导读:本文包含了反向遗传系统论文开题报告文献综述、选题提纲参考文献及外文文献翻译，主要关键词:病毒,系统,猪瘟,基因组,疫苗,序列,流感。
反向遗传系统论文文献综述
高雅丽,张勇侠,陈宗香,康庄,罗心梅[1]（2019）在《腮腺炎疫苗株Jeryl Lynn 1反向遗传系统的建立》一文中研究指出目的建立腮腺炎疫苗株Jeryl Lynn 1(JL1)反向遗传系统,获得单一成分的拯救病毒JL1~R。方法将JL1全长c DNA基因序列分为7个片段(F1～F7),在F7片段的3′端引入丁型肝炎病毒核酶序列(hepatitis D virus ribozyme,Hdv RZ),分段合成后分别插入载体pT7-MCS3中,根据每段重迭区域的酶切位点拼接,构建全长表达质粒pT7-MCS3-MUV_(JL1)(HdvRz);同时构建表达腮腺炎病毒(mumps virus,MuV)核蛋白(NP)、磷蛋白(P)、聚合酶蛋白(L)的3个辅助质粒;将全长表达质粒与3个辅助质粒及表达T7RNA聚合酶的质粒pCDIBP-T7RNAP共同电转染Vero细胞。对获得的病毒JL1~R进行测序、病毒滴度及中和抗体测定。结果拯救病毒JL1~R基因组SH及HN片段与疫苗株JL1对应片段的理论序列一致;JL1~R经Vero细胞连续传代培养2～10代病毒滴度均在6 lg CCID_(50)/mL以上;JL1~R与疫苗株S_(79)诱发抗MuV抗体滴度接近。结论成功构建了MuV疫苗株JL1的反向遗传操作系统,获得的单一成分拯救病毒JL1~R可作为腮腺炎疫苗株的备选株,解决了S_(79)疫苗生产中毒种及疫苗株的成分、纯度和批间一致性等问题,进一步提高了国内腮腺炎疫苗的免疫效果。(本文来源于《中国生物制品学杂志》期刊2019年10期）
夏青[2]（2019）在《D型流感病毒反向遗传系统的构建及其HE基因免疫原性的研究》一文中研究指出D型流感病毒是新定义的流感病毒家族的一员,于2011年首次从疑似患流感的猪体内分离获得,自2014年以来在世界各地的牛体内被发现,其主要宿主包括猪、牛和其他小反刍动物等。此外血清学证据也证明了D型流感病毒具有感染人类的可能性。同时该病毒也被认为与牛的呼吸道疾病有着密切的关系。HEF蛋白是D型流感病毒表面唯一的糖蛋白,决定其感染特性。因此对D型流感病毒基因特性以及HEF蛋白免疫原性的研究为预防D型流感病毒起到了重要作用。本研究首次尝试构建了D型流感病毒的反向遗传操作平台,并且利用昆虫细胞杆状病毒系统构建了可以作为D型流感病毒有效诊断抗原的HEF蛋白重组杆状病毒,并利用DNA免疫小鼠获得了抗HEF蛋白血清。实验主要分为两大部分,第一部分是:应用A型流感病毒的十叁质粒反向遗传系统的pHH21和pCAGGS载体,通过分子克隆等手段构建了D型流感病毒的十二质粒反向遗传操作平台;同时依据广泛应用于A型流感病毒的八质粒反向遗传系统的pBD载体,构建了D型流感病毒的七质粒反向遗传系统。分别将两套系统的重组质粒通过共转染到293T细胞中,并将质粒转染的293T细胞上清液对细胞以及豚鼠进行感染,通过Real-time RT-PCR方法以及电镜观察对拯救病毒进行鉴定。第二部分是:首先利用杆状病毒载体构建了重组HEF蛋白的杆状病毒系统,通过红细胞凝集试验以及Western Blotting试验鉴定HEF蛋白的免疫原性。同时应用pCAGGS载体构建了用于小鼠DNA免疫的高效表达HEF蛋白的重组质粒,并通过与CpG-ODN分子佐剂进行联合免疫获得了相应的抗HEF蛋白血清,并通过血凝抑制试验进行抗体效价的检测。研究结果:(1)成功地构建了D型流感病毒的十二和七质粒反向遗传系统;(2)通过七质粒反向遗传系统共转染293T细胞成功获得特异性病毒粒子;(3)拯救的病毒不能够感染A549、MDCK、ST细胞,可在豚鼠的上呼吸道中进行少量的复制拷贝,但感染效力较低;(4)成功地构建了可以作为D型流感病毒诊断抗原的重组杆状病毒;(5)通过质粒与CpG-ODN分子佐剂联合免疫小鼠制备了具有较高血凝抑制效价的抗HEF蛋白血清。(本文来源于《长春理工大学》期刊2019-06-01）
王磊[3]（2019）在《牛呼吸道合胞体病毒反向遗传操作系统构建的基础研究》一文中研究指出牛呼吸道合胞体病毒(Bovine respiratory syncytial virus,BRSV)是副黏病毒科、肺病毒亚科、肺病毒属的成员,为有囊膜病毒,其基因组是负链RNA,全长约15000 nt,可转录出10条病毒RNA,并翻译成11种蛋白质,其中9种为结构蛋白、2种为非结构蛋白。BRSV呈世界性分布,在我国的流行也比较普遍。BRSV感染牛如果继发性细菌感染,呼吸系统疾病会更加复杂,是发病牛高度死亡的主要原因,给养牛业带来了巨大的经济损失。疫苗免疫仍是防控该病的有力手段。基于反向遗传技术的病毒基因结构与功能的研究,是揭示BRSV致病机理、免疫保护机制以及病毒的宿主和组织嗜性等相关研究的基础。本研究以BRSV核酸呈阳性的鼻拭子样品LJX31为材料,对BRSV全长基因组进行序列测定,并进行序列同源性及进化树分析,以确定中国流行的BRSV的遗传进化关系。在此基础上构建BRSV反向遗传质粒系统,可用于BRSV反向遗传系统的建立,为BRSV的结构与功能研究奠定基础。全长基因组序列测定和分析结果显示,LJX31全长基因组为15150 nt,5’端非编码区为45 nt,3’端非编码区为161 nt。基因组的编码区位于46-14989 nt,包括NS1、NS2、N、P、M、SH、G、F、M2和L基因。L基因最大,含有6573 nt;NS2基因最小,含有492 nt;NS1、N、P、M、SH、G、F和M2基因全长依次为527、492、1202、869、950、466、840、1902和960 nt。全长基因组序列比对分析显示,LJX31与美国Atue51908株的同源性为96.4%。LJX31的全长基因组存在13个核苷酸的插入和3个核苷酸的缺失。与Atue51908株相比,NS1、NS2、N、P、M、SH、G、F、M2和L基因的同源性为92.1-98.5%。对G蛋白的编码基因序列进行同源性和遗传进化分析显示,LJX31与美国毒株V41的同源性最高、亲缘关系最近,同源性达95.1%,表明LJX31可能来源于美国。为构建BRSV LJX31的反向遗传操作系统,分别构建了基因组全长cDNA质粒,以及N、P、L和M2-1蛋白的真核表达质粒;同时,为了增加拯救病毒对细胞的适应性,本研究构建了BRSV受体蛋白CX3CR1的真核表达质粒。N、P、L、M2-1和CX3CR1这5个蛋白表达质粒作为辅助质粒,与全长基因组cDNA质粒共转染BRSV易感细胞,可进行病毒的拯救。本研究同时构建了基于T7启动子和CMV启动子的全长基因组cDNA质粒PVK-LJX31和PCI-LJX31;N、P和M2-1蛋白的编码基因直接克隆至PCI-neo载体,分别构建表达质粒PCI-neo-N、PCI-neo-P、PCI-neo-M2-1;L蛋白的编码基因经过密码子优化后克隆至p3xflag-CMV载体,构建表达质粒p3xflag-YH-L;CX3CR1蛋白的编码基因采用PCR方法从牛的肺组织中扩增获得,直接克隆至PCI载体,构建表达质粒PCI-CX3CR1。PVK-LJX31、PCI-LJX31、PCI-neo-N、PCI-neo-P、PCI-neo-M2-1、p3xflag-YH-L和PCI-CX3CR1,经酶切和序列分析确定序列正确,这样BRSV LJX31反向遗传系统所需的遗传元件均获得了相应的重组质粒。采用IFA对PCI-neo-N、PCI-neo-P、PCI-neo-M2-1、p3xflag-YH-L进行表达验证,结果显示每个质粒转染细胞后,其细胞内表达产物均能与相应的抗体发生反应,表明质粒均能在转染细胞中获得表达。此外,通过微基因组质粒pok(-T7)-W对LJX31基因组的顺式作用元件和调控区以及PCI-neo-N、PCI-neo-P、PCI-neo-M2-1和p3xflag-YH-L四个辅助质粒的功能进行验证,结果显示,pok(-T7)-W质粒转染细胞后,再用BRSV感染细胞,可在细胞中表达绿色荧光蛋白,表明LJX31基因组的顺式作用元件和调控区是有功能的;而pok(-T7)-W质粒和PCI-N、PCI-P、PCI-M2-1和PCI-YH-L四个辅助质粒共转染细胞时,却不能够在细胞中观察到绿色荧光蛋白的表达,表明PCI-neo-N、PCI-neo-P、PCI-neo-M2-1和p3xflag-YH-L四个辅助质粒形成RNP复合物的能力、或者RNP复合物的功能有缺陷。综上所述,本研究对BRSV LJX31的全长基因组序列进行测定及分析,并构建了该毒株反向遗传操作系统的遗传元件,包括基因组质粒、辅助质粒及其功能鉴定的方法,为BRSV反向遗传平台的建立打下了坚实的基础。(本文来源于《中国农业科学院》期刊2019-06-01）
左智敏[4]（2019）在《嵌合猫杯状病毒F9株反向遗传系统的建立及复制差异基因的筛选》一文中研究指出猫杯状病毒(FCV)属于杯状病毒科水疮性病毒属,主要危害猫科类动物,呈世界范围分布。猫杯状病毒主要引起上呼吸道类疾病,严重威胁家猫等猫科动物的生存。疫苗免疫是保护动物免受病毒危害的主要手段,但目前FCV疫苗提供的免疫保护较差,家猫免疫后仍可能患上猫杯状病毒病,患病动物将长期甚至终身排毒。目前国内尚无已批准销售的猫杯状病毒国产疫苗。因此猫杯状病毒的研究十分迫切,目前相关的研究仍然有限,我们对于猫杯状病毒各方面的了解尚显不足。弱毒株FCV F9是经典的猫杯状病毒疫苗株,也是目前大多数FCV活疫苗的亲本株,普遍被用于猫杯状病毒疫苗方面的研究。为构建FCV F9感染性克隆,本研究利用酶切连接的方式拼接了FCV F9全基因组序列。通过优化序列的密码子解决了移码突变问题,获得氨基酸完全相同的重组FCV F9克隆质粒pOK-F9H。将线性化的pOK-F9H进行体外转录,获得加帽RNA转染F81细胞,拯救得到病毒rFCV F9。经过对拯救病毒与亲本株的噬斑形成能力、CPE形成能力和多步生长曲线分析,结果表明,rFCV F9与亲本株在复制能力和体外生长能力方面基本一致,表明成功构建了弱毒株FCV F9株的感染性克隆并拯救出病毒。本实验室前期已构建强毒株FCV 2280的反向遗传系统,下一步利用强弱毒的两个反向遗传系统构建嵌合病毒进行实验。我们通过构建ORFs嵌合病毒的方式,研究猫杯状病毒的ORFs对FCV体外复制差异的影响。我们将FCV的ORFs分为ORF1和ORF2-3两个部分,分别以FCV 2280和FCV F9为病毒骨架进行替换,构建四个嵌合质粒,并拯救出嵌合病毒。通过对ORF嵌合病毒与亲本病毒的生物学分析,叁个ORF对病毒的生长均有影响。为了筛选出ORF1中影响FCV复制的基因,以FCV 2280为病毒骨架,将FCV F9的ORF1中的六个非结构蛋白进行替换,构建四个嵌合质粒并拯救出嵌合病毒。结果显示,替换p39和p30-VPg蛋白后FCV的复制能力表现出显着降低。随后,我们又以FCV F9为病毒骨架,将FCV 2280的ORF1中的p39和p30-VPg蛋白嵌合替换,拯救出嵌合病毒并结果进行验证,结果表明p30-VPg对FCV复制能力有显着提升。通过对基因嵌合病毒与亲本病毒的生物学分析,结果表明猫杯状病毒强弱毒替换p30-VPg对病毒生长能力影响最大。本研究中我们成功构建FCV F9感染性克隆,应用强弱毒反向遗传系统拯救出10株嵌合病毒,筛选出p30-VPg是对FCV复制影响最大的非结构蛋白。(本文来源于《黑龙江八一农垦大学》期刊2019-06-01）
丛广义[5]（2019）在《猪副流感病毒5型全基因组序列分析及反向遗传操作系统建立》一文中研究指出猪副流感病毒(porcine parainfluenza-5 virus,PPIV5)系不分节段的单股负链RNA病毒,为副粘病毒科,腮腺炎病毒属成员之一。在1956年该病毒首次在猴体内被发现和被分离,并被命名为猴病毒5型(SV5),在1995年国际病毒学分类委员会上该病毒被正式命名为(simian parainfluenzavirus 5)。后该病毒在其他动物体内及细胞培养物中均被检测到,意味着猴并不是该病毒的唯一宿主,于是在2009年病毒学分类委员会上该病毒被首次命名为(parainfluenza virus 5,PIV5)。2018年国际病毒学委员会上将该病毒重新命名为(mammalian rubulavirus 5),本文中将使用PIV5表示副流感病毒。在本实验室前期工作当中,将该病毒做仔猪动物回归实验(详细数据另行发表,未在本文中体现),结果表明该病毒虽然可感染猪肠道但不会导致腹泻及体温升高,尽本人所知无文献报道该病毒会导致猪只严重疾病。故本研究目的为建立PPIV5的反向遗传操作系统,为作为递送外源蛋白的载体奠定基础。将分离到的PPIV5病毒命名为CHNJS-17株,根据Gen Bank上所公布的序列,我们设计了6对引物,覆盖了除3’和5’端的病毒的基因组,通过RT-PCR方法扩增其相应序列,并对这6个序列进行T载体连接及转化至感受态细胞,提取质粒后测序。同时,利用RACE技术测定了PPIV5的3’和5’端具体序列。我们测得的序列分析结果显示,本实验室分离到的毒株全长15 246 bp,符合副粘病毒的“六碱基原则”。纤突蛋白F及HN与经典毒株W3A株比较氨基酸差异较小,分别为98.3%和97.3%,小疏水蛋白(SH)差异最大,为91.1%。将CHNJS-17株与NCBI所公布的28株PIV5全基因组序列进行比对,进化树分析显示与登录号为KX100034株、KY685075株、MH370862株、MG921602株、MH362816株同在一个进化分支,同源性分析显示与MG921602株、MH362816株、MH370862株、KX100034株、KC237064株最高,为99.8%,与KY114804株同源性最低,为97%。由此可知PIV5的进化树划分及同源性与宿主种属之间无相关性。表达T7聚合酶的重组痘病毒(MAV-T7)可提供T7聚合酶并被应用于拯救负链RNA病毒(negative-strand RNA viruses,NSV),为了成功拯救PPIV5,本实验选用其作为转录病毒基因组之用。本研究使用的载体为p OK12载体,该载体为低拷贝载体,可容纳较大基因组。在全基因组的3’端加入T7启动子和稳定T7启动子的叁个脱氧核苷酸G,及锤头状核酶(hammerhead ribozyme,Ham Rz),在5’端加入丁戊肝核酶(hepatitis deltavirus ribozyme,Hdv Rz)和T7终止子。PIV5符合副粘病毒中的“六碱基原则”,故加入的Ham Rz和Hdv Rz可保证病毒基因组的精确切割,提高病毒拯救成功率。由于本病毒为负链RNA病毒,故在病毒转录中必不可少的辅助蛋白为核衣壳蛋白NP、磷酸化蛋白P、大聚合酶蛋白L,在本研究中以pc DNA3.1(-)为载体分别构建表达NP、P、L的叁个辅助质粒,与病毒基因组全长质粒按4:2:2:1的比例共转染提前感染了MAV-T7的仓鼠肾细胞(BHK21),方可拯救病毒。为区别拯救毒株与野生毒株,在病毒基因组中加入了亲本毒株中不存在的分子标签,通过鉴定能够区分野毒株的与拯救毒的分子标签4768G-(T),鉴定结果为突变成功,将拯救的PPIV5命名为r PIV5-4768G(T),通过电镜观察拯救的r PIV5-4768G(T)符合副粘病毒的外形特征,大小不一,具有多形性,视野内可观察到由病毒破裂而流出的“拉锁型”病毒基因,病毒外膜布满密集的纤突,间接免疫荧光(IFA)结果显示病毒拯救成功,一步生长曲线显示拯救毒与亲本毒在第12小时存在差异。以无致病性的PPIV5为亲本毒的r PIV5-4768G(T)反向遗传系统的建立可以作为很好的载体,为外源病毒蛋白的表达尤其是猪源肠道病毒如猪流行性腹泻病毒(PEDV)S蛋白的表达奠定基础。(本文来源于《黑龙江八一农垦大学》期刊2019-06-01）
高辉[6]（2019）在《猪瘟病毒反向遗传操作系统的建立》一文中研究指出猪瘟(Classical swine fever,CSF)是由猪瘟病毒(Classical swine fever virus,CSFV)引起的一种高度接触性传染病,是危害养猪业的重大传染病之一。自发现以来已流行于世界上多个国家,我国更是深受CSFV侵害的国家之一。目前在中国流行的CSFV毒株与之前的流行株相比,在遗传变异、毒力和致病性等方面都已发生了较大改变,这也使得我国对CSFV的防治面临更严峻的挑战。为了更好的预防与控制CSF,针对CSFV的致病机制,毒力的决定因素等问题仍需进行更深入的探究。随着实验研究的深入和相关学科的发展,反向遗传学技术已经成为研究RNA病毒的重要手段,在CSFV的研究中也发挥着越来越重要的作用。通过构建高效经济的CSFV反向遗传操作系统可以从基因水平上对CSFV有更深入的研究,也可以为CSFV的传统研究提供更多的思路。本研究基于DNA-Launched反向遗传技术,采用RNA聚合酶Ⅱ系统,分别构建了含有CSFV兔化弱毒疫苗株及强毒石门株全长基因组序列的感染性克隆。通过在CSFV基因组的5’端引入巨细胞病毒(CMV)启动子,3’端引入丁型肝炎病毒(HDV)核酶以及牛生长激素(BGH)信号序列等必要的工程核酶原件,然后将病毒基因组分段克隆进低拷贝的细菌人工染色体(BAC)载体中,可以使CSFV基因组在宿主细胞内正确复制翻译并且提高病毒的拯救效率。区别于传统的体外转录或构建细胞系的方法,本研究构建的感染性克隆转染PK-15细胞后,在细胞内完成转录,可快速、有效的直接收获拯救病毒。成功收获两种毒株的拯救病毒之后,分别对其进行遗传标记的鉴定与生物学特性的验证试验。试验结果说明拯救的病毒与其亲本毒株具有相似的生物学特性,引入的遗传标记经过验证可以对其进行有效的区分,同时拯救获得的病毒在体外细胞上也有着良好的增殖能力,可以用于CSFV后续的反向遗传学研究。在此基础上,通过反向遗传技术将外源基因EGFP引入CSFV兔化弱毒疫苗株的感染性克隆,成功构建了含有EGFP基因的重组CSFV兔化弱毒疫苗株全长cDNA克隆,并尝试进行重组病毒的拯救,以期获得能够稳定传代并表达EGFP荧光标记的重组CSFV兔化弱毒疫苗株,使CSFV的检测实现可视化。荧光显微镜观察结果显示,P1、P2代可见微弱绿色荧光,但在其后的传代中,荧光逐渐消失,推测由于蛋白构象发生了改变,影响了基因的正常功能,导致EGFP无法在CSFV基因组中稳定表达并传代。综上,本研究通过反向遗传操作技术,成功构建了我国CSFV兔化弱毒疫苗株和强毒石门株的感染性克隆,并能够快速、有效的收获拯救病毒。在此基础上,构建了含有EGFP基因的重组CSFV兔化弱毒疫苗株全长cDNA克隆。为下一步对CSFV致病机制的探究以及猪瘟标记疫苗的研究打下了基础。(本文来源于《西北农林科技大学》期刊2019-05-01）
刘慧芳,李宁求,张莉娟,梁红茹,林强[7]（2019）在《弹状病毒反向遗传操作系统研究进展》一文中研究指出弹状病毒是一类重要的共患病病原,可引起人、动物、植物等多种生物的严重疫病。该病毒属不分节段的负链RNA病毒,其基因组相对简单。近年来,随着基因操作技术的发展,弹状病毒反向遗传操作系统技术研究取得显着成果。本综述从弹状病毒概论、弹状病毒反向遗传操作系统的建立及其疫苗研究中的应用等方面概述其反向遗传操作的研究进展,以期为弹状病毒防控相关研究提供参考。(本文来源于《基因组学与应用生物学》期刊2019年03期）
郭运泽,孙恩成,徐青元,步志高,吴东来[8]（2019）在《蓝舌病病毒10质粒反向遗传操作系统的建立》一文中研究指出为建立蓝舌病病毒(BTV) 10质粒反向遗传操作系统,本研究将BTV16型BN96/16株10个基因节段分别克隆至pS111载体相应的酶切位点,构建10个重组质粒转染BSR细胞,拯救获得重组病毒,命名为rBTV-16。测序结果显示,拯救病毒rBTV-16与其亲本病毒wtBTV-16的核苷酸序列完全相同;经电镜观察,可见典型形态的环状病毒属病毒粒子;间接免疫荧光试验结果显示,rBTV-16能够感染细胞;病毒基因组检测结果显示,rBTV-16各个基因节段的长度与亲本病毒完全一致;病毒生长曲线的测定结果显示,rBTV-16与亲本病毒具有一致的复制特性。本研究建立的10质粒系统比传统体外转录拯救系统的操作过程简便,提高了拯救病毒的效率,为进一步深入研究BTV的致病机理奠定了基础。(本文来源于《中国预防兽医学报》期刊2019年03期）
赵妍[9]（2018）在《CSFV的反向遗传系统》一文中研究指出对于家猪和野猪来说,猪瘟是一种具有极高传染力及高致死率的烈性传染病。猪瘟是由猪瘟病毒(Classic Swine Fever Virus, CSFV)引起的病毒性传染病,CSFV属于黄病毒科,瘟病毒属,是一种单股正义RNA病毒。在CSFV的研究当中,反向遗传学应用十分广泛,论文主要介绍几种比较成熟的CSFV反向遗传系统。近年来,反向遗传学在CSFV的研究方面得到不断发展,论文就CSFV的几种反向遗传系统进行系统阐述,以期为CSFV的研究及防控提供参考。(本文来源于《中小企业管理与科技(中旬刊)》期刊2018年12期）
贺煜,王涛,陈舜,程安春[10]（2018）在《基于鸭坦布苏病毒反向遗传操作系统的多平台研究工具的构建》一文中研究指出引言鸭坦布苏病毒(Duck Tembusu virus,DTMUV)为黄病毒科、黄病毒属的单股正链RNA病毒,具有囊膜结构~([1])。为深入研究DTMUV基因组复制与致病机制等,本实验室在先前的研究中,成功构建了DTMUV临床分离毒株CQW1的反向遗传操作系统~([2]),以及表达海肾荧光素酶的报告病毒用于宿主抗病毒基因的筛选。为了提高报告病毒基因组的稳定性,本实验基于CQW1株的反向遗传操作系统,新增(本文来源于《中国畜牧兽医学会2018年学术年会禽病学分会第十九次学术研讨会论文集》期刊2018-11-21）
反向遗传系统论文开题报告
（1）论文研究背景及目的
此处内容要求：
首先简单简介论文所研究问题的基本概念和背景，再而简单明了地指出论文所要研究解决的具体问题，并提出你的论文准备的观点或解决方法。
写法范例：
D型流感病毒是新定义的流感病毒家族的一员,于2011年首次从疑似患流感的猪体内分离获得,自2014年以来在世界各地的牛体内被发现,其主要宿主包括猪、牛和其他小反刍动物等。此外血清学证据也证明了D型流感病毒具有感染人类的可能性。同时该病毒也被认为与牛的呼吸道疾病有着密切的关系。HEF蛋白是D型流感病毒表面唯一的糖蛋白,决定其感染特性。因此对D型流感病毒基因特性以及HEF蛋白免疫原性的研究为预防D型流感病毒起到了重要作用。本研究首次尝试构建了D型流感病毒的反向遗传操作平台,并且利用昆虫细胞杆状病毒系统构建了可以作为D型流感病毒有效诊断抗原的HEF蛋白重组杆状病毒,并利用DNA免疫小鼠获得了抗HEF蛋白血清。实验主要分为两大部分,第一部分是:应用A型流感病毒的十叁质粒反向遗传系统的pHH21和pCAGGS载体,通过分子克隆等手段构建了D型流感病毒的十二质粒反向遗传操作平台;同时依据广泛应用于A型流感病毒的八质粒反向遗传系统的pBD载体,构建了D型流感病毒的七质粒反向遗传系统。分别将两套系统的重组质粒通过共转染到293T细胞中,并将质粒转染的293T细胞上清液对细胞以及豚鼠进行感染,通过Real-time RT-PCR方法以及电镜观察对拯救病毒进行鉴定。第二部分是:首先利用杆状病毒载体构建了重组HEF蛋白的杆状病毒系统,通过红细胞凝集试验以及Western Blotting试验鉴定HEF蛋白的免疫原性。同时应用pCAGGS载体构建了用于小鼠DNA免疫的高效表达HEF蛋白的重组质粒,并通过与CpG-ODN分子佐剂进行联合免疫获得了相应的抗HEF蛋白血清,并通过血凝抑制试验进行抗体效价的检测。研究结果:(1)成功地构建了D型流感病毒的十二和七质粒反向遗传系统;(2)通过七质粒反向遗传系统共转染293T细胞成功获得特异性病毒粒子;(3)拯救的病毒不能够感染A549、MDCK、ST细胞,可在豚鼠的上呼吸道中进行少量的复制拷贝,但感染效力较低;(4)成功地构建了可以作为D型流感病毒诊断抗原的重组杆状病毒;(5)通过质粒与CpG-ODN分子佐剂联合免疫小鼠制备了具有较高血凝抑制效价的抗HEF蛋白血清。
（2）本文研究方法
调查法：该方法是有目的、有系统的搜集有关研究对象的具体信息。
观察法：用自己的感官和辅助工具直接观察研究对象从而得到有关信息。
实验法：通过主支变革、控制研究对象来发现与确认事物间的因果关系。
文献研究法：通过调查文献来获得资料，从而全面的、正确的了解掌握研究方法。
实证研究法：依据现有的科学理论和实践的需要提出设计。
定性分析法：对研究对象进行“质”的方面的研究，这个方法需要计算的数据较少。
定量分析法：通过具体的数字，使人们对研究对象的认识进一步精确化。
跨学科研究法：运用多学科的理论、方法和成果从整体上对某一课题进行研究。
功能分析法：这是社会科学用来分析社会现象的一种方法，从某一功能出发研究多个方面的影响。
模拟法：通过创设一个与原型相似的模型来间接研究原型某种特性的一种形容方法。
反向遗传系统论文参考文献
[1].高雅丽,张勇侠,陈宗香,康庄,罗心梅.腮腺炎疫苗株JerylLynn1反向遗传系统的建立[J].中国生物制品学杂志.2019
[2].夏青.D型流感病毒反向遗传系统的构建及其HE基因免疫原性的研究[D].长春理工大学.2019
[3].王磊.牛呼吸道合胞体病毒反向遗传操作系统构建的基础研究[D].中国农业科学院.2019
[4].左智敏.嵌合猫杯状病毒F9株反向遗传系统的建立及复制差异基因的筛选[D].黑龙江八一农垦大学.2019
[5].丛广义.猪副流感病毒5型全基因组序列分析及反向遗传操作系统建立[D].黑龙江八一农垦大学.2019
[6].高辉.猪瘟病毒反向遗传操作系统的建立[D].西北农林科技大学.2019
[7].刘慧芳,李宁求,张莉娟,梁红茹,林强.弹状病毒反向遗传操作系统研究进展[J].基因组学与应用生物学.2019
[8].郭运泽,孙恩成,徐青元,步志高,吴东来.蓝舌病病毒10质粒反向遗传操作系统的建立[J].中国预防兽医学报.2019
[9].赵妍.CSFV的反向遗传系统[J].中小企业管理与科技(中旬刊).2018
[10].贺煜,王涛,陈舜,程安春.基于鸭坦布苏病毒反向遗传操作系统的多平台研究工具的构建[C].中国畜牧兽医学会2018年学术年会禽病学分会第十九次学术研讨会论文集.2018
论文知识图
