马丰英[1]2011年在《猪支原体肺炎新型疫苗及其单克隆抗体的制备与应用》文中指出猪支原体肺炎又称猪气喘病或者猪地方流行性肺炎,分布广泛,以慢性、高度接触性、传染性、高发病率及低死亡率等为特点。目前,商品化预防猪支原体肺炎的疫苗主要是兔化弱毒苗、灭活苗以及亚单位疫苗。而现有疫苗存在着成本较高、免疫途径不便、免疫效果不佳等缺陷。新型疫苗即亚单位疫苗以及基因工程活疫苗的研制也就成为较为理想的研究方向。猪肺炎支原体的p36、p46、p65、p97和Nrdf基因是其保护性抗原,也是优秀的疫苗候选抗原。本研究拟通过基因工程相关技术,大量地获得猪肺炎支原体p36、p46、p65和p97R1-Nrdf1的重组蛋白,从而制备相应的猪支原体肺炎亚单位疫苗,以期解决传统亚单位疫苗抗原制备难的问题。而近年来的研究证实,减毒沙门氏菌作疫苗载体具有有效递呈抗原、诱发细胞和粘膜免疫、成本低廉、副作用低等优点。本研究拟将抗原基因p36、p46、p65和p97R1-Nrdf克隆至无抗性的原核表达质粒,成功构建了能够有效表达外源抗原的无抗性重组减毒猪霍乱沙门氏菌,并对重组菌株进行初步评价,为猪支原体肺炎的防治奠定了基础。目前,用于检测猪肺炎支原体的诊断方法中分离培养很难,且需时长,检出率低；间接血凝试验存在抗原难保存的问题；PCR技术条件要求高,易呈假阴性和假阳性,检测成本也高；ELISA由于猪肺炎支原体与猪鼻支原体、絮状支原体存在共同抗原,导致非特异性交叉反应增加。而单抗可特异性地提高抗原抗体的反应,使交叉反应减少,从而保证试验结果的准确性。主要研究内容如下：1.猪肺炎支原体亚单位疫苗的研制根据Gene-Bank中的已知序列设计引物,扩增p46和p65蛋白基因,将该片段克隆至表达质粒pGEX-KG,得到重组质粒pGEX-46和pGEX-65。利用定点突变以及重组表达技术获得猪肺炎支原体主要免疫原膜蛋白p46和p65。将p46和p65蛋白与实验室之前构建表达的p36蛋白组合,从而制备相应猪支原体肺炎亚单位疫苗。为了进一步提高猪支原体肺炎亚单位疫苗的免疫效果,本试验还将串联重组表达的p97R1-Nrdf蛋白与p36、p46和p65蛋白组合在一起,制备了另外一种含5种蛋白的猪支原体肺炎亚单位疫苗,以期达到更好的免疫效果。设立以重组蛋白p36、p46和p65为试验Ⅰ组,p36、p46、p65和p97R1-Nrdf为试验Ⅱ组,猪支原体疫苗安百克(M+PAC)为试验Ⅲ组,PBS+佐剂为空白对照组来免疫BALB/c小鼠。检测小鼠血清、肺脏及经蛋白刺激脾淋巴细胞的猪肺炎支原体抗体、IFN-γ以及IL-4。试验结果为：试验Ⅱ组的猪肺炎支原体抗体水平极显着高于试验Ⅰ组、Ⅲ组(P<0.01)；试验Ⅱ组的IFN-y水平极显着高于试验Ⅲ组,而试验Ⅱ组与Ⅰ组、试验Ⅰ组与Ⅲ组的IFN-y水平均无显着差异(P<0.05)；试验Ⅰ组、Ⅱ组、Ⅲ组的IL-4水平差异不显着(P<0.05),但都极明显高于对照组(P<0.01)；肺的检测结果中猪肺炎支原体抗体、IFN-y和IL-4水平呈现一致性,为试验Ⅱ组>试验Ⅰ组>试验Ⅲ组>对照组；而经刺激的脾淋巴细胞检测结果则为试验Ⅱ组的猪肺炎支原体抗体和IFN-y水平最高,而IL-4水平为试验Ⅲ组最高。由此可见,大肠杆菌所表达的蛋白具有良好的免疫原性,可以诱导小鼠产生较好的免疫效果,结果显示这两种亚单位疫苗在激活体液免疫的同时也激活了细胞免疫。其中,试验Ⅱ组通过体液免疫和细胞免疫途径,所产生的猪支原体肺炎的抗体水平最高；试验Ⅰ组亦能够通过这两种免疫途径达到与试验Ⅲ组同样的免疫效果。2.猪肺炎支原体基因工程活疫苗的研制根据Gene-Bank中的已知序列设计引物,并利用分子克隆技术将能够原核表达的猪肺炎支原体p46和p65基因克隆至表达质粒pYA3493中,得到重组质粒pYA-46和pYA-65。重组质粒和pYA3493分别电转入asd基因缺失株的猪霍乱沙门氏菌C500-,制备重组菌株C46(pYA-46)和C65(pYA-65)以及空载体对照菌株CpYA(pYA3493)。Western-blot结果显示p46和p65基因能在重组菌株中表达。研究结果显示,重组菌株C46(pYA-46)和C65(pYA-65)与亲本菌株C500相比,其生化和生长特性未发生改变,插入的外源基因能分泌表达亦稳定存在。将重组菌株C46和C65与实验窒构建的重组菌株C36(pYA-36)组合制备基因工程活疫苗,同时再与C97R1-Nrdf(pYA-97R1-Nrdf)结合制备另一种表达5种免疫原性蛋白的基因工程苗,并以小鼠为动物模型评价重组菌株在口服、肌注两种不同免疫途径的免疫原性。疫苗对小鼠的免疫原性结果显示：口服C36+C46+C65+C97R1-Nrdf组猪肺炎支原体抗体极显着高于口服C36+C46+C65组和肌注商品疫苗组(P<0.01),但与肌注C36+C46+C65组无显着差异(P>0.05)；IFN-γ则为肌注C36+C46+C65组显着高于肌注商品疫苗组(P<0.05),而与口服C36+C46+C65组或C36+C46+C65+C97R1-Nrdf组之间的差异均不显着(P>0.05)；IL-4的水平则呈现出口服C36+C46+C65组>口服C36+C46+C65+C97R1-Nrdf组>肌注商品疫苗组>肌注C36+C46+C65组,但各组之间的差异均不显着(P>0.05)。各对照组的猪肺炎支原体抗体、IFN-y以及IL-4均与试验组差异极显着(P<0.01)。由此可见,所构建的表达猪肺炎支原体免疫原性基因的重组沙门氏菌,对小鼠具较好免疫原性,且采用肌注时其免疫原性更好,有望发展为猪支原体肺炎的基因工程疫苗。3.抗猪肺炎支原体p36蛋白单克隆抗体的制备与应用利用本实验室构建的含pGEX-36质粒的大肠杆菌经IPTG诱导,谷胱甘肽琼脂糖凝胶对可溶性蛋白的纯化,得到融合蛋白GST-36。将重组蛋白采取常规皮下免疫和腹腔加强免疫相结合的方式免疫BALB/c小鼠。SP2/0骨髓瘤细胞与免疫小鼠脾细胞融合,经ELISA筛选,5次有限稀释法克隆,获得了19株抗猪肺炎支原体p36蛋白的的杂交瘤细胞。Western-blot结果显示,单克隆抗体能够与p36蛋白发生特异性反应。经检测细胞培养上清的效价最为1：25600至1：51200,小鼠腹水效价为1：13107200至1：52428800；抗体亚型分别为IgG2b和IgG1,轻链为K型。单克隆抗体的制备为准确而特异诊断猪肺炎支原体的免疫组化方法的建立提供了保障。利用制备的抗猪肺炎支原体p36蛋白的单克隆抗体作为一抗,建立单抗免疫组化方法用于检测空白攻毒组、阴性对照组组以及临床疑似病例的猪肺组织。试验结果显示,该免疫组化方法定位准确且成本较低,比PCR方法更具准确性。同时进一步证实本试验得到的抗猪肺炎支原体p36蛋白的单克隆抗体具有较好的特异性,从而使抗原抗体特异性反应,减少交叉反应,使试验的结果更加准确而特异。
王亮[2]2008年在《猪肺炎支原体P97蛋白单克隆抗体的制备》文中认为猪肺炎支原体(Mycoplasma hyopneumoniae,Mhp)是引起猪气喘病(MycoplasmaPneumoniae of swine,MPS)的病原。MPS广泛分布于世界各地,以接触性、高度传染性、慢性、高发病率和低死亡率为特点,由于Mhp能够破坏呼吸道黏膜-纤毛屏障,从而继发其他致病菌的感染,给养猪业造成巨大的经济损失。该病早期检测比较困难以及缺乏特效的防治药物,因此在疾病控制方面至今未能取得令人满意的效果。伴侣蛋白Dnak是猪肺炎支原体的特异性外膜蛋白,伴侣蛋白Dnak的C端是其主要的抗原决定簇。P97蛋白是目前研究最为深入的Mhp表面的黏附因子,P97蛋白的C端也是其主要的抗原决定簇。本研究依据GenBank中公布的232株基因序列(AE017332),以Mhp中国分离株Yin-1为模板利用合成的特异性引物,扩增了DnaK基因的C末端,得到500bp的目的片段。扩增了P97基因的C末端,得到670bp的目的片段。并将PCR产物分别克隆到pET-30a载体上,经PCR、酶切方法鉴定正确后,并送测序。测序结果与GenBank公布的标准株yin-1株的DNA同源性为99%以上。鉴定阳性的重组质粒转化到大肠杆菌(DE3)中进行原核表达。获得的重组蛋白分别命名为30a-DnakC-P97C和30a-P97C。经超声裂解,SDS-PAGE分析,重组蛋白均主要以可溶形式存在于上清液中,分别在57kD和36kD处分别获得特异性条带。经Western-blot抗原性分析,均具有较好的免疫原性。利用Histag亲和层析柱,对重组蛋白30a-DnakC-P97C和30a-P97C进行分离纯化,纯化产物经SDS-PAGE电泳显示为单一蛋白条带,纯化效果较好。以30a-DnakC-P97C作为免疫抗原分别与弗氏完全佐剂和弗氏不完全佐剂乳化,免疫8周龄的雌性BALB/c小鼠,每只每次50μg,间隔两周免疫一次,最后一次加强免疫不加佐剂,3d后,取免疫小鼠脾细胞和骨髓瘤细胞SP2/0进行融合。以纯化30a-P97C作为包被抗原,用间接ELISA平行筛选阳性克隆,经有限稀释法叁次亚克隆后,获得两株针对P97的能稳定分泌特定性抗体的杂交瘤细胞株,分别命名为A3C9和B4D5。生物学特性鉴定表明,腹水单抗A3C9和B4D5的间接ELISA效价分别为1∶10~5和1∶10~6,亚型鉴定分别为IgG2b和IgG2a亚类,且轻链均为k链。相加ELISA试验表明,针对P97的两株单抗识别的不是同一抗原表位。经Western-blot分析表明,两株单抗特异性地与猪肺支原体Yin-1株97KD左右的抗原成分发生反应。而与其他相关支原体:丝状支原体丝状亚种SC型标准株(PGI)、丝状支原体丝状亚种LC型标准株(Y-goat)、山羊支原体山羊肺炎亚种(Mccp)、猪鼻支原体(Mh)无交叉反应,表明单抗为针对猪肺炎支原体的特异性单抗。本试验获得的单抗为更深入的分析Mhp的结构、功能及生物学诊断提供有力工具。
李少松[3]2007年在《抗山羊传染性胸膜肺炎支原体PG_3单克隆抗体的制备及研究》文中指出目的使用本实验室研制的改良型固体Hartleys培养基培养丝状支原体山羊亚种PG_3株，获得菌体经冻融裂解制备抗原；通过动物免疫、间接ELISA方法建立、细胞融合、阳性克隆筛选、亚克隆，获得能分泌抗体的单克隆细胞株；制备、纯化腹水，进行效价和特异性鉴定，以获得效价高、特异性强的单克隆细胞株；为研究丝状支原体山羊亚种表面抗原结构、筛选保护性抗原奠定基础；同时以单克隆抗体为包被原，山羊抗PG_3纯化多抗为夹心抗体，建立双抗夹心ELISA方法，为山羊传染性胸膜肺炎的诊断、流行病学调查建立一种简单、快速、特异性强、灵敏度高的方法。方法结合国内外文献报道依据本实验室的具体情况，使用本实验室研制成功的“改良型Hartleys培养基”进行丝状支原体山羊亚种PG_3的复苏和扩大培养；从固体培养基上洗脱菌体，经低速离心去除沉淀，上清液高速离心获得菌体，使用PBS洗涤叁次，-20℃冻融裂解后低速离心弃除沉淀，获得上清即为膜蛋白，测定蛋白含量。将所得膜蛋白以一定量与弗氏佐剂混合充分乳化，免疫BALB／c小鼠，330μg／只，共免疫四次；采血测定血清抗体效价并建立间接ELISA方法，待血清效价大于1：5000时进行细胞融合。取血清效价高的BALB／c小鼠脾细胞与SP2／0骨髓瘤细胞在50％PEG1500的作用下进行细胞融合；使用已建立的间接ELISA进行筛选，阳性孔采用有限稀释法进行亚克隆；得到的单克隆细胞株进行扩大冻存及腹水制备。腹水进行效价测定、特异性检测；使用试剂盒测定其抗体亚型，进行抗体纯化、纯度检测。以纯化的单抗包被酶标板、纯化山羊抗PG_3多抗作为夹心抗体，建立双抗夹心ELISA方法并进行特异性、灵敏度检测及初步应用。结果丝状支原体山羊亚种PG_3在改良型Hartleys培养基得到成功复苏和扩大培养，膜蛋白质含量为1.65mg／mL；四次免疫后小鼠抗体效价达到1：6400以上。以50％PEG1500进行细胞融合，融合孔为364孔，融合率达到75.8％；经间接ELISA筛选，共得31个阳性孔，阳性率为8.5％，两次亚克隆后得到四株单克隆细胞株：1C10、1E2、2E8、2F12，经腹水制备、效价检测、特异性检测最终得到1E2株，其抗体亚型为IgG_3、κ型，SDS-PAGE检测纯度较高。建立的双抗夹心ELISA单抗包被浓度为1：200稀释(20μg／mL)，山羊抗PG_3多抗工作浓度为1：400稀释，其检测下限为2μg／mL，检测猪肺炎支原体、鸡滑液支原体、大肠杆菌、沙门氏菌、金黄色葡萄球菌、链球菌、马血清等均为阴性。使用双抗夹心ELISA和间接ELISA对12份有临床症状山羊的鼻腔拭子、血清进行检测，前者阳性率为58.3％，后者阳性率为66.7％；对于其中症状典型的5只，双抗夹心ELISA检测全为阳性，阳性率100％，间接ELISA阳性为3只，阳性率60％。仅偶见干咳的7只，双抗夹心ELISA检测出2只阳性，阳性率28.6％，间接ELISA法检测出5只阳性，阳性率71.4％。结论使用改良型Hartleys培养基及冻融法成功地获得了PG_3膜蛋白，通过动物免疫、细胞融合、间接ELISA筛选、亚克隆获得四株能分泌抗体的单克隆细胞株，以其中一株效价较高、特异性强的单克隆抗体为包被原，建立了双抗夹心ELISA检测方法。双抗夹心ELISA与间接ELISA相比适合于对早期发病山羊的检测、诊断，而间接ELISA更适合用于流行病学调查。
蒋菲[4]2016年在《绵羊肺炎支原体EF-Tu和HSP70蛋白免疫原性分析及补体ELISA方法的建立》文中提出绵羊肺炎支原体(Mycoplasma ovipneumoniae, M. ovipneumoniae)是一种可引起绵羊、山羊、大角羊和野生小反刍动物慢性肺炎的主要病原,主要导致患病动物体重下降、痉挛性咳嗽、贫血等症状,病程可持续数月至数年。目前我国已从四川、新疆、宁夏、河北等多个省份的羊群中分离到该病原,且近些年该病在世界各地均有发生,对羊养殖业造成极大的经济损失。免疫预防及血清学诊断是控制动物传染病的有效手段,因此疫苗研究筛选具有良好免疫原性蛋白及建立血清学检测方法对预防控制本病极为重要。本研究选取绵羊肺炎支原体细菌延伸因子Tu (elongation factor Tu, EF-Tu)蛋白和热休克70蛋白(heat shock protein 70, HSP70),对其进行免疫原性分析,并建立了绵羊肺炎支原体血清抗体ELISA检测方法,以期为绵羊肺炎支原体病的防治提供一些研究基础。本文首先对绵羊肺炎支原体临床分离株Mo-1的elongation factor Tu, EF-Tu) EF-Tu和HSP70蛋白进行了表达和纯化。然后,通过免疫印迹试验证明EF-Tu和HSP70两种蛋白均存在于由绵羊肺炎支原体膜蛋白的TritonX-114提取物中。将原核表达的重组蛋白rEF-Tu(recombinant EF-Tu)和rHSP70 (recombinant HSP70)分别免疫BALB/c小鼠,进行免疫原性分析。结果表明,与绵羊肺炎支原体全细胞提取物(Mo extracts)免疫对照组比较,上述两种重组蛋白均能刺激小鼠产生较高的IgG水平,且IgG1和IgG2a水平显着高于Mo extracts对照组。rEF-Tu和rHSP70免疫组小鼠血清中Thl型(IFN-γ、TNF-α、IL-12p70)和Th2型(IL-4、IL-5、IL-6)细胞因子水平显着高于Mo extracts对照组。ELISPOT试验进一步证实, rHSP70比rEF-Tu和Mo extracts能诱导更多的特异性分泌IFN-γ的淋巴细胞。由此说明,rEF-Tu和rHSP70蛋白可使小鼠同时产生较强体液免疫应答及细胞免疫应答。另外,体外生长抑制试验表明,抗rHSP70、抗rEF-Tu和抗Moextracts小鼠血清均可有效抑制固体培养基上绵羊肺炎支原体的生长,其中rHSP70组抑菌效果优于rEF-Tu组和Mo extracts组。本文利用菊糖提纯豚鼠血清中的补体C3b成分,免疫小鼠后筛选得到可用于建立补体结合酶联免疫吸附试验方法(complement fixation ELISA, CF-ELISA)的抗豚鼠补体C3b单克隆抗体。经鉴定,所获得的单克隆抗体具有高的亲和力及特异性,可特异识别豚鼠补体C3bα'链。在此基础上,选择免疫原性较优且具有高度保守性的rHSP70作为包被抗原,建立了Mo-rHSP70-CF-ELISA和Mo-rHSP70-iELISA方法,两者均具有良好的敏感性和特异性。用Mo-rHSP70-CF-ELISA、Mo-rHSP70-iELISA以及文献报道的以全菌抗原为包被抗原的绵羊肺炎支原体间接ELISA方法(Mo-iELISA)对361份采集自羊场的临床血清样品进行了检测。结果表明,Mo-rHSP70-CF-ELISA和Mo-rHSP70-iELISA方法的Kappa系数为0.7640,两种方法一致性良好。Mo-rHSP70-CF-ELISA和Mo-rHSP70-iELISA分别与Mo-iELISA比较,Kappa系数分别为0.8150和0.8649,一致性良好。综上所述,绵羊肺炎支原体EF-Tu和HSP70蛋白可诱导较强的体液免疫反应和细胞免疫反应,具有良好的免疫原性,有可能成为绵羊肺炎支原体疫苗的候选抗原。另外,我们以Mo-rHSP70作为包被抗原建立的Mo-rHSP70-CF-ELISA和Mo-rHSP70-iELISA方法具有较高的灵敏度及特异性,可用于绵羊肺炎支原体血清抗体的检测.。
乔祖健[5]2008年在《猪肺炎支原体伴侣蛋白DnaK单克隆抗体的制备及鉴定》文中研究说明猪肺炎支原体(Mycoplasma hyopneumoniae,Mhp)是猪地方性肺炎(swine Enzootic Pneumnoia,SEP)的病原体。SEP亦称猪气喘病(Mycoplasma Pneumoniae of swine,MPS),广泛分布于世界各地,以接触性、高度传染性、慢性、高发病率和低死亡率为特点。由于Mhp能够破坏呼吸道黏膜-纤毛屏障而继发其他致病菌的感染,使死亡率大大提高,给养猪业造成巨大的经济损失。由于早期检测的困难和缺乏有效的药物,在疾病控制方面至今未能达到满意的效果。伴侣蛋白Dnak是猪Mhp的特异性外膜蛋白,该蛋白C端的是其主要的抗原决定簇。本研究依据GenBank中公布的Yin-1基因序列,以猪Mhp中国分离株Yin-1为模板,利用所合成的特异性引物,扩增DnaK基因的C末端,得到1 000bp的目的片段。将该序列克隆到pMD-18-T载体上,经PCR、酶切方法鉴定正确后测序,测序结果与GenBank公布的Yin-1标准株的DNA比较,二者同源性达99%以上。并将测序结果正确的片段分别克隆至表达载体pET-28a和pGEX-6P-1中,转化到大肠杆菌(DE3)中进行原核表达。将所获得的重组蛋白分别命名为6P-1-DnakC和28a-DnakC。经超声裂解,进行SDS-PAGE分析,表明重组蛋白均主要以可溶形式存在于上清液中,在42kD和65kD处分别获得特异性条带。Western-blot抗原性分析结果表明二者均具有较好的免疫原性。利用Histag亲和层析柱,对重组蛋白28a-DnakC进行分离纯化,纯化产物经SDS-PAGE电泳分析,结果显示为单一蛋白条带,纯化效果较好。以6P-1-DnakC作为免疫抗原分别与弗氏完全佐剂和弗氏不完全佐剂乳化,免疫8周龄的雌性BALB/C小鼠,每只每次500μg,间隔两周免疫一次,最后一次加强免疫不加佐剂,5d后取免疫小鼠脾细胞和骨髓瘤细胞SP2/0进行融合。以纯化28a-DnakC作为包被抗原,用间接ELISA平行筛选阳性克隆,经有限稀释法叁次亚克隆后,获得两株能稳定分泌特定性抗体的杂交瘤细胞株,分别命名为1AD10和2AF11。生物学特性鉴定表明,腹水单抗1AD10、2AF11的间接ELISA效价分别为1:105和1:104,亚型鉴定分别为IgG2b和IgG2a亚类,且轻链均为k链。相加ELISA试验表明,两株单抗识别不同的抗原表位。经Western-blot分析表明,两株单抗特异性的针对猪肺支原体Yin-1株65KD和42KD左右的抗原成分。而与其他相关支原体,如丝状支原体丝状亚种SC型标准株(PGI)、丝状支原体丝状亚种LC型标准株(Y-goat)、山羊支原体山羊肺炎亚种(Mccp)、猪鼻支原体(Mh)无交叉反应,表明两株单抗为针对猪肺炎支原体的特异性单抗。本试验获得的抗Dnak单抗将为更深入地分析Mhp的结构、功能及生物学诊断提供有力工具。
郑传发[6]2007年在《抗猪肺炎支原体单克隆抗体的制备及初步应用》文中提出猪肺炎支原体(Mycoplasma hyopneumoniae,Mhp)是猪气喘病的主要病原体。该病分布广泛,发病率高,自身致死率不高,但由于Mhp能破坏呼吸道黏膜-纤毛屏障,从而继发其它致病菌的感染,提高致死率。由于早期检测的困难和缺乏有效的药物,在本病控制方面至今未能达到满意的效果。本实验以Mhp168株为材料,研制出其特异性单克隆抗体,并利用该单克隆抗体建立了间接竞争ELISA方法,检测猪肺炎支原体抗体,证明有一定的实用性。实验用KM2培养基(含猪支原体抗体阴性血清)培养Mhp168株,高速离心收集菌体,用PBS悬浮沉淀。悬浮物反复冻融再超声波裂解,用获得的全菌抗原免疫BALB/c小鼠。取脾细胞与Sp2/0骨髓瘤细胞融合,经间接ELISA和IHA筛选,有限稀释法3次克隆,获得了1株稳定分泌抗Mhp单克隆抗体的杂交瘤细胞株,命名为3G5。经亚类鉴定试剂盒测定,所产生的抗体为IgG型;经ELISA方法测定,腹水效价为1:6400;通过Western-blot、间接ELISA和IHA确定,该株单克隆抗体针对Mhp70kD左右的蛋白。单抗经硫酸铵盐析法纯化后,蛋白含量为4.37mg/mL。以Mhp全菌纯化蛋白为包被抗原,利用该单克隆抗体与Mhp猪血清竞争该抗原,建立间接竞争ELISA方法检测Mhp抗体。优化的反应条件为:Mhp蛋白抗原的最佳包被浓度为15μg/mL(1:800稀释);单克隆抗体的工作浓度为10.9μg/mL(1:400稀释);竞争反应作用时间为37℃1h;酶标抗体的工作浓度为1:5000,37℃作用1h;底物作用时间为10min。经ELISA检测,该方法具有较好的特异性、稳定性和重复性。通过检测28份临床病料血清,结果与IDEXX Mhp抗体检测试剂盒的检测结果对比,符合率达到82.1%。从而为Mhp抗体检测提供了一种方便实用的实验室诊断方法,为猪气喘病的控制奠定了基础。
张悦[7]2013年在《猪肺炎支原体P65蛋白的克隆表达、单克隆抗体制备及阻断ELISA抗体检测方法建立》文中提出猪肺炎支原体(Mycoplasma hyopneumoniae, Mhp)是引起猪支原体肺炎(Mycoplasma pneumoniae of swine, MPS)的病原,给养猪业造成巨大的经济损失。由于缺乏对具有良好免疫原性的Mhp特异性蛋白的深入研究,使得Mhp在致病机制、血清学检测方法和新型疫苗的研究发展上受到一定限制,从而影响了对MPS的控制。本试验利用原核表达系统表达了Mhp膜蛋白P65,并用该重组蛋白免疫小鼠,利用Mhp全菌蛋白和P65蛋白作为包被抗原进行ELISA筛选,制备抗P65单抗,然后使用该重组蛋白作为包被抗原,酶标单抗作为二抗,成功建立了单抗阻断ELISA检测方法。本研究主要从以下几个方面展开：1、根据GenBank公布的猪肺炎支原体(Mhp)P65基因序列,利用Primer5.0软件设计合成引物,通过PCR扩增目的基因,将含有叁个稀有密码子的前922bp进行基因合成,剩余910bp通过PCR扩增出来,然后采用SOE-PCR方法将前段基因片段和后段基因片段连接起来,插入到表达载体pET-32a(+)中,构建重组表达质粒pET-32a(+)/P65.将重组质粒pET-32a(+)/P65导入大肠杆菌BL21(DE3)进行表达,经1%IPTG诱导表达3h后,蛋白的表达量最高,并用Protino Ni-TED2000Packed Columns进行亲和纯化,得到较纯的目的蛋白。Western-blot分析表明表达蛋白具有良好的反应原性。2、本研究利用重组P65蛋白作为免疫原,利用P65蛋白、Mhp168株F350代全菌蛋白、空载体蛋白筛选能分泌P65蛋白抗体的杂交瘤细胞株,经过3次亚克隆,获得了1株能稳定分泌抗P65蛋白抗体的杂交瘤细胞株,命名为3G12。Western Blot分析显示,3G12能与Mhp168株F350代全菌蛋白及大肠杆菌表达的P65重组蛋白产生反应,与空载体蛋白、猪鼻支原体(Mycoplasma hyorhinitis)蛋白不产生反应。亚型鉴定显示,该抗体的重链为IgGl,轻链为k链。采用间接ELISA测得3G12腹水与P65蛋白反应的效价为1：4000000,与168全菌蛋白反应的效价为1：25600,腹水经商品化的Protein G蛋白柱纯化得到纯度较高的单抗。3、本研究将重组表达的蛋白P65作为包被抗原,把纯化的单抗进行HRP酶标作为二抗,通过优化其反应条件成功建立阻断ELISA方法。用酶标仪读取各孔OD450nm值,按照以下公式计算阻断率：阻断率(percentage inhibition/PI)=(阴性血清OD450nm值-被检血清OD450m值)/阴性血清OD450nm值×100%。通过对已知血清的检测,使用ROC标准曲线分析,当OD450为0.563,敏感性和特异性的和最大,即为临界值,此时阻断率为36.456%。当OD450<0.563时,血清为阳性；当OD450>0.563时,血清为阴性。同时试验证明,该方法与IDEXX试剂盒的符合率为92.92%,重复性较好,且与其他病原无交叉反应。可用于Mhp流行病学调查和疾病诊断。综上所述,本研究成功表达Mhp重组蛋白P65,获得了1株分泌Mhp P65蛋白单克隆抗体的杂交瘤细胞株3G12,并成功建立了单抗阻断ELISA方法,从而为进一步研究Mhp致病机理以及建立Mhp血清学诊断方法奠定基础。
缪芬芳[8]2011年在《猪肺炎支原体P46蛋白与DnaK蛋白单克隆抗体的制备与鉴定》文中研究指明猪支原体肺炎(Mycoplasma Pneumoniae of Swine,MPS)是由猪肺炎支原体(Mycoplasma hyopneumoniae,Mhp)引起的一种慢性呼吸道疾病,其主要临床症状为咳嗽和气喘,病变特征是在肺尖叶、心叶、中间叶和膈叶前缘呈肉样或虾肉样实变,该病发病率高而死亡率低。本研究利用Mhp 168株F350代全菌蛋白免疫小鼠,以期获得能稳定分泌针对Mhp细胞膜蛋白P46蛋白、热休克蛋白DnaK蛋白的单克隆抗体杂交瘤细胞株。1.抗Mhp膜蛋白P46蛋白单克隆抗体本研究利用本实验室保存的Mhp P46蛋白重组阳性质粒大量表达并纯化的P.46蛋白作为检测原,Mhp168株F350代全茵蛋白作为免疫原,按400μg/只的剂量与等量弗氏完全佐剂进行乳化,经皮下多点注射免疫4-6周龄BALB/c小鼠。每隔2周用弗氏不完全佐剂乳化的168全菌蛋白免疫1次,并在融合前3d用168全菌蛋白加强免疫1次。取脾细胞与Sp2/0骨髓瘤细胞进行融合,利用P46蛋白、Mhp168全菌蛋白、空载体蛋白筛选能分泌P46蛋白抗体的杂交瘤细胞株,经过3次亚克隆,获得了1株能稳定分泌抗P46蛋白抗体的杂交瘤细胞株,命名为2F3.Western Blot分析显示,2F3能与Mhp168株F350代全菌蛋白及大肠杆菌表达的P46重组蛋白产生反应,与空载体蛋白、猪鼻支原体(mycoplasma hyorhinitis)蛋白不产生反应。2F3与Mhp 168株F105代强毒株、J株、Mhp临床分离株XLW-1、XLW-2、XLW-4、AH、XLW-4、WX有特异性反应。亚型鉴定显示,该抗体的重链为IgG2b型,轻链为K链。采用间接ELISA测得2F3细胞上清与P46蛋白的反应效价为1：1600,与168全菌蛋白的反应效价为1：160；腹水与P46蛋白的反应效价为1：204800,与168全菌蛋白的反应效价为1：51200,腹水经辛酸-硫酸铵沉淀法纯化后及冻干后抗体效价均为1：51200。2.抗Mhp热休克蛋白DnaK蛋白单克隆抗体本研究利用本实验室保存的猪肺炎支原体DnaK蛋白重组阳性质粒大量表达及纯化DnaK蛋白。利用超声破碎获得的168株F350代全菌蛋白作为免疫原免疫小鼠,免疫剂量为400gg/-。应用淋巴细胞杂交瘤技术,取脾细胞与Sp2/0骨髓瘤细胞进行融合,用DnaK蛋白、168全菌蛋白、空载体蛋白叁者筛选能分泌DnaK蛋白抗体的杂交瘤细胞株,经过3次亚克隆,获得了3株能稳定分泌DnaK蛋白抗体的杂交瘤细胞株,命名为3E2、5D10、3A8。Western Blot分析显示,3E2、3A8及5D10能与Mhp全菌蛋白及大肠杆菌表达的DnaK重组蛋白产生反应,与空载体蛋白不反应,3E2及5D10与猪鼻支原体无反应,而3A8与猪鼻支原体产生反应。3E2、5D10与Mhp168株F105代强毒株、J株、Mhp临盏床分离株XLW-1、XLW-2、XLW-4、AH、XLW-4、WX有特异性反应。亚型鉴定结果显示,3株杂交瘤细胞的重链均为IgG1型,轻链菌为K链。采用间接ELISA测得3E2、5D10、3A8细胞上清与DnaK蛋白的反应效价为1：51200-1：102400,与168全菌蛋白的反应效价均为1：640-1：1280；3株单抗腹水与DnaK蛋白及168全菌蛋白反应的效价均为1：106,腹水经辛酸-硫酸铵沉淀法纯化后效价仍为1：106。综上所述,本研究共获得了1株分泌Mhp P46蛋白单克隆抗体的杂交瘤细胞株,3株分泌Mhp DnaK蛋白单克隆抗体的杂交瘤细胞株,从而为进一步Mhp致病机理的研究,Mhp P46蛋白及DnaK蛋白抗原表位的确定,以及Mhp血清学诊断方法的建立奠定基础。
胡茂志[9]2004年在《猪肺炎支原体单克隆抗体的制备与鉴定》文中研究指明猪肺炎支原体(Mycoplasma hyopneumoniae，Mhp)是猪地方性肺炎(猪气喘病)的病原体。此病分布广，发病率高，致死率低。由于Mhp能够破坏呼吸道粘膜-纤毛屏障，从而容易继发其他病原的感染，导致致死率升高。由于早期诊断的困难和缺乏有效的药物(包括疫苗)，在该病控制方面至今未能达到令人满意的效果。本实验以Mhp中国株ZCF23为材料，研制出其特异性单克隆抗体，为摸索Mhp诊断新方法奠定了基础。 1、用全菌蛋白免疫制备猪肺炎支原体单克隆抗体 用KM2培养基(含马血清)培养Mhp ZCF23株。高速离心收获培养物，用PBS悬浮沉淀。悬液经反复冻融裂解后作为免疫原，与等量弗氏完全佐剂(首次)、不完全佐剂(后叁次)混合后腹腔注射免疫8周龄BALB／c小鼠(400μg／只)，间隔为两周。尾静脉追加免疫相同剂量抗原(不加佐剂)5天后，取免疫鼠脾细胞和骨髓瘤Sp2／0细胞进行融合。用间接ELISA方法反复筛选阳性克隆，并经有限稀释法3次克隆化后，得到了5株分泌特异性抗体的单克隆细胞株，分别命名为：11C6、14C11、11B6-1、10C11-2和12E7-1。生物学特性鉴定表明，五株腹水单抗的间接ELISA效价均在1∶10~4左右；免疫球蛋白亚类均为IgG_3。免疫印迹结果表明，五株单抗所针对的抗原表位在90kD、40kD、70kD和60kD左右，而且不与马血清蛋白反应，说明以上单抗均是针对Mhp蛋白的特异性单抗。 2、猪肺炎支原体种特异性蛋白P36基因的克隆与表达 已有报道，P36蛋白是Mhp种特异性蛋白，在自然感染过程中，能够产生较强的抗体反应。而且，P36基因在Mhp进化过程中是高度保守的。本试验根据Genbank中P36基因序列设计了一对特异性引物，通过PCR扩增ZCF23株P36基因序列，凝胶电泳结果显示，扩增出948bp左右的条带，与预期结果相符。将PCR产物克隆入pGEM T Easy载体中并进行测序。测序结果与Genbank中P36基因序列比较发现，同源性达99.9％，只有一处碱基发生变异(由A变为G)。所编码扬州大学硕士学位论文的氨基酸序列同源性达100%。从而进一步验证了P36基因序列的保守性。对其所编码的氨基酸序列抗原性表位预测发现，在3巧个氨基酸序列中有巧个可能的抗原表位。序列确认后，用Ec口Rl和肠口I将P36基因从克隆载体中切出，并插入到GsT融和表达载体pGEx 6p一1相应位点，构建成重组表达载体pGEX 6p一1一P36，并转化宿主菌BLZI。阳性克隆命名为BLZI(6P一l一P36)。重组菌经过IPTG诱导，并通过SDS一以GE电泳鉴定，结果表明，P36基因获得了表达。将其超声波裂解后，高速离心分离上清和沉淀，分别进行SDS一PAGE电泳，结果表明，表达产物GST一P36以可溶性蛋白和包涵体两种形式存在。3.抗猪肺炎支原体P36蛋白单克隆抗体的制备 重组菌BLZI(6P一1一P36)经诱导表达，超声波裂解后高速离心，分别收集上清和沉淀。可溶性表达产物亲和层析纯化后用于检测;同时，用GST一P36包涵体沉淀与等量弗氏完全佐剂(首次)、不完全佐剂(后叁次)混合后，分4次腹腔注射免疫8周龄BALB/c小鼠(400 pg/只)，间隔为两周。在尾静脉追加免疫纯化P36蛋白(100协g/只)3天后，取免疫鼠脾细胞和骨髓瘤SpZ/0细胞进行融合。用间接ELIsA方法反复筛选阳性克隆，并经有限稀释法2次克隆化后，获得了一株能分泌特异性抗体的单克隆细胞株，命名为5A7一2。生物学特性鉴定表明，腹水单抗的间接 ELIsA效价为1:2.5 xl护;免疫球蛋白亚类为IgGZa。免疫印迹结果显示，腹水单抗与GST一P36融合蛋白反应而不与GST蛋白反应，并且在Mhp蛋白36kD位置也有明显的条带，说明细胞株5A7一2所分泌的是针对Mhp P36蛋白的单抗。P36蛋白携带Mhp种特异性抗原表位，并且P36蛋白多抗也不与其它支原体或细菌反应，因此，其单克隆抗体的制备，为MhP种特异性检测方法的建立奠定了基础。
靳岷[10]2005年在《猪肺炎支原体单克隆抗体的制备与初步鉴定》文中指出猪肺炎支原体(Mycoplasma hyopneumoniae,Mhp)是猪地方性肺炎(Swine EnzooticPneumonia,SEP)(亦称猪气喘病)的病原体。此病分布广,发病率高,自身致死率不高。由于Mhp能够破坏呼吸道黏膜-纤毛屏障,从而继发其他致病菌的感染,提高致死率。由于早期检测的困难和缺乏有效的药物,在疾病控制方面至今未能达到满意的效果。本实验以Mhp168株为材料,研制出其特异性单克隆抗体,并利用Mhp的全菌蛋白作为包被抗原建立了间接ELISA方法,且证明有一定的实用性。 首先用KM_2培养基(含马血清)培养Mhp168F_(323)株。高速离心,用PBS悬浮沉淀。悬浮物反复冻融并超声波裂解后作为抗原,与等量完全弗氏佐剂(第一次)、不完全佐剂(第二次)混合后皮下及腹腔注射免疫8周龄BALB/c小鼠(200μg/只),间隔时间3周。加强免疫3天后,取免疫小鼠的脾细胞和骨髓瘤细胞SP2/0细胞进行融合,并用间接ELISA方法进行筛选。初步鉴定为阳性的细胞克隆,采用有限稀释法进行3次亚克隆后,得到2株分泌特异性抗体的单克隆细胞株。生物学特性鉴定表明,腹水单抗的间接ELISA效价在1:10~4左右,免疫球蛋白亚类均为IgG3。免疫印记结果表明,单抗所针对的抗原表位分别在70KD和40KD左右,而且不与马血清蛋白反应,说明以上单抗是针对Mhp蛋白的单抗。用猪肺炎支原体Mhp168株培养物,制备抗原,建立了检测猪肺炎支原体抗体的间接ELISA方法,试验的最佳反应条件为:抗原的包被浓度为1.5μg/ml,待检血清的最佳稀释度为1:100,酶标抗体为1:10000稀释;包被液为pH9.6的碳酸盐缓冲液,2%的明胶作封闭液,洗涤液和稀释液均为含0.5%Tween-20的磷酸盐缓冲液;抗原抗体最佳结合时间为90min,酶标抗体最佳作用时间为60min.使用单抗阻断ELISA方法对血清样品进行了检测并与建立的间接ELISA方法进行了对比,发现单抗阻断ELISA方法对早期感染的猪气喘病病料具有较好的检出率。
参考文献：
[1]. 猪支原体肺炎新型疫苗及其单克隆抗体的制备与应用[D]. 马丰英. 华中农业大学. 2011
[2]. 猪肺炎支原体P97蛋白单克隆抗体的制备[D]. 王亮. 中国农业科学院. 2008
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[4]. 绵羊肺炎支原体EF-Tu和HSP70蛋白免疫原性分析及补体ELISA方法的建立[D]. 蒋菲. 中国农业大学. 2016
[5]. 猪肺炎支原体伴侣蛋白DnaK单克隆抗体的制备及鉴定[D]. 乔祖健. 东北农业大学. 2008
[6]. 抗猪肺炎支原体单克隆抗体的制备及初步应用[D]. 郑传发. 扬州大学. 2007
[7]. 猪肺炎支原体P65蛋白的克隆表达、单克隆抗体制备及阻断ELISA抗体检测方法建立[D]. 张悦. 南京农业大学. 2013
[8]. 猪肺炎支原体P46蛋白与DnaK蛋白单克隆抗体的制备与鉴定[D]. 缪芬芳. 南京农业大学. 2011
[9]. 猪肺炎支原体单克隆抗体的制备与鉴定[D]. 胡茂志. 扬州大学. 2004
[10]. 猪肺炎支原体单克隆抗体的制备与初步鉴定[D]. 靳岷. 山西农业大学. 2005
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