导读:本文包含了原噬菌体论文开题报告文献综述、选题提纲参考文献及外文文献翻译，主要关键词:噬菌体,柑橘,杆菌,病菌,李斯特,原体,韧皮部。
原噬菌体论文文献综述
柏自琴,王小柯,冯建文,李金强,罗会[1]（2019）在《贵州南部柑桔黄龙病菌两个原噬菌体位点遗传多样性分析》一文中研究指出为研究贵州南部柑桔黄龙病菌"Candidatus Liberibacter asiaticus"遗传多样性,分析了来自罗甸、望谟、册亨、兴义、榕江和从江等6个南部县(市)的54个病原菌样品(株系)在SC1和SC2两个原噬菌体位点上的变异情况。结果显示,不同行政区域和海拔来源的病原菌株系在两个位点上的扩增情况不同,共存在4种(SC1,SC2,SC1+SC2,SC1和SC2均无)原噬菌体类型;相同原噬菌体类型株系的扩增序列之间,也存在碱基变异及插入/缺失。(本文来源于《中国南方果树》期刊2019年05期）
辛永平[2]（2019）在《基于原噬菌体重组酶的乳酸菌基因组编辑技术的建立及其应用》一文中研究指出乳酸菌应用于食品发酵领域具有悠久历史,它产生有机酸、维生素、多糖等高附加值化合物,赋予产品特殊的风味、质地和保质期。最近发现,一些乳酸菌也对人体有益生作用。干酪乳杆菌作为乳酸菌,是一种重要的工业微生物,广泛应用于乳制品发酵领域。目前,基因组测序技术及功能基因组学的发展为干酪乳杆菌中假想蛋白的功能鉴定,代谢工程改造,合成生物学的发展提供了理论基础。然而,干酪乳杆菌的基因组编辑主要采用同源双交换的方法,这种方法效率低下,耗时且操作烦琐,阻碍了上述课题的研究进程。此外,干酪乳杆菌也可以作为理想的细胞工厂表达抗原,生物活性分子以及一些酶类。但是,干酪乳杆菌作为细胞工厂还存在很多亟需解决的问题,例如,无法实现高效地程序化精简基因组,以便构建最适细胞工厂;无法以染色体整合的形式表达足量的重组蛋白,解决以质粒的方式表达重组蛋白遗传稳定性低的问题;无法高效筛选原噬菌体删除株,避免原噬菌体在发酵过程中被各种胁迫诱导脱离染色体导致发酵流产。本文主要以干酪乳杆菌为宿主,围绕建立基因组编辑工具以解决干酪乳杆菌在上述各个领域中遇到的问题展开研究。首先,生物信息学分析并体内验证了原噬菌体重组酶LCABL_13040-50-60的功能,以此为基础建立了基于双质粒和单质粒的基因敲除、插入及定点突变的工具,分别解决了乳酸菌中假想蛋白的功能鉴定,代谢工程改造效率低下的问题;其次,结合原噬菌体重组酶LCABL_13040-50-60和Cre/loxP系统建立了大片段基因组DNA的敲除及靶向多拷贝的基因组整合工具,分别为精简基因组构建最适细胞工厂及以染色体的方式过量表达外源蛋白提供了有效手段:最后,进一步研究了 CRISPR/Cas9系统在干酪乳杆菌中的功能,并利用其筛选到一系列原噬菌体删除株,研究了原噬菌体删除株作为细胞工厂在工业发酵中的应用潜力。此外,还在乳酸乳球菌中建立了一套反向筛选系统用于基因的无痕敲除。具体研究内容和结果如下:1.干酪乳杆菌原噬菌体重组酶LCABL 13040-50-60的挖掘及其在基因组编辑中的应用基因组编辑是挖掘新功能基因和代谢途径改造所必需的。然而,干酪乳杆菌基因组编辑效率低下,操作繁琐。本文利用生物信息学的方法,在干酪乳杆菌BL23原噬菌体PLE3的基因组上鉴定到一个与λRed操纵子类似的原噬菌体重组酶操纵子LCABL_13040-50-60。体内重组实验证明原噬菌体重组酶LCABL_13040-50-60能够介导外源线性双链DNA片段与染色体上的同源序列之间发生同源重组反应,成功地将干酪乳杆菌BL23染色体上长为167 bp的galK基因片段替换为氯霉素抗性基因(cat)。此外,通过比较不同组合蛋白质介导同源重组的效率,结果表明LCABL_13040和LCABL_13060分别是宿主核酸酶抑制因子(Redγ)和5'-3'核酸外切酶(Redα/RecE)的类似物。通过优化重组实验的条件(诱导剂的终浓度以及添加诱导剂时的OD600值;同源臂的长度;复苏时间;线性双链DNA的量),使同源重组效率得到显着提高,达到～2.2×10-7。随后,将原噬菌体重组酶LCABL_13040-50-60与Cre/loxP系统结合,实现了干酪乳杆菌BL23染色体上长为167 bp的galK基因内部片段的无缝敲除,gfp基因的无缝插入以及rpoB基因的点突变。此外,证明了在宿主核酸酶抑制因子(Redy)的辅助下,原噬菌体重组酶LCABL_13040-50-60在其它6株具有转化能力的干酪乳杆菌菌株,副干酪乳杆菌OY以及植物乳杆菌WCFS1中也具有催化同源重组的功能。这些结果表明,原噬菌体重组酶LCABL_13040-50-60具有在其它乳酸菌中进行基因组编辑的潜能,为乳酸菌中假想蛋白的功能鉴定,代谢工程改造及合成生物学的发展提供了有效手段。2.基于原噬菌体重组酶LCABL_13040-50-60的单质粒基因组编辑系统的构建及其在代谢工程中的应用第一部分建立的基于双质粒的基因组编辑系统虽然高效,但是,在代谢工程中对多个基因进行有序删除时仍然耗时较长。本文在干酪乳杆菌中建立了一个基于单质粒的简便快速的基因组编辑工具,并利用其对干酪乳杆菌进行代谢工程改造,成功提高了乙偶姻的产量。首先,构建质粒pMSP456-Cre,原噬菌体重组酶基因LC4BL_13040-50-60的转录由nisin诱导表达系统(NICE)来控制,位点特异性重组酶基因cre的转录由干酪乳杆菌BL23乳糖操纵子的启动子来控制。为了验证这一单质粒基因组编辑系统的有效性,利用质粒pMSP456-Cre对hicD3基因进行敲除。首先,LCABL 13040-50-60 催化线性双链 DNA(up-lox66-cat-lox71-down)的同源臂与染色体上的同源序列间发生同源重组反应,将hicD3基因替换为lox66-cat-lox71,然后,Cre位点特异性重组酶介导cat基因的切除,效率为60%。为了验证该系统能否实现干酪乳杆菌基因的有序删除,将与合成乙偶姻副产物相关的叁个基因(pflB,ldh和pdhC)进行连续的敲除,效率分别为60%,40%和60%。最终获得四个基因的敲除株在摇动条件下能够将59.8%的葡萄糖转化为乙偶姻,乙偶姻的产量约为野生株的18倍。这些结果表明本文为干酪乳杆菌基因组编辑提供了一种简单快捷的方法,可以应用于代谢工程改造干酪乳杆菌高产高附加值代谢产物。3.结合LCABL 13040-50-60和Cre/loxP系统敲除干酪乳杆菌大片段基因组DNA近年来,精简基因组构建最适细胞工厂受到广泛的关注。但是,前两部分内容构建的基因组敲除工具在敲除大片段基因组DNA时效率低下,无法快速高效地精简干酪乳杆菌基因组。本文在干酪乳杆菌BL23中构建了一个基于原噬菌体重组酶LCABL 13040-50-60和Cre/loxP位点特异性重组系统的基因组敲除工具。原噬菌体重组酶LCABL 13040-50-60用来介导目的片段5'和3'端突变loxP(lox66和lox71)位点的插入。随后,Cre位点特异性重组酶介导目的片段的删除。利用这一工具,成功敲除了干酪乳杆菌BL23染色体上一个长达～39.3 kb的非必需片段,一个长～12.8 kb且对细胞生长有影响的片段,以及同时敲除染色体上两个不连续的目的片段(5.2 kb和6.6 kb),效率都为100%。此外,为了验证这一工具能否用于多个DNA片段敲除株的构建,在干酪乳杆菌BL23染色体上有序删除了两个DNA片段(长度约占全基因组的1.68%)。最后,对获得突变株的生物学特性(包括生长速率,电转效率,细胞形态以及外源蛋白的表达量)进行研究。据我们所知,这是首次在干酪乳杆菌中实现大片段基因组DNA的有序删除。这一高效低成本的大片段DNA敲除工具可以加快精简基因组的步伐,以便更快地实现程序化构建干酪乳杆菌工程菌株作为最适细胞工厂高产高附加值产物。4.干酪乳杆菌中靶向多拷贝基因组整合工具的建立及其在提高重组蛋白表达中的应用微生物细胞工厂以染色体的形式表达重组蛋白可以解决以质粒的方式表达重组蛋白遗传稳定性低的问题。然而,在利用现有的染色体整合方法构建的干酪乳杆菌菌株中,重组蛋白的表达量不足以应用于实际生产中。本文在干酪乳杆菌中建立了一个两步法的靶向多拷贝基因组整合系统。此整合系统基于原噬菌体重组酶LCABL_13040-50-60和Cre/loxP系统,能够实现外源基因整合到染色体上,效率达到～3.7×103 CFU/μg DNA。利用此系统将单拷贝的gfp基因分别整合到染色体上均匀分布的六个位点,构建的六个整合株的相对荧光强度(RFUs)最大相差约3.7倍,其中,单拷贝gfp基因插入位点LCABL_07270的整合株的相对荧光强度(RFU)最大。此外,随机选取gfp基因插入位点LCABL_07270的整合株,发现它们的相对荧光强度(RFUs)的范围为993±89到7,289±564,对应的gfp基因的相对拷贝数为1到13.68±1.08。此外,经过63代的无选择压力培养,13.68±1.08个gfp拷贝的菌株中GFP蛋白的表达比以质粒方式表达GFP蛋白的菌株稳定性要高。为了进一步验证此系统能否用于生物活性分子的高表达,利用此系统成功将5.51±0.25个拷贝的大肠杆菌菌毛黏附素基因faeG插入到位点LCABL_07270中并实现稳定表达。这些结果表明,此整合系统可以通过定向多拷贝的基因整合实现重组蛋白高效、稳定地表达,为乳杆菌作为细胞工厂以染色体的方式表达外源蛋白提供了有效的手段。5.利用CRISPR/Cas9系统筛选干酪乳杆菌原噬菌体删除株筛选干酪乳杆菌原噬菌体删除株作为细胞工厂应用于工业发酵中可以避免原噬菌体脱离染色体导致发酵流产。然而,以目前的手段无法高效筛选原噬菌体删除株。本文利用酿脓链球菌的Ⅱ型CRISPR/Cas9系统筛选到几株原噬菌体删除的菌株,并研究了原噬菌体删除株在胁迫环境中的存活率。首先,分别将打靶染色体上的galK基因和质粒pNZ8148上的氯霉素抗性基因cat的质粒电转化菌株L.casei BL23和L.casei BL23/pNZ8148,发现转化效率明显低于非打靶质粒,表明CRISPR/Cas9系统可以切割干酪乳杆菌BL23中的双链DNA,杀死细胞。随后,通过分别转化打靶原噬菌体PLE1,PLE2和PLE3的打靶质粒,成功筛选到叁个原噬菌体独立删除的突变株(L.casei BLP1,BLP2和BLP3)。最后,以突变株为出发菌株,有序地筛选到叁个原噬菌体全部删除的菌株L.casei BLP1 23。通过比较这些突变株与野生株在不同胁迫环境下的存活率,发现原噬菌体删除株L.casei BLP1 23在大部分胁迫环境中的存活率都与野生株几乎没有差异,表明原噬菌体删除株L.casei BLP1 23具有作为细胞工厂应用于工业发酵中的潜力。6.乳酸菌中反向筛选系统的建立及其应用如今,乳酸菌的遗传改造工具还是基于条件型复制质粒的同源双交换的方法,这些方法操作繁琐,效率低下。为了解决这一问题,研究者开发了一系列的反向筛选标记,但是这些反向筛选标记大部分不能直接应用于野生型菌株。本文在乳酸乳球菌NZ9000中鉴定到一个编码苯丙氨酸tRNA合成酶α亚基的基因pheS。当在质粒上利用乳酸乳球菌NZ9000乳酸脱氢酶的启动子(Pldh)控制突变的pheS基因(pheS*)的转录时,表达的PheS*(A312G)蛋白足以使宿主细胞对苯丙氨酸的类似物对氯苯丙氨酸(p-C1-Phe)敏感,结果表明pheS*可以在乳酸乳球菌NZ9000中作为一个反向筛选标记。但是,当将Pldh-pheS插入到染色体上,PheS*(A312G)蛋白的表达量不足,导致宿主细胞对p-Cl-Phe的敏感性降低。因此,本文选用串联启动子的方法来提高PheS*(A312G)蛋白的表达量。结果表明,串联5个启动子Pldh后(5Pldh-pheS*),PheS*(A312G)蛋白的表达量便足以使宿主细胞对15 mM p-Cl-Phe敏感。随后,将反向筛选标记5Pldh-pheS*插入到温度敏感型质粒pG+host9,在乳酸乳球菌NZ9000中建立了一个无痕的基因组编辑系统PheS*/pG+host9。此外,本文也验证了pheS*作为反向筛选标记在干酪乳杆菌BL23中的可行性。这些结果表明,pheS*作为反向筛选标记可以在乳酸乳球菌NZ9000中实现目的基因的无痕删除,并且具有在干酪乳杆菌BL23中的应用潜力。此外,这一高效且省时的无痕基因组编辑系统PheS*/pG+host9具有应用于其它乳酸菌的潜力,为乳酸菌代谢工程及合成生物学的发展提供了有效手段。(本文来源于《山东大学》期刊2019-05-24）
李嘉慧,郑正,邓晓玲[3]（2019）在《基于原噬菌体类型的我国柑橘黄龙病菌种群遗传结构分析》一文中研究指出柑橘黄龙病是柑橘生产上最严重的病害之一,由难培养的候选韧皮部杆菌亚洲种("Candidatus Liberibacter asiaticus",CLas)引起。目前,已报道的与CLas相关的原噬菌体有3种,并且不同的CLas样品中可以检测到不同类型的原噬菌体或不同类型的组合。本研究基于原噬菌体类型特异引物对从我国南方8省收集的548个黄龙病样品进行原噬菌体类型的鉴定和分析。结果表明,基于原噬菌体类型,在548个样品中共鉴定了7种类型的菌株,分别为Type 1(7.12%)、Type 2(60.22%)、Type 3(3.83%)、Type 1+Type 2(3.28%)、Type 1+Type 3(17.34%)、Type 1+Type 2+Type 3(3.47%)和None类型(不含上述3种类型原噬菌体)(4.74%),其中只携带Type 2类型原噬菌体菌株为华南地区优势种群。此外,基于遗传多样性和遗传距离对我国南方地区的CLas种群进行种群结构分析发现,我国南方地区的CLas种群可以分为3个组,即Ⅰ组(广东、江西、广西、福建)、Ⅱ组(浙江和湖南)以及Ⅲ组(云南和海南),其中Ⅰ组和Ⅱ组又可聚为一大组。该结果可为研究我国柑橘黄龙病流行规律提供一定的理论基础。(本文来源于《植物病理学报》期刊2019年03期）
陈丽芬,徐昭焕,肖丽芳,张丽卿,王建国[4]（2017）在《赣南柑橘木虱体内黄龙病菌psy62株系原噬菌体类型多样性的研究》一文中研究指出为探明柑橘木虱体内黄龙病菌psy62株系中原噬菌体遗传多样性及与柑橘株系的遗传差异,本研究将利用3对引物在psy62基因组中2个噬菌体FP1和FP2的同源序列区域内对赣南地区阳性样品进行PCR扩增和测序。结果显示,赣南地区阳性样品在此基因区域内有28头柑橘木虱检测到原噬菌体,共有5种类型,分别为A,A2,B,C,C1。其中A,B的检测率相对较高;C1检测率最低,为7.1%。由此可见,在此基因位点不同地理位置的柑橘木虱原噬菌体种群有较大的遗传差异,且与美国佛罗里达的"Ca.L.asiaticus"株系,中国柑橘叶片"Ca.L.asiaticus"株系均有显着的遗传差异,这有助于进一步研究分析原噬菌体的种类差异对柑橘木虱传毒机制的影响。(本文来源于《环境昆虫学报》期刊2017年06期）
陈丽芬[5]（2017）在《赣南柑橘木虱体内黄龙病菌原噬菌体遗传多样性研究》一文中研究指出柑橘黄龙病(Huanglongbing,HLB)是柑橘生产上最具毁灭性病害之一,该病目前尚无特效药剂治疗,也无抗(耐)病品种可供生产应用,目前主要是通过挖除病树消灭病原菌。黄龙病最早在中国广东汕头被发现,目前已造成全球50多个国家和地区上亿株柑橘树感病或死亡,其主要依靠带菌苗木(接穗)进行人为传播,在自然界中的黄龙病主要传播媒介是柑橘木虱Diaphorina citri Kuwayama。由于在带菌柑橘木虱体内黄龙病菌的含量远远大于柑橘等植物寄主细胞中黄龙病菌的含量,则在田间即使植物中存在黄龙病菌,若没有柑桔木虱,病情也不会蔓延。因此防控柑橘木虱,从而切断病原传播是控制柑橘黄龙病的重要措施。由于柑橘黄龙病病原菌难以分离培养,对柯赫氏法则验证也尚未完成,继而极大的限制了对柑橘木虱专性传播黄龙病菌机制的研究。最近的研究表明黄龙病菌株存在噬菌体/原噬菌体,且发现噬菌体/原噬菌体序列是该病病原菌基因组动态变化的关键组分,直接影响细菌进化和种群的多样性。因此对柑橘木虱体内病原菌中原噬菌体的遗传多样性研究有助于进一步探讨柑橘木虱专性传菌机制。本研究分别对江西赣南柑橘产地中柑橘刺吸式害虫进行了种内鉴定,并检测了刺吸式害虫体内是否携带黄龙病菌,及对赣南不同柑橘产地的柑橘木虱样品体内黄龙病菌不同菌株中原噬菌体的类型及该区域黄龙病菌株系中原噬菌体的遗传多样性进行了研究。研究结果如下:1.我们先基于形态鉴定和线粒体COI基因对采自江西赣州地区的柑橘刺吸式害虫种类进行测序鉴定,通过NCBI Blast结果显示本次共采到9种刺吸式害虫,分别为柑橘木虱Diaphorina citri、柑桔粉虱Dialeurodes citri、黑刺粉虱Aleurocanthus spiniferus、矢尖盾蚧Unaspis yanonensis、吹绵蚧Iceryapurchasi maskell、柑橘蓟马Scirtothrips citri、茶黄蓟马Scirtothrips dorsalis、橘蚜Toxoptera citricidus和桃蚜Myzus persicae。再利用16S rDNA标记基因进行PCR扩增检测这9种柑橘刺吸式害虫是否携带黄龙病菌,结果显示只在柑橘木虱体内检测到黄龙病菌,在柑桔粉虱、黑刺粉虱、矢尖盾蚧、吹绵蚧、柑橘蓟马、茶黄蓟马、橘蚜和桃蚜等柑橘刺吸害虫体内中未检测到黄龙病菌。由此可见在赣南柑橘园内采集到的刺吸式害虫除了柑橘木虱会传播黄龙病,其他刺吸式害虫不但不传播黄龙病,体内也不携带黄龙病菌。且本章实验证实了引物O11/O12c可以用来检测黄龙病菌阳性样品,这为检测柑橘木虱样品体内黄龙病菌中原噬菌体提供了实验基础。2.柑橘黄龙病菌中存在噬菌体/原噬菌体,但目前对噬菌体在柑橘木虱传播黄龙病过程中的动态变化尚不清楚。为明确江西省赣南地区柑橘木虱体内黄龙病菌UF506株系原噬菌体类型,本研究利用原噬菌体基因hyv I和hyvⅡ对采自江西省赣南不同地区的柑橘木虱黄龙病菌阳性样品进行PCR检测和序列分析。结果显示在江西赣南地区柑橘木虱体内黄龙病菌株中原噬菌体类型的存在划分为四种,单一SC1类型,单一SC2类型,无原噬菌体类型和SC1-SC2原噬菌体类型,其中单一的原噬菌体占有一定的优势。且研究发现江西赣南地区黄龙病菌原噬菌体类型与中国其他省份存在差异,如广西和广东等株系主要携带SC2类型原噬菌体,而云南株系中只检测到了单一SC1类型。3.为进一步探明柑橘木虱体内黄龙病菌原噬菌体遗传多样性,本研究设计叁对引物对江西赣南地区的柑橘木虱黄龙病菌阳性样品进行PCR检测和序列分析。结果显示在此区域的柑橘木虱体内黄龙病菌psy62株系中共检测到5种原噬菌体类型,分别为A,A2,B,C,C1,其中A,B的检测率相对较高。进一步系统发育分析显示美国佛罗里达州柑橘叶片CLas株系,中国柑橘叶片CLas株系与中国赣南地区柑橘木虱体内CLas株系间具有显着差异。由此看出黄龙病菌中原噬菌体区域具有丰富的多态性,对该区域的研究有助于揭示原噬菌体的遗传多样性并对研究原噬菌体在柑橘木虱传播黄龙病中的作用具有重要意义。(本文来源于《江西农业大学》期刊2017-05-01）
陈丽芬,徐昭焕,肖丽芳,陈超,邓康平[6]（2017）在《赣南柑橘木虱体内黄龙病菌原噬菌体类型多样性的研究》一文中研究指出柑橘黄龙病是柑橘生产中的毁灭性病害,且该病病原菌中存在噬菌体/原噬菌体。原噬菌体序列是该病病原菌基因组动态变化的关键组分,对病原菌种内多样性起重要作用。为探明赣南地区柑橘木虱体内黄龙病菌原噬菌体类型的多样性,利用2对PCR引物对分别采自赣南赣州市、寻乌、于都、定南、瑞金、南康、崇义等7个不同柑橘产区的42头柑橘木虱阳性样品进行PCR检测和测序。结果表明在赣南地区柑橘木虱体内黄龙病菌株系原噬菌体类型的存在划分为4种:单一SC1类型、单一SC2类型、没有噬菌体类型和SC1-SC2噬菌体类型。其中单一的原噬菌体类型(SC1 or SC2)检测率达67%,而2种原噬菌体共存或未检测到噬菌体类型分别占12%、21%。由此可见赣南柑橘木虱体内黄龙病菌株中单一的原噬菌体占一定优势,可能是由于2种原噬菌体在寄主中存在竞争。对赣南柑橘木虱黄龙病菌株中噬菌体/原噬菌体类型检测有助于了解该区菌株噬菌体/原噬菌体的遗传多样性,也有助于进一步的研究分析柑橘木虱的传毒机制。(本文来源于《江西农业大学学报》期刊2017年02期）
王旭,李骏,张昭寰,潘迎捷,欧竑宇[7]（2017）在《一株含有5个原噬菌体的单增李斯特菌比较基因组分析》一文中研究指出单增李斯特菌是一种重要的人畜共患病原菌,对食品安全和人类健康造成了严重威胁,但现阶段对其进化规律的研究仍相对较少。本研究运用Illumina测序技术对一株中国单增李斯特菌WaX12的基因组进行了测定,并通过比较基因组学分析了该菌的微进化规律。结果表明:WaX12的基因组与Finland 1998相似度最高,但两者基因组间存在135个基因的差异,主要集中在WaX12的原噬菌体上。进一步分析可知,WaX12的基因组携带5个原噬菌体,除原噬菌体1外,其余4个原噬菌体均未存在于Finland 1998中。原噬菌体3和原噬菌体5来源于其他单增李斯特菌的基因组,而原噬菌体2和原噬菌体4则分别来自于大肠杆菌和粪球菌。由此可见,原噬菌体是该单增李斯特菌微进化的主要原因,而这种微进化的发生不仅限于同一种属的细菌之间,还可能源于不同种属细菌间的基因转移。(本文来源于《基因组学与应用生物学》期刊2017年02期）
晋婷婷,付正伟,沈萍,陈向东[8]（2016）在《枯草芽孢杆菌携带PBSX类缺陷性原噬菌体的普遍性调查》一文中研究指出【目的】对来自中国典型培养物保藏中心(CCTCC)的39株枯草芽孢杆菌中的PBSX类缺陷性原噬菌体进行普遍性调查。【方法】对实验菌株进行丝裂霉素C(MMC)诱导,得到诱导后的裂解液上清。通过裂解液上清中13 kb DNA片段的存在情况,及其对PBSX敏感菌Bacillus subtilis W23的攻击作用,判断该菌株是否携带PBSX类缺陷性原噬菌体。同时利用透射电镜检测裂解液上清中噬菌体状颗粒。【结果】39株检测菌株中,24株菌裂解液上清含有13 kb DNA片段,对W23也具有较强的攻击能力,为PBSX溶源菌;1株菌裂解液上清中含有13 kb DNA片段,但不能攻击W23;5株菌裂解液上清中不含13 kb DNA片段,但依然对W23具有一定的攻击能力;另外9株裂解液上清中不含13 kb DNA片段,对W23也不具备攻击能力,其中3株菌株裂解液上清中能检测到大小不同于PBSX的噬菌体状颗粒。【结论】39株检测菌株中,携带有PBSX的菌株占61.5%的比重,具有一定普遍性;而工业菌株以及分离自神农架土壤中的野生菌株中含有不同于PBSX的多种噬菌体状颗粒。本文结果为进一步揭示PBSX对于宿主菌的作用提供了更多的理论依据。(本文来源于《微生物学通报》期刊2016年06期）
陈娇月[9]（2015）在《柑橘黄龙病菌原噬菌体的基因区域遗传多态性研究》一文中研究指出柑橘黄龙病(Citrus Huanglongbing, HLB)作为世界柑橘产业最具威胁性的一种病害,在亚洲、非洲、大洋洲和南北美洲近50多个国家和地区危害并继续蔓延；HLB能侵染几乎所有的柑橘类植株,田间症状主要表现为叶片斑驳型黄化、均匀型黄化、缺素型黄化和“红鼻子”果等,造成植株寿命减短,果品质劣产量降低,带来巨大经济损失。黄龙病病原暂定为韧皮部杆菌属(Candidatus Liberibacter)的3个种：亚洲种('Ca.L. asiaticus', CLas)、非洲种('Ca.L.africanus', CLaf)和美洲种('Ca.L.americanus', CLam)。其中, CLas在世界分布最为广泛,中国和美国的黄龙病菌均为该种。HLB可经嫁接传播,亦可经菟丝子传播至常春花等：在田间主要经柑橘木虱传播,已知传媒有亚洲柑橘木虱(Diaphorina citri)、非洲柑橘木虱(Trioza erytreae)和柚喀木虱(Cacopsylla citrisuga)。该病目前尚无特效药剂治疗,也无抗(耐)病品种可供生产应用,目前最有效的防控措施有叁项：1.使用无病苗木；2.及时砍除病树；3.大面积联防联控木虱。由于人工难培养的特性,该病病原科赫氏验证尚未完成,因此对病原菌生物学和种群遗传结构特征的了解有限。鉴于CLas的遗传多样性研究的不足,尤其是中国CLas种群多样性研究仍有待完善,本学位论文以已公布的病原菌亚洲种全基因组序列(美国佛罗里达Psy62、广西GX-1、广东A4、美国加利福尼亚HHAC)为参考,通过序列比对筛选得到一些差异位点,结合课题组前期已筛选的位点,用于分析CLas遗传多样性。本研究主要获得如下结果：1、HLB微型反向转座重复元件的检测。微型反向重复转座元件(Miniature inverted-repeat transposable elements, MITE)作为一类特殊的DNA转座子,在基因调控、基因组进化及生物多样性形成中扮演重要角色。最近从CLas中鉴定了两个非自主转座元件,即MCLas-A和MCLas-B,其中MCLas-A因具有跳跃性而被认为是活性的转座元件。为进一步明确当前中国黄龙病菌样品中两种非自主转座子的发生、分布及其转座情况,本研究在前期实验基础上,对近期收集的222个黄龙病阳性样品进行分析,结果显示扩增条带中以B720(MCLas-B)和B350(推断的MCLas-A转座产物)占主导,而B630条带(活性MCLas-A)仅在贵州的1个样品中出现,表明当前中国样品中MCLas-A高频转座,其转座的生物学意义尚有待解析。对代表性B350扩增子进行序列分析表明其序列类型与之前报道的一致,在中国样品中仍存在6种主要序列类型。2、推断转座酶和MITE位点序列分析。前期研究表明在CLas基因组中MCLas-A和MCLas-B的上游基因均为推断的转座酶基因。本研究旨在分析该上游转座酶基因的序列变异,并探讨这些序列变异与非自主转座元件活性之间的相关性。通过设计可扩增推断转座酶基因和下游转座元件的引物,对来自中国、巴西和美国的43个代表性黄龙病菌分离物进行PCR和序列分析。PCR扩增可产生六种主要的扩增子,进而对所有扩增子类型进行测序发现共有12种序列型,其中3种序列型(T4、T5-2、T6)为首次报道。在序列型T5-2和T6中检测到重组事件,且所有巴西样品均含有这两种序列型。值得注意的是,在活性转座元件MCLas-A的上游序列中没有发现序列变异和重组现象,表明转座酶基因的保守性可能与非自主元件的转座活性紧密相关。聚类分析结果显示,所有序列可分为包含5个亚组的2个组群,且部分亚组对应不同的样品来源,尤其是云南瑞丽样品、巴西圣保罗样品和美国佛罗里达少量样品。重组和进化分析表明中国、巴西和美国柑橘黄龙病菌种群显着不同；与美国佛罗里达样品相比,美国加利福尼亚分离物序列与中国样品相似性更高。3、黄龙病菌中大片段序列缺失区域侧翼序列分析。中国西南地区(云南、四川、贵州)CLas样品原噬菌体区域(CLIBASIA_05640-CLBASIA_05660)中存在大片段序列缺失的现象,但其侧翼序列是否有类似的多态性现象尚有待研究。本研究进一步收集云南和四川8个CLas样品,利用前期已设计的引物对Lap56400f/Lap5660r对样品进行扩增,发现云南、四川样品中部分样品存在预期的S550条带(即存在1033nt删减),值得一提的是,除发现该特异分子标记,在云南元江的样品(YNYJ-E)中扩增出1条特异条带,命名为S1000。进而设计引物对TR1222067f/TR1224135r扩增上游区域(CLIBASIA_05625-CLIBASIA_05660),结果表明该引物能扩增出中国西南地区样品中对应的3种条带类型。序列分析表明相对Psy62株系基因组,云南YNYJ-E样品的序列在CLIBASIA_05645位点有4处小片段插入及1处缺失,CLIBASIA_05650位点及其下游基因间隔区出现3处缺失,CLIBASIA_05655位点出现1处缺失。对该特殊株系的进一步研究有望丰富对病原菌多态性及基因组可塑性的认识。(本文来源于《西南大学》期刊2015-05-27）
苏华楠[10]（2013）在《中国柑橘黄龙病病原调查、种群遗传分化及其原噬菌体溶菌酶蛋白原核表达》一文中研究指出柑橘黄龙病(Citrus Huanglongbing, HLB)是世界柑橘生产上最具毁灭性的病害之一,在亚洲、非洲、大洋洲和南北美洲的近50个国家和地区造成为害,在中国20个柑橘产区(包括台湾)已有12个遭受HLB为害,且最近又有不断扩散蔓延的趋势；HLB病原菌能侵染几乎所有柑橘类植物,病树症状表现复杂,主要表现为叶片斑驳型黄化、均匀型黄化、缺素型黄化和“红鼻子”果等症状,造成植株经济寿命减短,产量降低,果品质劣经济价值降低,从而引起巨大的经济损失。由于HLB的病原物尚不能人工培养,因此科赫氏证病亦未完成。目前,国际上普遍认为该病的病原为韧皮部杆菌属的3个暂定种：亚洲种('Candidatus Liberibacter asiaticus', CLas)、非洲种('Ca. L. africanus', CLaf)和美洲种('Ca. L. americanus', CLam)。目前该病尚无特效药剂可供治疗,也无抗(耐)病品种可供应用,只能采取以防为主的防治措施。因此对该病的研究迫在眉睫且具有一定的难度。本研究从病害取样检测到田间症状识别,再到我国CLas种群分化和流行推测,以及探索防治该病害的新思路进行了较系统的基础性研究。其中田间诊断标准的确立在实际生产中对病害的准确识别具有重要的意义,由于HLB田间症状的复杂性,常会造成误判,如何进行准确诊断将是面对实际生产中亟待解决的最现实问题。而对病原菌的种群分化研究有助于了解病菌分类、种群结构和病菌流行动态,同时也为病原类型检测、病害诊断及风险评估提供了一种敏感特异的手段,因此区分CLas的不同株系对HLB的生态和流行学研究十分重要。鉴于国内外对CLas遗传多样性及种群分化领域研究的不足,尤其是对中国CLas种群内部多位点同时分析的缺乏,本学位论文利用比较基因组分析方法得到大量差异位点,通过筛选获得用于评价我国CLas的种群多样性的位点,并对306个样品进行多位点遗传多样性分析。旨在揭示中国CLas种群分化,并进一步探索黄龙病在中国的起源及其流行。HLB病原菌CLas寄生于柑橘体内,简单的化学防治难度很大,且可操作性不强。CLas基因组中存在编码CLas原噬菌体的溶菌酶基因,这是CLas噬菌体杀死CLas细胞的有力武器,本论文通过原核表达该溶菌酶,并进一步验证该基因的溶菌活性,希望借助CLas噬菌体源溶菌酶与韧皮部无毒载体结合,运用这个工具进行HLB的有效防控,从而为HLB防控提供新思路。目前取得了如下研究成果：1、首次通过在常规CTAB法DNA提取液中添加增效剂和抗低温析出剂,获得了一种增强型新配方CTAB-Triton DNA提取液,并优化操作时间,该法无论从质量上还是从操作时间上均优于常规CTAB抽提法,而质量和产量均高于微量抽提法,产量优于DNA提取试剂盒。运用实时荧光定量PCR对感病柚子叶片各部分病原含量进行检测,明确了柑橘黄龙病的取样部位应为叶柄或主侧脉。这为柑橘产业各种DNA病害模板样品的制备提供了一个新参考,同时对HLB病害检测取样部位的选择具有一定的实际指导意义。2、经2009-2013年田间柑橘黄化症状调查,我国柑橘系统性黄化症状主要由韧皮部杆菌属的亚洲种韧皮部杆菌引起,从所采集的629份样品中未发现美洲种、非洲种韧皮部杆菌和植原体。黄化症状样品分子检测和室内传毒症状观察表明叶片斑驳型黄化症状与CLas最相关,可作为田间诊断的主要依据,果实成熟期还可结合“红鼻子”果同时进行诊断,以提高田间诊断的高效性和可靠性。本研究明确了我国柑橘主产区近几年引起柑橘系统性黄化症状的主要病原,确立了HLB田间诊断标准,对HLB田间识别与诊断具有一定的指导意义。3、通过CLas与根瘤菌科成员进行比较基因组分析,筛选并设计79对引物,获得14个变异位点,其中12个变异较为丰富。对这12对引物进行退火温度优化,得到11个特异性较好的引物对来自中国9省306份CLas样品和1个巴西CLas样品进行PCR扩增,其中,6个位点能较好评估中国CLas种群类型,聚类结果显示中国CLas共分两大组,云贵川一组、两广闽赣浙为另一组。通过多个变异位点同时对CLas样品进行分析,从而推测中国CLas可能存在云南和广东两个起源中心。这为HLB在中国的起源和流行推测提供了一定的分子依据。4、首次提出使用(原)噬菌体源溶菌酶进行HLB防控的思路,通过CLas基因组查找,在CLas原噬菌体区域找到了编码溶菌酶蛋白的基因,并将其克隆测序验证序列后,通过构建pTXB1-Lysozyme原核表达载体,诱导获得41kDa大小的融合蛋白,且融合蛋白均为可溶表达,经几丁质柱纯化并去除标签,得到大小为19kDa的溶菌酶蛋白,和预期预测完全一致。该研究为后续CLas原噬菌体溶菌酶功能验证提供了一定的基础,并有望将该溶菌酶通过无毒载体引入柑橘韧皮部,发挥杀菌活性,从而抑制或防治柑橘黄龙病。综上所述,本研究面对实际生产和应用检测,对HLB的症状和CLas的相关性进行了系统研究,总结出较为可靠的HLB田间诊断标准；通过实验明确了HLB取样部位应选叶柄或叶脉,而不应选取叶肉；应用比较基因组筛选多态性位点的方法对中国CLas进行多位点种群分析,为中国CLas的种群分化和病害流行起源提供了一定的分子依据。对CLas原噬菌体源溶菌酶基因原核表达为确定该溶菌酶的功能和活性提供了基础,并有望后续利用溶菌酶防治CLas。(本文来源于《西南大学》期刊2013-10-15）
原噬菌体论文开题报告
（1）论文研究背景及目的
此处内容要求：
首先简单简介论文所研究问题的基本概念和背景，再而简单明了地指出论文所要研究解决的具体问题，并提出你的论文准备的观点或解决方法。
写法范例：
乳酸菌应用于食品发酵领域具有悠久历史,它产生有机酸、维生素、多糖等高附加值化合物,赋予产品特殊的风味、质地和保质期。最近发现,一些乳酸菌也对人体有益生作用。干酪乳杆菌作为乳酸菌,是一种重要的工业微生物,广泛应用于乳制品发酵领域。目前,基因组测序技术及功能基因组学的发展为干酪乳杆菌中假想蛋白的功能鉴定,代谢工程改造,合成生物学的发展提供了理论基础。然而,干酪乳杆菌的基因组编辑主要采用同源双交换的方法,这种方法效率低下,耗时且操作烦琐,阻碍了上述课题的研究进程。此外,干酪乳杆菌也可以作为理想的细胞工厂表达抗原,生物活性分子以及一些酶类。但是,干酪乳杆菌作为细胞工厂还存在很多亟需解决的问题,例如,无法实现高效地程序化精简基因组,以便构建最适细胞工厂;无法以染色体整合的形式表达足量的重组蛋白,解决以质粒的方式表达重组蛋白遗传稳定性低的问题;无法高效筛选原噬菌体删除株,避免原噬菌体在发酵过程中被各种胁迫诱导脱离染色体导致发酵流产。本文主要以干酪乳杆菌为宿主,围绕建立基因组编辑工具以解决干酪乳杆菌在上述各个领域中遇到的问题展开研究。首先,生物信息学分析并体内验证了原噬菌体重组酶LCABL_13040-50-60的功能,以此为基础建立了基于双质粒和单质粒的基因敲除、插入及定点突变的工具,分别解决了乳酸菌中假想蛋白的功能鉴定,代谢工程改造效率低下的问题;其次,结合原噬菌体重组酶LCABL_13040-50-60和Cre/loxP系统建立了大片段基因组DNA的敲除及靶向多拷贝的基因组整合工具,分别为精简基因组构建最适细胞工厂及以染色体的方式过量表达外源蛋白提供了有效手段:最后,进一步研究了 CRISPR/Cas9系统在干酪乳杆菌中的功能,并利用其筛选到一系列原噬菌体删除株,研究了原噬菌体删除株作为细胞工厂在工业发酵中的应用潜力。此外,还在乳酸乳球菌中建立了一套反向筛选系统用于基因的无痕敲除。具体研究内容和结果如下:1.干酪乳杆菌原噬菌体重组酶LCABL 13040-50-60的挖掘及其在基因组编辑中的应用基因组编辑是挖掘新功能基因和代谢途径改造所必需的。然而,干酪乳杆菌基因组编辑效率低下,操作繁琐。本文利用生物信息学的方法,在干酪乳杆菌BL23原噬菌体PLE3的基因组上鉴定到一个与λRed操纵子类似的原噬菌体重组酶操纵子LCABL_13040-50-60。体内重组实验证明原噬菌体重组酶LCABL_13040-50-60能够介导外源线性双链DNA片段与染色体上的同源序列之间发生同源重组反应,成功地将干酪乳杆菌BL23染色体上长为167 bp的galK基因片段替换为氯霉素抗性基因(cat)。此外,通过比较不同组合蛋白质介导同源重组的效率,结果表明LCABL_13040和LCABL_13060分别是宿主核酸酶抑制因子(Redγ)和5'-3'核酸外切酶(Redα/RecE)的类似物。通过优化重组实验的条件(诱导剂的终浓度以及添加诱导剂时的OD600值;同源臂的长度;复苏时间;线性双链DNA的量),使同源重组效率得到显着提高,达到～2.2×10-7。随后,将原噬菌体重组酶LCABL_13040-50-60与Cre/loxP系统结合,实现了干酪乳杆菌BL23染色体上长为167 bp的galK基因内部片段的无缝敲除,gfp基因的无缝插入以及rpoB基因的点突变。此外,证明了在宿主核酸酶抑制因子(Redy)的辅助下,原噬菌体重组酶LCABL_13040-50-60在其它6株具有转化能力的干酪乳杆菌菌株,副干酪乳杆菌OY以及植物乳杆菌WCFS1中也具有催化同源重组的功能。这些结果表明,原噬菌体重组酶LCABL_13040-50-60具有在其它乳酸菌中进行基因组编辑的潜能,为乳酸菌中假想蛋白的功能鉴定,代谢工程改造及合成生物学的发展提供了有效手段。2.基于原噬菌体重组酶LCABL_13040-50-60的单质粒基因组编辑系统的构建及其在代谢工程中的应用第一部分建立的基于双质粒的基因组编辑系统虽然高效,但是,在代谢工程中对多个基因进行有序删除时仍然耗时较长。本文在干酪乳杆菌中建立了一个基于单质粒的简便快速的基因组编辑工具,并利用其对干酪乳杆菌进行代谢工程改造,成功提高了乙偶姻的产量。首先,构建质粒pMSP456-Cre,原噬菌体重组酶基因LC4BL_13040-50-60的转录由nisin诱导表达系统(NICE)来控制,位点特异性重组酶基因cre的转录由干酪乳杆菌BL23乳糖操纵子的启动子来控制。为了验证这一单质粒基因组编辑系统的有效性,利用质粒pMSP456-Cre对hicD3基因进行敲除。首先,LCABL 13040-50-60 催化线性双链 DNA(up-lox66-cat-lox71-down)的同源臂与染色体上的同源序列间发生同源重组反应,将hicD3基因替换为lox66-cat-lox71,然后,Cre位点特异性重组酶介导cat基因的切除,效率为60%。为了验证该系统能否实现干酪乳杆菌基因的有序删除,将与合成乙偶姻副产物相关的叁个基因(pflB,ldh和pdhC)进行连续的敲除,效率分别为60%,40%和60%。最终获得四个基因的敲除株在摇动条件下能够将59.8%的葡萄糖转化为乙偶姻,乙偶姻的产量约为野生株的18倍。这些结果表明本文为干酪乳杆菌基因组编辑提供了一种简单快捷的方法,可以应用于代谢工程改造干酪乳杆菌高产高附加值代谢产物。3.结合LCABL 13040-50-60和Cre/loxP系统敲除干酪乳杆菌大片段基因组DNA近年来,精简基因组构建最适细胞工厂受到广泛的关注。但是,前两部分内容构建的基因组敲除工具在敲除大片段基因组DNA时效率低下,无法快速高效地精简干酪乳杆菌基因组。本文在干酪乳杆菌BL23中构建了一个基于原噬菌体重组酶LCABL 13040-50-60和Cre/loxP位点特异性重组系统的基因组敲除工具。原噬菌体重组酶LCABL 13040-50-60用来介导目的片段5'和3'端突变loxP(lox66和lox71)位点的插入。随后,Cre位点特异性重组酶介导目的片段的删除。利用这一工具,成功敲除了干酪乳杆菌BL23染色体上一个长达～39.3 kb的非必需片段,一个长～12.8 kb且对细胞生长有影响的片段,以及同时敲除染色体上两个不连续的目的片段(5.2 kb和6.6 kb),效率都为100%。此外,为了验证这一工具能否用于多个DNA片段敲除株的构建,在干酪乳杆菌BL23染色体上有序删除了两个DNA片段(长度约占全基因组的1.68%)。最后,对获得突变株的生物学特性(包括生长速率,电转效率,细胞形态以及外源蛋白的表达量)进行研究。据我们所知,这是首次在干酪乳杆菌中实现大片段基因组DNA的有序删除。这一高效低成本的大片段DNA敲除工具可以加快精简基因组的步伐,以便更快地实现程序化构建干酪乳杆菌工程菌株作为最适细胞工厂高产高附加值产物。4.干酪乳杆菌中靶向多拷贝基因组整合工具的建立及其在提高重组蛋白表达中的应用微生物细胞工厂以染色体的形式表达重组蛋白可以解决以质粒的方式表达重组蛋白遗传稳定性低的问题。然而,在利用现有的染色体整合方法构建的干酪乳杆菌菌株中,重组蛋白的表达量不足以应用于实际生产中。本文在干酪乳杆菌中建立了一个两步法的靶向多拷贝基因组整合系统。此整合系统基于原噬菌体重组酶LCABL_13040-50-60和Cre/loxP系统,能够实现外源基因整合到染色体上,效率达到～3.7×103 CFU/μg DNA。利用此系统将单拷贝的gfp基因分别整合到染色体上均匀分布的六个位点,构建的六个整合株的相对荧光强度(RFUs)最大相差约3.7倍,其中,单拷贝gfp基因插入位点LCABL_07270的整合株的相对荧光强度(RFU)最大。此外,随机选取gfp基因插入位点LCABL_07270的整合株,发现它们的相对荧光强度(RFUs)的范围为993±89到7,289±564,对应的gfp基因的相对拷贝数为1到13.68±1.08。此外,经过63代的无选择压力培养,13.68±1.08个gfp拷贝的菌株中GFP蛋白的表达比以质粒方式表达GFP蛋白的菌株稳定性要高。为了进一步验证此系统能否用于生物活性分子的高表达,利用此系统成功将5.51±0.25个拷贝的大肠杆菌菌毛黏附素基因faeG插入到位点LCABL_07270中并实现稳定表达。这些结果表明,此整合系统可以通过定向多拷贝的基因整合实现重组蛋白高效、稳定地表达,为乳杆菌作为细胞工厂以染色体的方式表达外源蛋白提供了有效的手段。5.利用CRISPR/Cas9系统筛选干酪乳杆菌原噬菌体删除株筛选干酪乳杆菌原噬菌体删除株作为细胞工厂应用于工业发酵中可以避免原噬菌体脱离染色体导致发酵流产。然而,以目前的手段无法高效筛选原噬菌体删除株。本文利用酿脓链球菌的Ⅱ型CRISPR/Cas9系统筛选到几株原噬菌体删除的菌株,并研究了原噬菌体删除株在胁迫环境中的存活率。首先,分别将打靶染色体上的galK基因和质粒pNZ8148上的氯霉素抗性基因cat的质粒电转化菌株L.casei BL23和L.casei BL23/pNZ8148,发现转化效率明显低于非打靶质粒,表明CRISPR/Cas9系统可以切割干酪乳杆菌BL23中的双链DNA,杀死细胞。随后,通过分别转化打靶原噬菌体PLE1,PLE2和PLE3的打靶质粒,成功筛选到叁个原噬菌体独立删除的突变株(L.casei BLP1,BLP2和BLP3)。最后,以突变株为出发菌株,有序地筛选到叁个原噬菌体全部删除的菌株L.casei BLP1 23。通过比较这些突变株与野生株在不同胁迫环境下的存活率,发现原噬菌体删除株L.casei BLP1 23在大部分胁迫环境中的存活率都与野生株几乎没有差异,表明原噬菌体删除株L.casei BLP1 23具有作为细胞工厂应用于工业发酵中的潜力。6.乳酸菌中反向筛选系统的建立及其应用如今,乳酸菌的遗传改造工具还是基于条件型复制质粒的同源双交换的方法,这些方法操作繁琐,效率低下。为了解决这一问题,研究者开发了一系列的反向筛选标记,但是这些反向筛选标记大部分不能直接应用于野生型菌株。本文在乳酸乳球菌NZ9000中鉴定到一个编码苯丙氨酸tRNA合成酶α亚基的基因pheS。当在质粒上利用乳酸乳球菌NZ9000乳酸脱氢酶的启动子(Pldh)控制突变的pheS基因(pheS*)的转录时,表达的PheS*(A312G)蛋白足以使宿主细胞对苯丙氨酸的类似物对氯苯丙氨酸(p-C1-Phe)敏感,结果表明pheS*可以在乳酸乳球菌NZ9000中作为一个反向筛选标记。但是,当将Pldh-pheS插入到染色体上,PheS*(A312G)蛋白的表达量不足,导致宿主细胞对p-Cl-Phe的敏感性降低。因此,本文选用串联启动子的方法来提高PheS*(A312G)蛋白的表达量。结果表明,串联5个启动子Pldh后(5Pldh-pheS*),PheS*(A312G)蛋白的表达量便足以使宿主细胞对15 mM p-Cl-Phe敏感。随后,将反向筛选标记5Pldh-pheS*插入到温度敏感型质粒pG+host9,在乳酸乳球菌NZ9000中建立了一个无痕的基因组编辑系统PheS*/pG+host9。此外,本文也验证了pheS*作为反向筛选标记在干酪乳杆菌BL23中的可行性。这些结果表明,pheS*作为反向筛选标记可以在乳酸乳球菌NZ9000中实现目的基因的无痕删除,并且具有在干酪乳杆菌BL23中的应用潜力。此外,这一高效且省时的无痕基因组编辑系统PheS*/pG+host9具有应用于其它乳酸菌的潜力,为乳酸菌代谢工程及合成生物学的发展提供了有效手段。
（2）本文研究方法
调查法：该方法是有目的、有系统的搜集有关研究对象的具体信息。
观察法：用自己的感官和辅助工具直接观察研究对象从而得到有关信息。
实验法：通过主支变革、控制研究对象来发现与确认事物间的因果关系。
文献研究法：通过调查文献来获得资料，从而全面的、正确的了解掌握研究方法。
实证研究法：依据现有的科学理论和实践的需要提出设计。
定性分析法：对研究对象进行“质”的方面的研究，这个方法需要计算的数据较少。
定量分析法：通过具体的数字，使人们对研究对象的认识进一步精确化。
跨学科研究法：运用多学科的理论、方法和成果从整体上对某一课题进行研究。
功能分析法：这是社会科学用来分析社会现象的一种方法，从某一功能出发研究多个方面的影响。
模拟法：通过创设一个与原型相似的模型来间接研究原型某种特性的一种形容方法。
原噬菌体论文参考文献
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