西瓜花叶病毒遗传多样性及长距离移动决定因子研究

论文摘要

西瓜花叶病毒（Watermelon mosaic virus,WMV）属于马铃薯Y病毒科（Potyviridae）马铃薯Y病毒属（Potyvirus）,主要通过蚜虫以非持久性方式传播。WMV寄主范围广泛,是危害葫芦科、藜科、豆科等多种作物的重要病毒。受WMV危害后,作物的产量和品质严重下降。本研究制备了WMV CP特异性抗血清,明确了WMV臭椿分离物CN:AIL-TA:17和西葫芦分离物CN:ZUC-JN:17在生物学和血清学上的差异,分析了2个WMV分离物遗传进化关系,构建了CN:ZUC-JN:17全长侵染性cDNA克隆,鉴定了81种葫芦科作物品种对WMV的抗性,验证了WMV P1基因在决定寄主范围中的作用。具体结果如下:（1）制备了效价高、特异性强的WMV CP抗血清。利用原核表达的WMV CP免疫新西兰大白兔获得WMV CP抗血清。该抗血清能特异性识别WMV CP,与同属的番木瓜环斑病毒（Papaya ringspot virus,PRSV）、马铃薯Y病毒（Potato virus Y,PVY）、小西葫芦黄花叶病毒（Zucchini yellow mosaic virus,ZYMV）和烟草花叶病毒属的黄瓜绿斑驳花叶病毒（Cucumber green mottle mosaic virus,CGMMV）均无反应。ELISA检测表明制备的WMV CP抗血清效价为1:8192。（2）分析了WMV西葫芦分离物CN:ZUC-JN:17和臭椿分离物CN:AIL-TA:17生物学特性。利用Western blotting分析发现西葫芦分离物CN:ZUC-JN:17和臭椿分离物CN:AIL-TA:17存在血清学上相关性。通过机械摩擦接种方法将CN:ZUC-JN:17和CN:AIL-TA:17分离物分别接种到本氏烟和西葫芦,结果发现,CN:AIL-TA:17能系统侵染本氏烟,但不侵染西葫芦;CN:ZUC-JN:17能够系统侵染西葫芦,但仅能侵染本氏烟的接种叶片,不能进行系统侵染。（3）分析2个WMV分离物在全基因组水平上的遗传多样性。通过RT-PCR和5’RACE技术获得西葫芦分离物CN:ZUC-JN:17和臭椿分离物CN:AIL-TA:17全基因组序列。序列分析发现CN:ZUC-JN:17和CN:AIL-TA:17基因组全长分别为10028和10045个核苷酸（Nucleotide,nt）,其中CN:ZUC-JN:17的开放阅读框为9645 nt,编码一个含3215氨基酸的多聚蛋白;CN:AIL-TA:17的开放阅读框为9657 nt,编码一个含3219氨基酸的多聚蛋白。与NCBI数据库中的其他WMV分离物比较发现,CN:ZUC-JN:17和CN:AIL-TA:17的全基因组序列分别与分离物CN:SQU-TA:16和CN:AIL-BJ核苷酸一致率最高,为93.9%和89.7%。系统进化分析发现本研究获得的CN:ZUC-JN:17分离物属于III组;CN:AIL-TA:17分离物与北京的臭椿分离物同属于VI组。基于全基因组序列的重组分析表明CN:ZUC-JN:17分离物中存在多个重组事件,是CN:WMV-WS:16、CN:WMV-CHN:05、FR:FBR04-37:04分离物的重组体;但未在CN:AIL-TA:17分离物中发现重组事件。同源性分析结果表明,分离物CN:AILTA:17与CN:ZUC-JN:17分离物在P1基因的同源性最低。（4）获得WMV侵染性克隆pCamWMV和含有GFP的pCamWMV-GFP。基于WMV西葫芦分离物成功构建了WMV侵染性cDNA克隆pCamWMV,将其通过农杆菌浸润方法接种西葫芦、甜瓜和西瓜等葫芦科植物,发病率均为100%。将GFP插入WMV NIb和CP蛋白酶识别位点之间,获得了能在紫外灯下观察病毒积累和分布的pCamWMV-GFP表达载体。（5）鉴定了81个山东省主要葫芦科品种对WMV的抗性。利用制备的WMV侵染性克隆pCamWMV-GFP,通过室内农杆菌浸润接种方法试验鉴定了81个山东省主要葫芦科品种对WMV的抗性。结果发现,在鉴定的14个西葫芦品种中,筛选到万盛丰宝和盛丰金珠2个中抗品种,其余品种为感病或高感品种;13个西瓜品种中,绿宝新秀和浪潮一号2个品种为中抗品种,其余品种为感病或高感品种;24个甜瓜品种中,只筛选到面皮黄瓜1个品种为抗病,其余品种为感病或高感品种;16个黄瓜品种中,星君贝贝为中抗品种,其余品种均为高抗;9个南瓜品种中,爱维80南瓜属于高抗,其余属于抗病或中抗;5个瓠瓜品种中,浙浦6号和瓠子瓜2个品种属于感病,其余3个品种均为高感。（6）分析了WMV P1在本氏烟中决定长距离移动。将侵染性克隆pCamWMVGFP在本氏烟中进行继代接种,在继代二次的本氏烟中获得了能够系统侵染本氏烟的自然突变体,与野生型侵染性克隆相比,其P1基因发生了变异。利用同源重组方法将CN:AIL-TA:17的P1基因替换到侵染性克隆pCamWMV-GFP中,获得异源P1的WMV嵌合突变体pCaZUC-JN-AIL-TA-P1。将WMV嵌合突变体通过农杆菌浸润方法接种本氏烟,8天后本氏烟系统叶片出现绿色荧光点,表明WMV嵌合突变体具有系统侵染本氏烟的能力,证明了WMV P1基因在决定长距离移动过程中具有重要作用。

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1 前言

1.1 西瓜花叶病毒（WMV）研究进展

1.1.1 分布与危害

1.1.2 寄主范围及传播途径

1.1.3 株系划分

1.1.4 基因组结构及蛋白功能

1.2 WMV的检测

1.2.1 生物学方法

1.2.2 分子生物学方法

1.2.3 电镜观察法

1.2.4 血清学方法

1.3 WMV防治现状

1.3.1 农业防治

1.3.2 化学防治

1.3.3 培育与种植抗病品种

1.4 病毒寄主范围特异性研究进展

1.5 本研究的目的和意义

2 材料与方法

2.1 实验材料

2.1.1 毒原及植物材料

2.1.2 主要菌株、载体和试剂

2.1.3 主要实验仪器

2.2 实验方法

2.2.1 WMV CP抗血清的制备

2.2.2 WMV臭椿和西葫芦分离物的生物学分析

2.2.3 WMV臭椿和西葫芦分离物全基因组遗传多样性分析

2.2.4 WMV分离物CN:ZUC-JN:17 全长侵染性cDNA克隆的构建

2.2.5 P1 基因在WMV长距离移动中的作用分析

2.2.6 葫芦科作物品种对WMV的抗病性鉴定

3 结果与分析

3.1 WMV CP抗血清的制备及应用

3.1.1 WMV CP基因原核表达载体的构建

3.1.2 WMV CP的原核表达分析

3.1.3 WMV CP抗血清特异性分析

3.1.4 WMV CP抗血清灵敏度及效价分析

3.1.5 抗血清的应用

3.2 WMV臭椿和西葫芦分离物的生物学特性

3.3 WMV臭椿和西葫芦全基因组遗传多样性分析

3.3.1 基因组特征分析

3.3.2 WMV分离物的核苷酸和氨基酸一致率分析

3.3.3 WMV CN:AIL-TA:17和CN:ZUC-JN:17 多聚蛋白氨基酸序列比较

3.3.4 重组分析

3.3.5 系统发育关系分析

3.3.6 序列相似性分析

3.4 WMV西葫芦分离物侵染性cDNA克隆的构建

3.4.1 WMV全长cDNA克隆的构建

3.4.2 WMV全长cDNA克隆侵染性分析

3.5 葫芦科作物品种对WMV的抗性分析

3.6 P1在WMV侵染本氏烟过程中的作用分析

3.6.1 自然突变体的获得

3.6.2 异源P1的WMV嵌合体突变体的获得

3.6.3 嵌合体突变体pCaZUC-JN-AIL-TA-P1 在本氏烟上的侵染性鉴定

4 讨论

4.1 高质量抗血清在病毒病监测预警过程中具有重要作用

4.2 中国西瓜花叶病毒分离物存在遗传多样性

4.3 侵染性cDNA克隆是研究植物RNA病毒的重要工具

4.4 培育和种植抗性品种是防治WMV的关键

4.5 WMV P1 基因在决定长距离移动过程中具有重要作用

5 结论

参考文献

附录

致谢

攻读学位期间发表论文情况

文章来源

类型: 硕士论文

作者: 冀树娴

导师: 田延平

关键词: 西瓜花叶病毒,抗血清,侵染性克隆,寄主特异性,抗性鉴定

来源: 山东农业大学

年度: 2019

分类: 基础科学,农业科技

专业: 生物学,植物保护

单位: 山东农业大学

分类号: S432.41

总页数: 81

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西瓜花叶病毒遗传多样性及长距离移动决定因子研究

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