF并不能有效地诱导小鼠ES细胞向IPCs分化。实验叁采用基因转染的方法将Pdx1基因与Isl1基因导入小鼠ES细胞诱导其分化。转染24h后,通过RT-PCR的方法检测到Pdx1基因与Isl1基因在小鼠ES细胞中过表达,其中Pdx1表达量明显上调,但是仍未检测到其它IPCs相关基因的表达。这一结果表明,转染时间不够,转染24h后过表达的基因未能诱导小鼠ES细胞的分化。但是由于过表达效果明显,如果添加其他诱导剂在培养基中,继续传代培养,将会有比较好的诱导结果。
唐小龙[9]2009年在《PDX1联合NKX6.1诱导胎儿骨髓间充质干细胞分化为β功能样细胞》文中认为目的:探索转录因子联合细胞因子诱导胎儿骨髓问充质干细胞(FBMSCs)分化发育为β功能样细胞。方法:(1)分别提取胎儿胰腺组织(自然流产的、经患者同意的、3-6个月大小)的总RNA,通过RT—PCR体外扩增人Pdx1、Pax4、NeuroD1、Nkx6.1等转录因子基因,分别克隆到pEGFP-N1或pIRES载体上,构成重组质粒;行L02细胞株转染,以观测目的基因表达、细胞内定位及功能基因的筛选。(2)应用酶切与酶连的方法构建功能上具有协同效应的PDX1与NKX6.1双基因表达的,并对MSCs高效感染率的腺病毒载体。(3)采用高压生理盐水灌冲并联合密度梯度离心法获取人胎儿骨髓组织中单个核细胞,应用贴壁筛选法分离、纯化和扩增胎儿骨髓间充质干细胞(FBMSCs),观察细胞形态,绘制生长曲线,测定对数生长期的细胞倍增时间;检测细胞表面标志;并分别予以成骨和成脂诱导等功能性鉴定。(4)双基因腺病毒(Adxsi-CMV-Pdx1/CMV-Nkx6.1)感染诱导FBMSCs分化,并通过细胞基因表达谱的变化,初步鉴定目的细胞的分化发育阶段;分别应用多种细胞因子进行分步刺激,诱导细胞进一步分化与发育为β功能样细胞。(5)采用链脲佐菌素(STZ)成功制作糖尿病模型鼠后;将诱导的β样细胞植入糖尿病模型鼠肾被膜下,观测对糖尿病模型鼠的血糖调节能力。结果:(1)RT-PCR扩增获得Pdx1、Nkx6.1、NeuroD1与Pax4等转录因子基因并构建质粒载体pEGFP-N1/Nkx6.1、pEGFP-N1/Pax4、PIRES-Pdx1/NeuroD1等,酶切与测序鉴定表明载体构建成功。转染L02细胞后,RT-PCR、免疫细胞化学与间接荧光等检测均证实目的基因在细胞内表达,且相关蛋白分子主要存在于细胞核内。(3)成功构建对MSCs具有高感染效率的双基因表达腺病毒5型载体(Adxsi-CMV-Pdx1/CMV-Nkx6.1),酶切与序列测定结果显示腺病毒载体构建成功。(4)原代培养的FBMSCs经过差速贴壁传代,第叁代后细胞呈形态均一的长梭形,成行排列;流式检测显示,细胞表面标志CD_(106)、CD_(44)和CD_(29)等阳性率均＞98%;HLA-DR、CD_(16)、CD_(34)、CD_(45)和CD_(19)等阳性率均＜2%;未经诱导的FBMSCs均不表达PDX1、NKX6.1、NGN3、GLUT2等转录因子。(5)FBMSCs经重组腺病毒Adxsi-CMV-Pdx1/CMV-Nkx6.1联合下游相应细胞因子分步诱导,细胞相互聚集成胰岛样小体,双硫腙染色细胞质阳性,RT-PCR显示细胞持续稳定表达目的基因Pdx1、Nkx6.1:联合下游第Ⅱ阶段细胞因子诱导后,胰岛素基因开始表达;当联合第Ⅲ阶段细胞因子作用后,MafA与GLUT2开始表达,约10~5个细胞分泌的胰岛素量达(340.4±59.3)mU/L;当在高糖环境下,胰岛素量达(639.8±85.1)mU/L。通过免疫细胞化学与间接荧光显示Pdx1、Nkx6.1与所诱导表达的NGN3与MafA等转录因子均在靶细胞的细胞核内表达,胰岛素、C-肽与GLUT2主要位于细胞质中;Western blotting检测也证实PDX1、NKX6.1均持续稳定表达,胰岛素在诱导的第Ⅱ阶段开始表达。(6)植入所诱导的细胞后第叁天,糖尿病鼠血糖即可恢复正常水平,血糖稳定可持续27天以上。HE染色显示:细胞在肾包膜下多呈圆形,体积较大,胞浆丰富,嗜碱性,并有许多分泌泡样结构,将核挤向一侧,提示细胞分泌功能活跃:免疫组化显示细胞质胰岛素阳性;间接荧光亦显示细胞质中胰岛素与C-肽阳性;两对照组所移植的细胞均不能检测到胰岛素与C-肽。结论:(1)成功构建pEGFP-N1/Nkx6.1、pEGFP-N1/Pax4与pIRES-Pdx1/NeuroD1等质粒载体,经转染证实目的基因具有细胞核定位等生物学功能;筛选并成功构建具有协同效应的Pdx1与Nkx6.1双基因表达的腺病毒载体Adxsi.CMV-Pdx1/CMV-Nkx6.1。(2)本研究以参照国内外分离培养胎儿骨髓间充质干细胞(FBMSCs)方法为基础,采用高压生理盐水灌冲并联合密度梯度离心法分离,应用差速贴壁筛选法进一步分离、纯化并扩增FBMSCs,经多次传代后,细胞表面标志与功能鉴定提示本法可以获得相对较纯的FBMSCs.(3)本研究在PDX1与NKX6.1作用的基础上,联合细胞因子分步诱导FBMSCs向分泌胰岛素的B功能样细胞分化,结果所诱导的细胞具有主动摄取高浓度Zn~(2+),先后开始表达NGN3、MafA、GLUT2等β细胞特征分子;合成并分泌高水平胰岛素,且高浓度葡萄糖能刺激细胞分泌胰岛素;进一步在糖尿病模型鼠体内,该细胞具有降低血糖,并持续维持糖尿病鼠正常血糖的能力,改善STZ糖尿病大鼠的生存状态。结果提示本诱导方案可有效诱导FBMSCs分化为分泌胰岛素的β功能样细胞。
孙冰[10]2006年在《胎肝干细胞诱导分化为胰岛素分泌细胞的研究》文中研究表明本文研究了胎肝干细胞的特性，并诱导其分化为胰岛素分泌细胞，着重进行了胎肝干细胞的体外扩增培养，探讨胎肝干细胞的生物学特性和性质，以及胚胎发育中胎肝前体细胞的类型；采用阶段性化学诱导、生物诱导以及二者相结合的方法，启动胰腺发育的相关基因，使胎肝干细胞分化为胰岛素分泌细胞。全文共分四个部分。第一部分，胎肝干细胞的分离、培养与鉴定。通过体外分离培养并扩增大鼠胎肝干细胞，研究其形态、生物学特性，采用免疫细胞化学分析胎肝干细胞表面标志物的表达情况，初步研究胎肝干细胞体外扩增培养的实验条件，并探讨肝脏的发生发育及肝干细胞的性质及增殖潜能。本实验选取胎龄12～16d SD大鼠，先用机械分离结合酶消化法分离培养胎肝细胞，继而用特异的干细胞培养基进行克隆筛选法获得了数量较多、较纯化的胎肝干细胞克隆。SABC法检测原代、传代后及细胞克隆中的肝干细胞特异表面标志物OV-6、CK-19及胰腺前体细胞特异标志蛋白Nestin的表达。以上研究表明，胎肝干细胞可通过克隆筛选法进行体外扩增，含有特殊细胞因子的干细胞培养基有助于肝干细胞的扩增，可获得较好的效果。培养3d左右开始出现小细胞团，1个月即形成肉眼可见的细胞集落，5～7d传代一次。原代、传代培养的胎肝细胞部分表达OV-6、CK-19及Nestin；细胞克隆几乎全部为干细胞标志阳性细胞，表明胎肝干细胞具有较强的分裂增殖能力。胎肝内存在Nestin阳性干细胞，我们称之为肝源性Nestin阳性祖细胞(nestin-positive hepatic-derived progenitor，NHP cells)，可能是一种更为原始的干细胞在胚胎发育中起重要作用。第二部分，胎肝组织细胞的鉴定及分类。本部分实验旨在研究胎肝干细胞性质的同时也为肝干细胞进行较系统的分类提供实验依据，探讨肝脏中干／祖细胞的类型并筛选出易于向胰腺方向分化的细胞类型，为下一步的诱导获取较佳的种子细胞。采用免疫荧光双标记法，针对OV-6、CK-19及Nestin叁种抗体中二种抗体的不同组合，FITC和Cy3分别标记，DAPI染核，针对胎肝组织和原代、传代及克隆培养的细胞中不同的前体细胞类型进行初步的定位及分类。胎肝中包含了从原始到成熟不同发育程度的各种肝脏细胞：(1)多能前体细胞：OV-6~+nestin~+CK-19~-细胞，可能具有肝胰多向分化潜能；(2)双能前体细胞：OV-6~+CK-19~+nestin~-细胞，是肝脏的双能干细胞，可分化为肝细胞系和胆管细胞系；(3)定向前体细胞或过渡细胞：仅表达OV-6或仅表达CK-19，可能分别是仅有向肝脏方向分化能力的肝前体细胞和向胆管方向分化的细胞，或是正在分化为成熟细胞的过渡阶段；(4)较成熟细胞。体外获得的nestin~+细胞数量较少，大多是与OV-6一同表达，仅表达nestin的细胞数量很少。OV-6~+nestin~+细胞和nestin~+细胞可能具有向胰腺细胞分化的潜能，从胰岛发育的过程推测β细胞与肝细胞有共同的来源，它们共同的祖细胞是胰腺导管上皮内和肝内的nestin阳性细胞。因此我们选取此类肝源性nestin阳性祖细胞作为下一步诱导分化的种子细胞。第叁部分，EGFP-PDX-1融合表达载体电穿孔转染大鼠胎肝干细胞的研究。本室构建了PDX-1绿色荧光蛋白融合表达载体，通过电穿孔转染入大鼠胎肝干细胞以得到较稳定的表达，期望借助于外源性生物因子启动胎肝干细胞中PDX-1基因的表达，从生物诱导方面研究胰腺内分泌发育的关键基因PDX-1在肝干细胞定向分化中的调控机制，为今后定向分化的深入研究提供物质平台。由PDX-1插入pEGFP-C1的多克隆位点中构建的重组质粒pEGFP-C1-PDX-1用电穿孔法转染体外培养的大鼠胎肝干细胞，分析转染前后细胞的生长曲线，荧光显微镜下观察GFP发光情况，RT-PCR鉴定PDX-1基因的表达情况。经电穿孔转染后GFP和PDX-1的融合蛋白能在胎肝干细胞中一起表达，并维持较长的时间，对胎肝干细胞的生长增殖无显着影响(P＞0.05)。构建的PDX-1绿色荧光蛋白融合表达载体能在胎肝干细胞中较持续地表达，为研究PDX-1在干细胞定向分化为胰岛素分泌细胞中的调控作用提供了物质基础。第四部分，胎肝干细胞诱导分化为胰岛素分泌细胞的研究。采用阶段特异性的化学诱导、生物诱导以及二者相结合的方法，模拟胰腺发育的内外环境，使胎肝干细胞分化为胰岛素分泌细胞，并探讨肝干细胞诱导分化为胰岛素分泌细胞的内源性及外源性调控机制。将筛选出的nestin阳性胎肝细胞分组诱导，分别进行分阶段的以Nicotinamide为诱导剂的化学诱导、电穿孔转染PDX-1基因的生物诱导、生物诱导后化学诱导以及未诱导组。ELISA检测细胞上清液中胰岛素的含量，绘制标准曲线后换算出各组细胞释放的胰岛素量并比较；RT-PCR检测与胰腺发育相关的基因和肝细胞特异基因在各组的表达情况。Nestin~+胎肝细胞经生物、化学及二者结合法诱导后分泌的胰岛素量分别为0.539、0.943和5.58ng／ml上清液(1×10~5细胞)，与阴性对照组相比均有显着性差异(P=0.000)，其中任意两组相比也有统计学意义(P=0.000)。各诱导组均表达胰岛素Ⅰ、GLUT-2及肝干细胞标志HNF-1、AFP和c-met，而不表达胰高血糖素、生长抑素和ALB。生物诱导组和生化诱导组表达PDX-1和胰岛素Ⅱ，化学诱导组弱表达这两个基因。生化诱导法通过模拟细胞内外的微环境能获得较高的胰岛素分泌水平，并表达一系列胰腺发育相关的基因，但是，nestin~+胎肝细胞诱导分化为胰岛素分泌细胞的机制还需更深入的研究，以实现胰岛素的生理性分泌调节。
参考文献：
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[5]. 诱导人胚胎干细胞向胰腺内分泌细胞分化及其机制研究[D]. 刘晓芳. 中国人民解放军医学院. 2013
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[9]. PDX1联合NKX6.1诱导胎儿骨髓间充质干细胞分化为β功能样细胞[D]. 唐小龙. 暨南大学. 2009
[10]. 胎肝干细胞诱导分化为胰岛素分泌细胞的研究[D]. 孙冰. 第一军医大学. 2006
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