导读:本文包含了产甲酸草酸杆菌论文开题报告文献综述及选题提纲参考文献，主要关键词:产甲酸草酸杆菌,尿石症,草酸钙结石
产甲酸草酸杆菌论文文献综述
张帝[1]（2017）在《产甲酸草酸杆菌预防草酸钙肾结石的作用研究》一文中研究指出研究背景及目的目前肾结石是世界排名第叁的泌尿系统疾病,由于人口老龄化、全球气候变暖、生活及饮食方式改变、肥胖流行以及更加精确的诊断手段等原因,肾结石患病率将进一步提高。过去,人们往往认为肾结石是一种急性病,但越来越多的证据显示它亦是一种慢性系统性疾病,最终可能引起终末期肾脏病。晚近有研究发现肾结石患者心血管疾病风险增高。草酸钙结石是肾结石最常见的类型,占所有结石的70%-80%。尿液中草酸浓度升高是草酸钙结石形成的重要因素,过度饱和的草酸和钙结合形成草酸钙结晶,足够多的草酸钙结晶聚合形成草酸钙结石。尿草酸含量受到饮食中草酸、钙和维生素D摄入以及内源性草酸产生的影响。20%~53%的尿草酸来自饮食中的草酸摄入,即外源性草酸。内源性草酸是肝脏降解甘氨酸、乙醛酸等的终产物,人体主要通过叁种渠道排泄草酸:5%~10%分泌到肠腔,与钙离子结合形成不溶性草酸钙随粪便排出体外或被肠道微生物降解,90%~95%经肾脏随尿液排出,因此增加肠道中草酸降解和排泄可能是预防和治疗草酸钙结石的有效方法之一。1985年科学家首次发现肠道产甲酸草酸杆菌可降解草酸,人体肠道产甲酸草酸杆菌密度差异很大,从完全缺乏到108/g肠内容物都普遍存在,高含量的产甲酸草酸杆菌每日可降解0.5-1g草酸,而绝大多数草酸钙肾结石患者的肠道中缺乏这种菌,因此补充这种益生菌可大大降低草酸钙肾结石的发生及复发风险。目前关于产甲酸草酸杆菌的研究大部分集中于国外,国内相关研究甚少,本研究的目的是从健康人肠道中筛选出产甲酸草酸杆菌,研究其预防草酸钙结石的作用,为国内相关药物研发提供可靠依据。研究方法1、从健康人新鲜粪便中筛选产甲酸草酸杆菌,经分离、培养、纯化、鉴定得到产甲酸草酸杆菌菌株,将菌株扩增至不同浓度(106cfu/m L、107cfu/m L、108cfu/m L)。2、在雄性SD大鼠饮水中添加0.8%乙二醇建立草酸钙结石模型。3、每日以1m L活菌干预草酸钙结石动物模型,定期称重并收集大鼠血样及尿样,检测血钙、血镁、血磷、BUN、Scr、尿草酸、尿钙、尿镁、尿磷变化,4周后麻醉大鼠,取其肾脏,横切片并作HE染色,偏光镜下观察肾脏结晶含量,作Yasue染色观察草酸盐沉积。研究结果1、经16s rRNA序列测定,我们从健康人新鲜粪便中分离出的产甲酸草酸杆菌与已知ATCC35274相似度为100%,由此判定所获得菌种为产甲酸草酸杆菌。2、饮水中添加0.8%EG建立草酸钙结石模型后大鼠24小时尿草酸排泄量显着升高,浓度梯度产甲酸草酸杆菌干预草酸钙结石模型4周,106cfu、107cfu治疗组大鼠24小时尿草酸排出量与单纯造模组差异无统计学意义,而108cfu治疗组在第一周末24小时尿草酸排泄量显着低于造模组,且持续至第四周末。3、干预4周后,106cfu、107cfu组与造模组草酸评分差异无统计学意义,108cfu组肾脏草酸评分显着低于造模组。4、造模组大鼠体重、Scr、BUN较对照组相比差异无统计学意义,说明草酸钙结石模型的肾功能未受到影响。与对照组及造模组相比,叁个治疗组大鼠体重及肾功能差异无统计学意义,说明产甲酸草酸杆菌耐受性好。研究结论本实验已筛选出人源产甲酸草酸杆菌,并将菌种保藏于中国典型培养物保藏中心,且已在Genebank申请序列,目前培养最高浓度为107cfu/ml,还需要进一步对菌种进行优化,提高发酵浓度,缩短发酵时间;每日给予108cfu产甲酸草酸杆菌可安全、有效降低大鼠尿草酸排泄量,有效预防肾脏草酸钙结晶形成从而抑制结石形成。(本文来源于《第二军医大学》期刊2017-04-01）
姜巨全,刘贺男,肖鸿禹,付晓薇,朱光宇[2]（2014）在《产甲酸草酸杆菌细胞数群体感应系统基因hdtS克隆和功能分析》一文中研究指出为鉴定产甲酸草酸杆菌(Oxalobacter formigenes)是否具有细胞数群体感应(QS)系统,将费氏弧菌(Vibrio fischeri)和荧光假单胞菌(Pseudomonas fluorences)QS系统相关基因与产甲酸草酸杆菌(O.formigenes)基因组序列进行比对,初步确定hdtS和AGPA为QS系统候选基因。通过PCR和T-A克隆方法分别克隆以上两个基因并将其构建成表达载体pET19-hdtS和pET19-AGPA,借助SDS-PAGE凝胶电泳证实以上两个基因均在大肠杆菌(Escherichia coli)BL21(DE3)中高效表达,采用平板菌株报告法鉴定hdtS具有酰基高丝氨酸内酯(AHL)合成酶的功能,而AGPA则不具有该功能。这是国内外首次报道产甲酸草酸杆菌(O.formigenes)中QS系统有关基因,对该菌株QS系统了解及分析影响该菌株在人肠道内定殖因素具有重要意义。(本文来源于《东北农业大学学报》期刊2014年06期）
肖鸿禹[3]（2013）在《产甲酸草酸杆菌细胞数群体感应系统hdtS基因的克隆和功能分析》一文中研究指出肾结石病（Kidney stone disease）是泌尿外科常见的疾病之一，草酸钙结石(Calcium oxalatestone，CaOx)是各种类型肾结石里最为常见的一种，占肾结石的80%以上，草酸钙肾结石的发生与草酸在人尿中浓度高低有关。产甲酸草酸杆菌（Oxalobacter formigenes，OxF）则是一株能够以草酸作为唯一的碳源和能源的专性厌氧的革兰氏阴性菌。目前的研究显示，在预防治疗肾结石病方面行之有效的重要手段之一就是给肾结石患者服用OxF菌剂，并使之在人的肠道内定殖。然而，很多因素影响该菌株在肠道中定殖却制约着该菌株在临床中的应用发展。研究表明，很多肠道细菌的定殖受到细胞数群体感应系统（Quorum sensing,QS）的控制。QS机制是由细菌向外界释放一种或者几种自诱导剂（Autoinducer）并通过对它们的探测进行交流以调控群体行为的机制。革兰氏阴性菌的细胞数群体感应系统由产生自诱导剂酰基高丝氨酸内酯（AHL）的合成酶和调控蛋白两部分组成。目前所发现的细胞数群体感应系统根据其合成酶和调控蛋白大体可分为叁类：LuxI-LuxR系统、LuxM-LuxN/AinS-AinR系统和HdtS。对于前两类系统的研究比较深入详细，然而第叁种群体感应系统的HdtS是一类明显区别其它两类的AHL合成酶。与hdtS基因有关的研究仅限于几个报道，而且目前为止没有发现与其相关的调控蛋白。它是在2000年才被在荧光假单胞菌（Psdeuomnoda. fluorences）中发现的。hdtS基因与大肠杆菌（Escherichia coli）的编码溶血磷脂酸脂酰转移酶plsC有20%的同源性，其蛋白HdtS能够产生3-羟基-碳14:1、碳10:1或碳6:1的叁种高丝氨酸内酯。在专性嗜酸的氧化亚铁硫杆菌（Acidithiobacillus ferrooxidans）中，Act蛋白与HdtS有37%同源性，编码该蛋白的act基因与编码甘氨酸tRNA合成酶的α、β亚单位的glyQ和glyS以及编码磷酸脂酶的gph形成一个基因簇。这一基因位点在整个变性菌门（Proteobacteria）中具有高度的保守性，基因序列也很一致。Act蛋白被证实编码合成链长为14碳的酰基高丝氨酸内酯，它负责调控与氧化亚铁硫杆菌（A. ferrooxidans）中的Lux系统群体感应系统。产甲酸草酸杆菌（O. formigenes）的两个菌株OXCC13和HOxBLS的基因组全序列已经被测序完成。在本研究中，我们借助已知的群体感应效应的模型菌株海洋费氏弧菌(Vibrio fischeri)的luxI/luxR基因、luxM/luxN基因和ainS/ainR基因以及荧光假单胞菌（P. fluorences）的hdtS基因与产甲酸草酸杆菌（O. formigenes）的基因组全序列进行比对，结果发现OXCC13和HOxBLS均具有两个推测编码1-酰基-sn-甘油-3-磷酸转移酶（putative1-acyl-sn-glycerol-3-phosphateacyltransferase）与hdtS基因高度同源性，其中一个基因序列号为OFBG_01243（OXCC13）、OFAG_01224（HOxBLS）。我们拟使用对HOxBLS的基因组DNA为模版,进一步对该基因序列分析，发现该基因不仅与荧光假单胞菌（P. fluorences）的hdtS基因高度同源，而且与目前被鉴定的编码HdtS型AHL合成酶的氧化亚铁硫杆菌（A. ferrooxidans）中的act基因也高度同源。此外，而且产甲酸草酸杆菌（O. formigenes）中hdtS基因与编码甘氨酸tRNA合成酶的α、β亚单位的glyQ和glyS以及编码磷酸脂酶的gph形成一个基因簇，这与氧化亚铁硫杆菌（A. ferrooxidans）中的act基因与编码甘氨酸tRNA合成酶的α、β亚单位的glyQ和glyS以及编码磷酸脂酶的gph形成的基因簇的基因顺序也高度一致的。因此，我们推测产甲酸草酸杆菌（O. formigenes）中这一与hdtS/act有高度同源性的基因很可能就是编码HdtS类的群体感应系统的候选基因。然而,在分析过程当中还意外发现另一个基因被推测编码1-酰基-sn-甘油-3-磷酸转移酶（putative1-acyl-sn-glycerol-3-phosphate acyltransferase），该基因与上述的hdtS基因，与荧光假单胞菌（P.fluorences）的HdtS蛋白，及氧化亚铁硫杆菌（A. ferrooxidans）中的Act蛋白均斗具有一定的同源性。在产甲酸草酸杆菌（O. formigenes）中，既然AGPA与HdtS均被推测为1-酰基-sn-甘油-3-磷酸转移酶，且二者具有一定同源性，AGPA与其它两个被鉴定的HdtS型AHL合成酶也有一定同源性，所以我们选择AGPA基因作为另一个AHL合成酶的候选基因。为了获得hdtS与AGPA的片段，我们利用PCR手段以（O. formigenes）HOxBLS基因组DNA为模板，分别体外扩增两个基因片段。并通过T-A克隆的方法将其与pEASY-T3载体连接，得到几个阳性克隆，并通过菌落PCR,双酶切的方法对其进行验证。然后，选择其一进行测序，得到了与理论上基因序列一致的阳性克隆子。为了验证这两段基因是否具有高丝氨酸内酯合成酶的功能，我们将hdtS与AGPA构建到表达载体pET19中，检验结果，其能够得到表达及大量的可溶性蛋白，并且蛋白大小与预测的蛋白大小基本一致。这为接下来验证这两种基因的功能提供了有力的理论依据。最终，我们利用平板菌株报告法对这两段基因是否具有高丝氨酸内脂合成酶进行初步验证,发现hdtS确实具有该合成酶功能，而AGPA却并没有这种功能。在这一初步结果的基础上,为了能更准确并有选择性地检测到高丝氨酸内脂,我们准备利用GC-MS的方法对BL21/pET19-hdtS细菌提取物进行检测，达到对其定性的目的。至今为止，没有任何产甲酸草酸杆菌（O. formigenes）的细胞数群体感应系统的有关基因的报道。既然产甲酸草酸杆菌（O. formigenes）是极其重要的治疗和预防肾结石疾病的益生菌，所以对于该基因的克隆及功能分析对于该菌株的群体感应系统的了解就具有极其重要性与迫切性,并且我们对该菌株的群体感应系统的有关研究对探究影响该菌株在人的肠道内定殖的因素以至于该菌株在治疗和预防肾结石疾病的临床上的应用具有深远地重要意义。(本文来源于《东北农业大学》期刊2013-06-01）
阳旭明,袁坚,雷鸣,张泽[4]（2012）在《产甲酸草酸杆菌基因frc和oxc在人骨髓间充质干细胞中的表达》一文中研究指出目的:将产甲酸草酸杆菌(OXF)草酸分解基因frc和oxc分别克隆到逆转录病毒载体pLEGFP-N1和pBaBE-puro,共转染正常成人骨髓间充质干细胞(hMSCs),使frc和oxc基因在hMSCs中稳定表。方法:以本实验室保存的OXF基因组为模板,PCR法扩增出frc和oxc基因的编码序列,采用逆转录病毒载体将frc和oxc导入hMSCs中,Q-PCR和Western blot检测其表达。结果:重组载体pLEGFP-N1-myc-frc、pBaBE-puro-flag-oxc构建成功;并检测出frc和oxc基因在hMSCs中的稳定表达。结论:逆转录病毒载体介导的frc和oxc能成功转染hMSCs,能为以后体外诱导分化为肝细胞,治疗内源性高草酸尿奠定基础,为下一步的实验提供原材料。(本文来源于《实用医学杂志》期刊2012年06期）
杨欢[5]（2011）在《慢病毒介导中国人肠道产甲酸草酸杆菌中草酸分解基因FRC和OXC转染肝干细胞的实验研究》一文中研究指出目的:产甲酸草酸杆菌(Oxalobacter fomigenes, Ox.F)是一种能降解草酸的肠道厌氧菌,其中降解草酸的关键酶是甲酰辅酶A转移酶(Formyl-CoA transferase, FCoAT)和草酰辅酶脱羧酶(Oxalyl-CoA Decarboxylase, OcoAD)。从中国人肠道产甲酸草酸杆菌Ox.F中克隆编码FCoAT的FRC基因和OCoAD的OXC基因,并将FRC基因和OXC基因分别与过表达慢病毒载体重组,制备能表达FCoAT和FCoAT的慢病毒,为下一步转染肝干细胞治疗高草酸尿症奠定基础。方法:用细菌基因组提取试剂盒提取中国人Ox.F的基因组DNA作为模板,用Taq高保真DNA聚合酶分别扩增FRC基因和OXC基因片段,用DNA凝胶回收试剂盒切胶回收扩增片段,用DNA连接试剂盒将回收产物分别与pMD18-T Simple载体连接,分别获得FRC基因和OXC基因的克隆载体,并转化大肠杆菌DH5α感受态细胞,挑取阳性克隆并进行测序,筛选出携带完整目的基因的质粒pMD18T simple- FRC和pMD18T simple-OXC,质粒提取,用BamH I限制性内切酶分别对pMD18T simple-FRC和pMD18T simple-OXC进行酶切获得目的基因,连接目的基因片段FRC和携带绿色荧光蛋白的pLenti6.3/v5 DEST-IRES-EGFP ,连接基因片段OXC与表达红色荧光蛋白的pLenti6.3/v5 DEST-IRES-DsRED,分别转化大肠杆菌DH5α感受态细胞,挑取阳性克隆,质粒小量提取并测序鉴定。重组慢病毒过表达载体pLenti6.3-FRC-IRES-EGFP和pLenti6.3-OXC-IRES-DsRED转染HEK293T细胞,包装收集并测定慢病毒滴度。结果:PCR扩增分别获得含有大小约为1.3 kb和1.7 kb的DNA片段,大小与Genebank中FRC和OXC基因序列相符。测序鉴定证实pLenti6.3-FRC-IRES-EGFP和pLenti6.3-OXC-IRES-DsRED分别含有正向的FRC cDNA和OXC cDNA ,转染HEK293T细胞实验24小时后,在荧光显微镜下分别可见大量绿色荧光和红色荧光,病毒滴度分别为1.15×108TU/ml和9.75×107TU/ml。结论:成功构建表达中国人肠道产甲酸草酸杆菌FCoAT基因FRC的慢病毒载体pLenti6.3-FRC-IRES-EGFP和OcoAD基因OXC的慢病毒pLenti6.3-OXC-IRES-DsRED,并制备了高滴度的过表达慢病毒载体。目的:研究大鼠胚胎来源的肝干细胞分离培养鉴定,将绿色荧光蛋白转入原代肝干细胞为后续转基因肝干细胞移植动物实验提供示踪条件。方法:体外联合机械分离和胶原酶消化法分离孕13.5 d SD大鼠胚胎来源肝干细胞,随后通过半量换液法纯化细胞,采用间接免疫荧光法、Real-time PCR和Western Blot对培养原代5天的细胞进行鉴定,应用特异性培养基培养传代纯化的细胞。利用电转染技术将绿色荧光蛋白转入传至第叁代的细胞。结果:原代培养的胎肝干细胞24 h后显微镜下可见细胞半贴壁状态,形态大致相同,呈圆形或卵圆形;第2天观察细胞为大小几乎一致的圆形;培养第3天出现一些由3、5个形态一致的细胞集落,细胞直径6～10μm;细胞集落不断增大,至第5天集落中细胞数量增至10个左右,集落由大小不等的致密圆形细胞组成,界限清楚;第8天后细胞呈上皮样铺展;第12天时,细胞变大呈煎蛋样摊开,形态不规则,细胞浆内可见颗粒,生长变得缓慢;传代后细胞扩增速度无明显变化,至第3代仍保持较均一的上皮细胞状。通过间接免疫荧光法和Western Blot从蛋白水平检测出纯化细胞表达干细胞标志物CD34和胆管细胞标志物CK19,Real-time PCR检测出甲胎蛋白AFP和白蛋白ALB在基因水平表达,可认为分离纯化细胞为肝干细胞;绿色荧光能在电转后的肝干细胞中稳定表达。结论:联合机械分离法和酶消化法分离纯化出孕鼠胎肝干细胞是一种简单、经济、有效的方法,稳定表达绿色荧光的肝干细胞为下一步草酸分解基因转染的肝干细胞移植治疗PH提供相应基础。目的:观察甲酰辅酶A转移酶FRC基因和草酰辅酶A脱羧酶OXC基因慢病毒表达载体转染后的肝干细胞的目的基因表达情况和草酸分解功能分析。方法:用前期构建的慢病毒过表达载体pLenti6.3-FRC-IRES-EGFP和pLenti6.3-OXC-IRES-DsRED转染分离纯化的肝干细胞,然后流式分选,并用Real-time PCR和Western Blot检测阳性细胞中目的基因的表达情况。最后用离子色谱仪检测转染目的基因、转染空质粒后细胞对于含草酸培养液中的草酸分解功能。结果:pLenti6.3-FRC-IRES-EGFP和pLenti6.3-OXC-IRES-DsRED两种慢病毒过表达载体成功转染肝干细胞,分别可见绿色荧光和红色荧光,流式细胞仪分选能提高阳性表达率。Real-time PCR和Western Blot分别检测到FRC和OXC在基因水平和蛋白水平表达。离子色谱仪检测出pLenti6.3-FRC-IRES-EGFP稳转的细胞培养一周后各组草酸浓度分别为空白组[(1.58±0.03)g/L]、转染空质粒细胞组[(1.57±0.01)g/L]、转染细胞组[(1.37±0.02)g/L],叁组相比有统计学显着差异(P<0.01)结论:慢病毒转染草酸分解基因是肝干细胞持续获得草酸分解能力的一种有效途径,具有草酸分解功能的肝干细胞为细胞移植治疗高草酸尿奠定基础。(本文来源于《华中科技大学》期刊2011-04-01）
杨欢[6]（2011）在《慢病毒介导中国人产甲酸草酸杆菌中草酸分解基因FRC和OXC转染肝干细胞的实验研究》一文中研究指出第一部分：中国人产甲酸草酸杆菌中甲酰辅酶A转移酶基因FRC和草酰辅酶A脱羧酶基因OXC慢病毒过表达载体的构建及慢病毒制备目的：产甲酸草酸杆菌(Oxalobacter fomigenes, Ox.F)是一种能降解草酸的肠道厌氧菌,其中降解草酸的关键酶是甲酰辅酶A转移酶(Formyl-CoA transferase, FCoAT)和草酰辅酶脱羧酶(Oxalyl-CoA Decarboxylase, OcoAD)。从中国人肠道产甲酸草酸杆菌Ox.F中克隆编码FCoAT的FRC基因和OCoAD的OXC基因,并将FRC基因和OXC基因分别与过表达慢病毒载体重组,制备能表达FCoAT和FCoAT的慢病毒,为下一步转染肝干细胞治疗高草酸尿症奠定基础。方法：用细菌基因组提取试剂盒提取中国人Ox.F的基因组DNA作为模板,用Taq高保真DNA聚合酶分别扩增FRC基因和OXC基因片段,用DNA凝胶回收试剂盒切胶回收扩增片段,用DNA连接试剂盒将回收产物分别与pMD18-T Simple载体连接,分别获得FRC基因和OXC基因的克隆载体,并转化大肠杆菌DH5α感受态细胞,挑取阳性克隆并进行测序,筛选出携带完整目的基因的质粒pMD18T simple- FRC和pMD18T simple-OXC,质粒提取,用BamHⅠ限制性内切酶分别对pMD18T simple-FRC和pMD18T simple-OXC进行酶切获得目的基因,连接目的基因片段FRC和携带绿色荧光蛋白的pLenti6.3/v5 DEST-IRES-EGFP,连接基因片段OXC与表达红色荧光蛋白的pLenti6.3/v5 DEST-IRES-DsRED,分别转化大肠杆菌DH5α感受态细胞,挑取阳性克隆,质粒小量提取并测序鉴定。重组慢病毒过表达载体pLenti6.3-FRC-IRES-EGFP和pLenti6.3-OXC-IRES-DsRED转染HEK293T细胞,包装收集并测定慢病毒滴度。结果：PCR扩增分别获得含有大小约为1.3 kb和1.7 kb的DNA片段,大小与Genebank中FRC和OXC基因序列相符。测序鉴定证实pLenti6.3-FRC-IRES-EGFP和pLenti6.3-OXC-IRES-DsRED分别含有正向的FRC cDNA和OXC cDNA,转染HEK293T细胞实验24小时后,在荧光显微镜下分别可见大量绿色荧光和红色荧光,病毒滴度分别为1.15×108TU/ml和9.75×107TU/ml。结论：成功构建表达中国人肠道产甲酸草酸杆菌FCoAT基因FRC的慢病毒载体pLenti6.3-FRC-IRES-EGFP和OcoAD基因OXC的慢病毒pLenti6.3-OXC-IRES-DsRED,并制备了高滴度的过表达慢病毒载体。第二部分：胚胎来源大鼠肝干细胞的分离培养鉴定及绿色荧光转染目的：研究大鼠胚胎来源的肝干细胞分离培养鉴定,将绿色荧光蛋白转入原代肝干细胞为后续转基因肝干细胞移植动物实验提供示踪条件。方法：体外联合机械分离和胶原酶消化法分离孕13.5 d SD大鼠胚胎来源肝干细胞,随后通过半量换液法纯化细胞,采用间接免疫荧光法、Real—time PCR和Western Blot对培养原代5天的细胞进行鉴定,应用特异性培养基培养传代纯化的细胞。利用电转染技术将绿色荧光蛋白转入传至第叁代的细胞。结果：原代培养的胎肝干细胞24 h后显微镜下可见细胞半贴壁状态,形态大致相同,呈圆形或卵圆形；第2天观察细胞为大小几乎一致的圆形；培养第3天出现一些由3、5个形态一致的细胞集落,细胞直径6～10μm；细胞集落不断增大,至第5天集落中细胞数量增至10个左右,集落由大小不等的致密圆形细胞组成,界限清楚；第8天后细胞呈上皮样铺展；第12天时,细胞变大呈煎蛋样摊开,形态不规则,细胞浆内可见颗粒,生长变得缓慢；传代后细胞扩增速度无明显变化,至第3代仍保持较均一的上皮细胞状。通过间接免疫荧光法和Western Blot从蛋白水平检测出纯化细胞表达干细胞标志物CD34和胆管细胞标志物CK19, Real-time PCR检测出甲胎蛋白AFP和白蛋白ALB在基因水平表达,可认为分离纯化细胞为肝干细胞；绿色荧光能在电转后的肝干细胞中稳定表达。结论：联合机械分离法和酶消化法分离纯化出孕鼠胎肝干细胞是一种简单、经济、有效的方法,稳定表达绿色荧光的肝干细胞为下一步草酸分解基因转染的肝干细胞移植治疗PH提供相应基础。第叁部分：慢病毒介导甲酰辅酶A转移酶FRC基因和草酰辅酶A脱羧酶OXC基因转染肝干细胞的实验研究目的：观察甲酰辅酶A转移酶FRC基因和草酰辅酶A脱羧酶OXC基因慢病毒表达载体转染后的肝干细胞的目的基因表达情况和草酸分解功能分析。方法：用前期构建的慢病毒过表达载体pLenti6.3-FRC-IRES-EGFP和pLenti6.3-OXC-IRES-DsRED转染分离纯化的肝干细胞,然后流式分选,并用Real—time PCR和Western Blot检测阳性细胞中目的基因的表达情况。最后用离子色谱仪检测转染目的基因、转染空质粒后细胞对于含草酸培养液中的草酸分解功能。结果：pLenti6.3-FRC-IRES-EGFP和pLenti6.3-OXC-IRES-DsRED两种慢病毒过表达载体成功转染肝干细胞,分别可见绿色荧光和红色荧光,流式细胞仪分选能提高阳性表达率。Real—time PCR和Western Blot分别检测到FRC和OXC在基因水平和蛋白水平表达。离子色谱仪检测出pLenti6.3-FRC-IRES-EGFP稳转的细胞培养一周后各组草酸浓度分别为空白组[(1.58±0.03)g/L]、转染空质粒细胞组[(1.57±0.01)g/L]、转染细胞组[(1.37±0.02)g/L],叁组相比有统计学显着差异(P<0.01)结论：慢病毒转染草酸分解基因是肝干细胞持续获得草酸分解能力的一种有效途径,具有草酸分解功能的肝干细胞为细胞移植治疗高草酸尿奠定基础。(本文来源于《华中科技大学》期刊2011-04-01）
杨欢,陈志强,叶章群,王博涵,爱丽娅[7]（2010）在《产甲酸草酸杆菌中草酸分解酶相关基因OXC的慢病毒载体构建及真核细胞转染》一文中研究指出目的构建产甲酸草酸杆菌草酰辅酶A脱羧酶(Oxalyl-CoA Decarboxylase)基因OXC的重组慢病毒表达载体pLenti6.3-OXC-IRES-DsRED,为高草酸尿症的基因治疗奠定基础。方法用聚合酶链式反应技术(PCR)从中国人肠道来源产甲酸草酸杆菌基因组DNA中扩增0XC(本文来源于《第十七届全国泌尿外科学术会议论文汇编》期刊2010-10-14）
赖德辉,李逊,雷鸣,曾国华,袁坚[8]（2010）在《克隆与表达产甲酸草酸杆菌代谢基因Frc及临床意义》一文中研究指出目的研究产甲酸草酸杆菌草酸代谢基因Frc转化大肠杆菌BL21后稳定表达代谢草酸相关性酶--甲酰辅酶A转移酶(FCoAT)对草酸的降解效能。方法成功培养产甲酸草酸杆菌后,采用PCR方法从产甲酸草酸基因组中获得Frc基因,克隆到pMDTM19-T载体上进行测序,得到正确的基因片段。经双酶切将目的基因片段插入到原核表达载体PGEX-4T-2上,测序正确后,转化大肠杆菌BL-21,IPTG诱导表达GST-FCoAT融合蛋白,表达产物行western-blot鉴定分析。结果重组克隆载体pMDTM19-Frc经测序鉴定序列正确。成功构建融合原核表达质粒PGEX-4T-2-Frc,大肠杆菌BL21成为载体,并稳定表达可溶性融合蛋白GST-FCoAT的同时获得代谢草酸潜能。结论克隆产甲酸草酸杆菌Frc基因,成功构建PGEX-4T-2-Frc载体,并转化大肠杆菌BL21,能稳定表达可溶性融合蛋白GST-FCoAT,具有代谢草酸潜能,为肠道细菌获得代谢草酸潜能,减少胃肠道内草酸的吸收,降低尿液中草酸含量和临床防治草酸结石的研究奠定理论基础。(本文来源于《中华腔镜泌尿外科杂志(电子版)》期刊2010年03期）
赖德辉[9]（2010）在《转化产甲酸草酸杆菌Frc基因于大肠杆菌及其表达的实验研究》一文中研究指出【目的】将产甲酸草酸杆菌(Oxalobacter formigenes,OF)代谢草酸基因Frc克隆到表达载体PGEX-4T-2,以此载体转化益生菌大肠杆菌Nissle 1917(E.coli Nissle 1917,EcN),观察其目的蛋白代谢草酸相关性酶--甲酰辅酶A转移酶(Formyl-CoA Transferase,FCoAT)的稳定表达,获得具有代谢草酸潜能的EcN。【方法】YQX-II型厌氧工作站内,改良MRS培养基培养OF,革兰氏染色,细菌学形态及特异核酸序列检测鉴定。以OF基因组DNA为模板,PCR扩增目的基因Frc,构建测序质粒pMD? 19-T-Frc,氯化钙法转化大肠杆菌感受态JM109,挑选单克隆,测序blast比对,选择与GenBank(U82167.1)完全一致的单克隆。经BamHⅠ/EcoRⅠ双酶切pMD? 19-T-Frc,和原核表达载体PGEX-4T-2,产物纯化后进行连接反应,构建成原核表达质粒PGEX-4T-2-Frc,酶切电泳鉴定分析,测定序列正确。氯化钙法转化感受态EcN,转化后AMP(100mg/L)LB平板筛选,得到大肠杆菌Nissle 1917-Frc(E.coli Nissle 1917-Frc,EcN-Frc)。以终浓度为1.0mmol/L IPTG诱导培养EcN-Frc,于0,2,4,6,8,10小时,分别留取菌体和菌液。提取菌体中蛋白。ELISA检测培养基上清和菌体的融合蛋白GST- FCoAT。诱导0,1,2,3,4,5,6小时,分别留取菌体和菌液,以50ug总蛋白行western-blot鉴定分析,证明FCoAT的表达。【结果】改良MRS培养基厌氧培养OF成功,LB培养EcN成功。基因扩增OF基因组,电泳结果:1300bp位置出现Frc特异条带,测序确定序列与GenBank(U82167.1)完全一致。质粒PGEX-4T-2-Frc,酶切鉴定,可在1300bp和4900bp见特异条带,前者为Frc,后者为线性PGEX-4T-2,移码框阅读顺序正确,测序结果与前一致。western-blot:EcN-Frc在1.0mmol/L IPTG诱导后,于75KD左右可见蛋白表达条带,融合蛋白GST-FCoAT,且ELISA结果显示其在EcN-Frc上清及菌体中均有表达。且上清的表达水平高于菌体的沉淀中的水平。【结论】克隆Frc基因,构建了该基因的原核表达载体PGEX-4T-2-Frc。益生菌的大肠杆菌EcN,通过基因工程手段作为载体成功携带Frc基因,并表达FCoAT,成为具有代谢草酸潜能的新型益生大肠杆菌EcN,将为下一步体外及体内代谢草酸实验提供原料,并有望成为临床治疗高草酸尿和防治草酸结石的更适合口服的益生菌制剂。(本文来源于《广州医学院》期刊2010-05-01）
张宇霞,李儒,吴润[10]（2008）在《产甲酸草酸杆菌oxc基因的克隆及其蛋白结构预测》一文中研究指出参考GenBank中已公布的产甲酸草酸杆菌(Oxalobacter formigenes,OxB)的参考序列(M77128)设计了一对扩增OXC酶蛋白基因的引物,对产甲酸草酸杆菌(ATCC 35274)的DNA抽提物进行扩增,获得了特异性的扩增片段.运用Lnternet网络上的数据库及程序,对OXC酶蛋白的理化性质、结构和功能进行生物信息学分析.结果显示克隆序列与参考序列的核苷酸序列以及推导的氨基酸序列的同源性达到99.9%和99.6%,预测该酶蛋白是分泌到胞外行使生物学功能的胞外酶,具有良好的抗原性和亲水性,二级结构是以α-螺旋为主的混合型蛋白而且其二级结构预测显示OXC酶蛋白属于硫胺素焦磷酸依赖酶家族,和其它酶家族成员一样能够发挥降解草酸的功能.(本文来源于《甘肃农业大学学报》期刊2008年03期）
产甲酸草酸杆菌论文开题报告
（1）论文研究背景及目的
此处内容要求：
首先简单简介论文所研究问题的基本概念和背景，再而简单明了地指出论文所要研究解决的具体问题，并提出你的论文准备的观点或解决方法。
写法范例：
为鉴定产甲酸草酸杆菌(Oxalobacter formigenes)是否具有细胞数群体感应(QS)系统,将费氏弧菌(Vibrio fischeri)和荧光假单胞菌(Pseudomonas fluorences)QS系统相关基因与产甲酸草酸杆菌(O.formigenes)基因组序列进行比对,初步确定hdtS和AGPA为QS系统候选基因。通过PCR和T-A克隆方法分别克隆以上两个基因并将其构建成表达载体pET19-hdtS和pET19-AGPA,借助SDS-PAGE凝胶电泳证实以上两个基因均在大肠杆菌(Escherichia coli)BL21(DE3)中高效表达,采用平板菌株报告法鉴定hdtS具有酰基高丝氨酸内酯(AHL)合成酶的功能,而AGPA则不具有该功能。这是国内外首次报道产甲酸草酸杆菌(O.formigenes)中QS系统有关基因,对该菌株QS系统了解及分析影响该菌株在人肠道内定殖因素具有重要意义。
（2）本文研究方法
调查法：该方法是有目的、有系统的搜集有关研究对象的具体信息。
观察法：用自己的感官和辅助工具直接观察研究对象从而得到有关信息。
实验法：通过主支变革、控制研究对象来发现与确认事物间的因果关系。
文献研究法：通过调查文献来获得资料，从而全面的、正确的了解掌握研究方法。
实证研究法：依据现有的科学理论和实践的需要提出设计。
定性分析法：对研究对象进行“质”的方面的研究，这个方法需要计算的数据较少。
定量分析法：通过具体的数字，使人们对研究对象的认识进一步精确化。
跨学科研究法：运用多学科的理论、方法和成果从整体上对某一课题进行研究。
功能分析法：这是社会科学用来分析社会现象的一种方法，从某一功能出发研究多个方面的影响。
模拟法：通过创设一个与原型相似的模型来间接研究原型某种特性的一种形容方法。
产甲酸草酸杆菌论文参考文献
[1].张帝.产甲酸草酸杆菌预防草酸钙肾结石的作用研究[D].第二军医大学.2017
[2].姜巨全,刘贺男,肖鸿禹,付晓薇,朱光宇.产甲酸草酸杆菌细胞数群体感应系统基因hdtS克隆和功能分析[J].东北农业大学学报.2014
[3].肖鸿禹.产甲酸草酸杆菌细胞数群体感应系统hdtS基因的克隆和功能分析[D].东北农业大学.2013
[4].阳旭明,袁坚,雷鸣,张泽.产甲酸草酸杆菌基因frc和oxc在人骨髓间充质干细胞中的表达[J].实用医学杂志.2012
[5].杨欢.慢病毒介导中国人肠道产甲酸草酸杆菌中草酸分解基因FRC和OXC转染肝干细胞的实验研究[D].华中科技大学.2011
[6].杨欢.慢病毒介导中国人产甲酸草酸杆菌中草酸分解基因FRC和OXC转染肝干细胞的实验研究[D].华中科技大学.2011
[7].杨欢,陈志强,叶章群,王博涵,爱丽娅.产甲酸草酸杆菌中草酸分解酶相关基因OXC的慢病毒载体构建及真核细胞转染[C].第十七届全国泌尿外科学术会议论文汇编.2010
[8].赖德辉,李逊,雷鸣,曾国华,袁坚.克隆与表达产甲酸草酸杆菌代谢基因Frc及临床意义[J].中华腔镜泌尿外科杂志(电子版).2010
[9].赖德辉.转化产甲酸草酸杆菌Frc基因于大肠杆菌及其表达的实验研究[D].广州医学院.2010
[10].张宇霞,李儒,吴润.产甲酸草酸杆菌oxc基因的克隆及其蛋白结构预测[J].甘肃农业大学学报.2008