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宿主细胞通过溶酶体途径降解A型流感病毒HA蛋白的机制研究

2020-12-08阅读(989)

宿主细胞通过溶酶体途径降解A型流感病毒HA蛋白的机制研究

论文摘要

A型流感病毒是一种重要的人兽共患病病原,对公共卫生安全有着巨大威胁。A型流感病毒的跨宿主传播对预防和控制流感提出了巨大挑战。目前针对流感病毒的药物的大量使用促使耐药性的毒株不断涌现,因此开发新的抗病毒药物迫在眉睫。HA蛋白作为流感病毒表面含量最为丰富的囊膜蛋白,主要介导病毒粒子和靶细胞表面受体的结合。因此,HA蛋白在宿主细胞内折叠正确并被转运至膜上,最终组装到病毒粒子上是病毒获得感染性的先决条件。而通过阻断HA蛋白的成熟作为一种有效的抗病毒手段,值得深入研究。糖蛋白在细胞内的合成加工本身是一个容易出错的过程,细胞通过降解错误折叠的蛋白以维持细胞稳态。HA蛋白是一种高度糖基化的蛋白,其在细胞内的合成和降解受到宿主细胞的严格调控。研究表明N-糖基化对于HA蛋白的功能有重要作用,但其如何调控HA蛋白的成熟以及细胞内的降解却鲜有报道。本研究首先将HA蛋白的N-连接的糖基化位点进行逐个突变,发现糖基化位点突变即糖链缺失后影响HA蛋白的成熟。其中N26、N27、N39三个糖基化位点突变后,蛋白的表达、转运和病毒的组装效率都明显降低;同时免疫共沉淀实验表明N端三个糖基化突变的HA与内质网分子伴侣钙连蛋白（calnexin,CNX）、钙网蛋白（calreticulin,CRT）的相互作用明显增强。上述研究表明N端三个糖基化位点的突变影响HA蛋白的成熟,其对维持蛋白的结构和功能有关键性作用。宿主细胞为维持稳态通过蛋白降解通路降解错误折叠的蛋白,使用溶酶体抑制剂Bafilomycin A1（Baf-A1）可以拯救糖基化突变的HA的表达,且通过激光共聚焦显微成像显示糖基化突变的HA与溶酶体标志蛋白Lamp1有明显共定位,表明错误折叠的HA蛋白通过溶酶体途径降解。为了验证溶酶体对HA蛋白的降解作用,利用不同蛋白降解通路抑制剂处理细胞,发现H5亚型和H1亚型的HA蛋白都可以通过溶酶体降解,病毒实验证明溶酶体抑制剂Baf-A1还可以促进功能性的HA的表达。为了研究HA蛋白通过溶酶体降解的机制,利用基因RNA干扰、ELISA、抑制剂实验分析了溶酶体降解蛋白的不同通路,发现分子伴侣介导的自噬（chaperone-mediated autophagy,CMA）、内吞以及巨自噬都未参与HA蛋白的降解。最后通过分离细胞中不可溶蛋白组分发现HA蛋白错误折叠后发生凝集,蛋白由可溶状态变为不可溶状态。错误折叠的蛋白不断地聚集,会在核附近形成一种致密疏水的聚集体,称为凝集结构。为了研究HA蛋白发生凝集后是否形成凝集结构,利用激光共聚焦成像发现HA蛋白与凝集结构的波形蛋白有明显的共定位。为了明确HA蛋白形成的凝集结构是通过溶酶体降解的,利用凝集结构的marker蛋白GFP-250指示凝集结构。通过荧光显微镜观察发现H5和H1亚型的HA蛋白都可以形成凝集结构,并且这种凝集结构被溶酶体所降解。综上所述,N26、N27和N39三个糖基化位点对于蛋白的成熟有着重要作用,糖链缺失后的HA蛋白大多为不成熟的蛋白,宿主细胞使错误折叠HA蛋白后不断地聚集,形成凝集结构后被溶酶体所降解,抑制了HA蛋白的表达,从而抑制病毒的复制和感染。本研究揭示了宿主细胞HA降解蛋白的具体机制以期鉴定新的抗病毒通路,为流感药物开发提供依据。

论文目录

  • 摘要
  • abstract
  • 英文缩略表
  • 第一章 引言
  •   1.1 流感病毒概述
  •     1.1.1 流感病毒分类
  •     1.1.2 A型流感病毒的流行病学
  •     1.1.3 A型流感病毒的基因组结构及功能
  •     1.1.4 A型流感病毒的复制周期
  •   1.2 A型流感病毒HA蛋白功能及其研究进展
  •     1.2.1 HA蛋白结构和功能
  •     1.2.2 HA蛋白在宿主细胞内的合成和成熟
  •   1.3 真核细胞内蛋白质的降解途径
  •     1.3.1 蛋白质稳态
  •     1.3.2 蛋白酶体降解途径
  •     1.3.3 溶酶体相关降解通路
  •   1.4 本研究的目的和意义
  • 第二章 糖基化位点突变的HA蛋白通过溶酶体降解
  •   2.1 材料和方法
  •     2.1.1 细胞和质粒
  •     2.1.2 主要试剂和抗体
  •     2.1.3 主要仪器设备
  •     2.1.4 细胞培养
  •     2.1.5 Western blot检测
  •     2.1.6 HA蛋白糖基化位点的突变
  •     2.1.7 糖基化位点突变的HA在细胞内的表达和重组假病毒的组装
  •     2.1.8 糖基化位点突变的HA在在细胞内表达的蛋白的转运
  •     2.1.9 内质网分子伴侣与糖基化位点突变HA蛋白的相互作用研究
  •     2.1.10 糖基化位点突变后引起的内质网应激活性的检测
  •     2.1.11 糖基化突变的HA与溶酶体膜蛋白Lamp1的共定位检测
  •   2.2 结果与分析
  •     2.2.1 IAV HA蛋白糖基化位点的突变
  •     2.2.2 HA蛋白糖基化位点突变对细胞内蛋白的表达和病毒组装的影响
  •     2.2.3 N26、N27和N39糖基化位点突变对细胞内蛋白转运的影响
  •     2.2.4 糖基化位点突变HA蛋白与内质网分子伴侣CNX、CRT的相互作用的研究
  •     2.2.5 错误折叠的HA蛋白引起内质网应激,通过溶酶体降解
  •   2.3 讨论
  • 第三章 HA蛋白通过溶酶体降解的机制研究
  •   3.1 材料和方法
  •     3.1.1 细胞、病毒和质粒
  •     3.1.2 主要试剂和抗体
  •     3.1.3 主要设备
  •     3.1.4 细胞培养和细胞转染
  •     3.1.5 可溶蛋白与不可溶蛋白的检测
  •     3.1.6 “KFERQ”motif氨基酸序列定点突变
  •     3.1.7 293 T细胞敲低Lamp2a
  •     3.1.8 Cell surface ELISA
  •     3.1.9 HA蛋白与凝集结构指示蛋白Vimemtin的共定位检测
  •   3.2 结果与分析
  •     3.2.1 抑制溶酶体后,细胞中HA蛋白数量增多
  •     3.2.2 分子伴侣介导的自噬（CMA）和内吞均未参与HA蛋白的降解
  •     3.2.3 HA蛋白并未通过巨自噬途径降解
  •     3.2.4 错误折叠的HA蛋白发生凝集,并形成凝集状结构通过溶酶体降解
  •   3.3 讨论
  • 第四章 全文结论
  • 参考文献
  • 致谢
  • 作者简历

    • 文章来源

    类型: 硕士论文

    作者: 姚晓雨

    导师: 郑永辉

    关键词: 型流感病毒,蛋白,溶酶体,降解,凝集

    来源: 中国农业科学院

    年度: 2019

    分类: 基础科学,农业科技

    专业: 生物学,畜牧与动物医学

    单位: 中国农业科学院

    分类号: S852.65

    总页数: 48

    文件大小: 6144K

    下载量: 162

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