导读:本文包含了细胞周期检验点论文开题报告文献综述、选题提纲参考文献及外文文献翻译，主要关键词:周期,细胞,激酶,损伤,肿瘤,阿霉素,卵泡。
细胞周期检验点论文文献综述
乔立君[1]（2018）在《人乳头瘤病毒HPV E7癌蛋白调控细胞周期G1检验点的机制研究》一文中研究指出诱发宫颈癌的首要危险因素之一是高危型人乳头瘤病毒(Human papillomaviruses,HPV)的持续感染。宫颈癌是最常见的女性恶性肿瘤之一。尽管预防HPV的疫苗已经被应用,但只针对部分HPV亚型,且对已经感染HPV或患有免疫缺陷的病人无效。由于HPV致病机制仍还没有研究透彻,且目前还没有特异针对HPV的治疗性药物,因此继续深入探讨HPV的致病机理仍然是治疗宫颈癌及HPV相关癌症的重要理论基础。人乳头瘤病毒属于Papillomaviridae家族,是无包膜球形病毒,基因组是双链环状DNA,长8 Kb,可分为叁个功能区域:长控制区(Long Control Region,LCR),早期区(Early Region,E1,E2,E4,E5,E6 和 E7),和晚期区(Late Region,L1和L2)。其中早期区中的E6和E7是HPV诱发宫颈癌的主要致癌基因,其基因产物E6结合p53并对其进行降解,E7结合pRb并对其进行降解,此外E6和E7蛋白还通过与宿主细胞的各种蛋白相互作用来影响细胞的多个信号通路,这些蛋白参与细胞周期,DNA复制,DNA修复等,还参与转录激活和翻译,及蛋白翻译后修饰等。细胞周期检验点是由细胞周期蛋白及细胞周期蛋白依赖性激酶(Cyclin dependent kinases,Cdks)共同调控的。细胞周期中的G1检验点是控制细胞进入S期的关键检验点。通常DNA受损伤后,细胞会阻滞在G1期,阻止受损细胞进行DNA复制,并允许细胞修复系统修复受损的DNA。HPV E7可结合并降解pRb,导致E2F转录因子家族成员与pRb解离,游离的E2F结合到许多基因的启动子区域,激活参与细胞周期调控或DNA复制的基因转录,从而引起细胞增殖发生紊乱,诱导基因组不稳定性,促进肿瘤的发生。虽然以前研究已经鉴定到多种与E7相互作用的蛋白参与细胞周期的调控,但仍有许多未知蛋白参与E7介导的细胞周期调控和转化,且对于E7如何调控细胞周期G1检验点的机制仍不完全清楚。我们实验室前期通过质谱分析筛选出来多个参与E7细胞周期调控的蛋白,如WDHD1、Cdc6、CIP2A等,并对这些蛋白的功能进行了验证。另外,我们还筛选到了染色质浓缩调节因子1(Regulator of chromatin condensation 1,RCC1)和 GCN5(General control non-depressible 5),但是这两个蛋白是否参与E7调控的细胞周期G1检验点,通过什么方式参与需要进一步探索,基于此,本课题分别对RCC1和GCN5在G1检验点调控中的功能及机制进行了探讨和研究。第一部分RCC1在HPV E7调控的G1检验点中的作用及其机制研究RCC1是Ran-GTPase的鸟嘌呤核酸交换因子,研究表明RCC1是一种关键的细胞周期调节因子,其功能丧失会导致G1期停滞,但对此现象的分子机制还不清楚。此外,关于RCC1与癌症之间的关系也研究甚少,且还没有关于RCC1在宫颈癌中的功能及机制研究。通过对表达HPV E6蛋白和对照细胞的差异蛋白组进行分析,发现RCC1在E6表达细胞中表达上调。E6和E7都是HPV的重要致癌蛋白,功能上有一定的相似性,E7可能也可调节RCC1的表达。因此,本研究对RCC1与HPV E7的关系及其在HPV E7介导的G1检验点中的机制进行了探讨。研究方法1.通过NCBI的GEO数据库分析RCC1的mRNA表达情况;应用免疫组织化学(immunohistochemical,IHC)技术检测正常宫颈组织和宫颈癌组织中RCC1的蛋白表达情况。2.RT-PCR和蛋白免疫印迹检测c-Jun和RCC1在RPE1和NIKS细胞中的表达情况,并用博来霉素(Bleomycin)处理RPE1细胞检测c-Jun和RCC1蛋白表达情况;转染靶向c-Jun的siRNA检测c-Jun和RCC1的mRNA和蛋白表达情况;染色质免疫共沉淀(Chromatin immunoprecipitation,ChIP)实验检测c-Jun与RCC1启动子的结合。3.RCC1敲低及RCC1过表达后,PI染色处理细胞检测细胞周期G1期比例,BrdU处理检测S期比例。4.RT-PCR和蛋白免疫印迹检测RCC1敲低后下游细胞周期相关蛋白的表达情况。放线菌酮(Cycloheximide,CHX)处理细胞,检测E2F1的半衰期。在敲低RCC1基础上,过表达E2F1的质粒,检测其对细胞周期的影响。5.PI实验检测细胞周期蛋白依赖性激酶1(Cyclin dependent kinase,Cdk1)敲低及过表达后对细胞周期G1期的影响。6.蛋白免疫印迹和PI及BrdU实验检测RCC1敲低对宫颈癌细胞系中细胞周期相关蛋白及细胞周期的影响。7.蛋白免疫印迹检测RCC1敲低对E7蛋白及其半衰期的影响。研究结果1.RCC1高表达与宫颈癌密切相关。GEO数据库分析表明,与正常宫颈上皮相比,RCC1的mRNA在宫颈癌组织和细胞系中表达上调。通过对正常宫颈和宫颈癌组织中的RCC1蛋白进行免疫组织化学染色分析,结果显示,虽然正常宫颈和宫颈癌组织之间评分无显着差异,但宫颈癌组织中的核RCC1表达强度高于正常宫颈组织。2.在HPV E7表达的细胞中,c-Jun在转录水平上调RCC1表达。RT-PCR和蛋白免疫印迹结果显示,RCC1的mRNA和蛋白水平在E7表达的NIKS和RPE1细胞以及Bleomycin处理的RPE1-E7细胞中显着上调。细胞定位结果显示,RCC1蛋白主要定位于细胞核中,其中E7表达细胞中的表达水平比对照RPE1-Vector细胞高。这些结果表明E7上调RCC1的表达。RT-PCR和蛋白免疫印迹结果显示,c-Jun的mRNA和蛋白水平在E7表达的NIKS和RPE1细胞以及Bleomycin处理的RPE1-E7细胞中都上调。染色质免疫沉淀结果显示,c-Jun在RCC1启动子内的叁个位点处与染色质结合,且在E7表达的细胞中c-Jun与RCC1启动子区的结合比对照细胞多。敲低c-Jun后,RCC1的mRNA和蛋白水平也显着下调。3.RCC1敲低抑制G1/S期进展和DNA复制。细胞周期检测结果显示,Bleomycin处理后,对照Vector细胞发生G1期阻滞,而E7表达细胞的G1期比例较少,说明在DNA损伤的情况下,E7可以越过G1检验点。在Bleomycin处理的情况下敲低RCC1,E7表达细胞的G1期比例增加,说明细胞发生G1期阻滞。BrdU增殖实验结果显示,敲低RCC1,RPE1-E7细胞和RPE1-Vector细胞S期显着减少,且Bleomycin处理的RPE1-E7细胞S期也显着减少,说明敲低RCC1影响DNA复制。过表达RCC1结果显示,RCC1过表达可导致PBS和Bleomycin处理细胞中的G1期减少和S期增多,进一步验证了 RCC1在G1/S期中的作用。4.RCC1敲低促进E2F1降解,E2F1过表达回复RCC1敲低介导的G1/S期转换的抑制。蛋白免疫印记实验检测细胞周期相关蛋白变化的结果显示,E7表达细胞中E2F1,Cdk1和Cdk2蛋白水平显着增高,并且RCC1敲低后都显着下降,表明E2F1,Cdk1和Cdk2可能在RCC1介导的G1/S期转换中起作用。RT-PCR结果证实,敲低RCC1,E2F1转录水平没有显着变化,表明RCC1不影响E2F1的转录。细胞定位分析发现,RCC1敲低,细胞核中的E2F1减少,但细胞质中的E2F1水平基本不受影响,推测,敲低RCC1可能导致E2F1在核中发生降解。CHX处理细胞结果显示,随着RCC1敲低,E2F1稳态水平下降更快,表明E2F1降解增加。敲低内源性RCC1,并转染外源表达质粒,结果显示,过表达RCC1后E2F1蛋白水平有所恢复,表明RCC1可以防止E2F1的降解。敲低RCC1的基础上过表达E2F1结果显示,E2F1的过表达可以部分回复RCC1敲低介导的G1期阻滞。5.Cdk1参与RCC1介导的G1检验点。细胞周期检测结果显示,转染靶向Cdk1的siRNAs后,Bleomycin处理的E7表达细胞中的G1期比例增加,且在RCC1敲低的基础上过表达Cdk1,细胞可部分绕过G1期阻滞。说明Cdk1实际上部分回复了 RCC1敲低对G1期阻滞的影响。6.RCC1敲低诱导宫颈癌细胞G1期阻滞。与RPE1-Vector细胞相比,HeLa和SiHa细胞中RCC1蛋白表达水平更高。用siRCC1s处理SiHa和HeLa,结果显示E2F1,Cdk1和Cdk2蛋白水平下调,并导致G1期比例增加,S期显着降低。这些结果表明RCC1在宫颈癌细胞的G1/S期调控中有重要作用。7.RCC1敲低降低E7蛋白的表达。免疫印迹实验检测RCC1敲低后,E7蛋白水平变化,结果显示,RCC1敲低后,E7蛋白降低。且随着CHX的处理,E7蛋白降解加快。在SiHa细胞中也有同样的现象。这说明RCC1调控E7蛋白的降解。研究结论1.在HPV E7表达细胞中,E7通过c-Jun在转录水平上调RCC1表达。2.RCC1以E2F1依赖的方式调节G1/S细胞周期进展,Cdk1参与RCC1介导的G1检验点。3.RCC1在宫颈癌细胞的G1/S期调控中发挥重要作用。研究意义与创新性本研究首次发现E7通过c-Jun在转录水平上调RCC1表达,并探讨了 RCC1通过E2F1调控G1/S细胞周期进程的功能机制,提示RCC1可能参与HPV E7介导的基因组不稳定性,进而导致癌症的发生。第二部分GCN5在HPV E7调控的G1检验点中的作用及其机制研究研究表明GCN5也参与细胞周期调控。GCN5是鉴定到第一个与的转录相关的赖氨酸乙酰转移酶(Lysine acetyltransferase,KAT),是转录调控SAGA(Spt-Ada-GCN5-乙酰转移酶)和ATAC(含ADA2A)复合物的重要催化组分。虽然GCN5与癌症发展有关,但它在宫颈癌中的作用尚不清楚。研究表明E2F1可以转录激活GCN5表达,GCN5的过表达可以促进细胞生长和G1/S期的转变,另外,在E7细胞中转录因子E2F1是高表达的,据此推测GCN5可能在E7细胞中高表达,且在E7介导的细胞周期调控中起作用。因此本研究探讨了 GCN5与HPVE7的关系及其在HPV表达E7细胞中的功能机制。研究方法1.RT-PCR和蛋白免疫印迹实验检测GCN5在RPE1和NIKS细胞中表达情况。2.转染靶向GCN5的siRNAs,PI和BrdU实验检测其敲低对细胞周期的影响。3.RT-PCR和蛋白免疫印迹实验检测GCN5敲低后细胞周期相关蛋白的表达情况;蛋白免疫印迹实验检测E2F1敲低对周期相关蛋白;PI和BrdU流式实验检测E2F1敲低对细胞周期的影响;在敲低GCN5基础上过表达E2F1的质粒,检测其对细胞周期的影响。4.蛋白免疫印迹实验检测组蛋白脱乙酰酶抑制剂曲古抑菌素A(Trichostatin A,TSA)处理及敲低GCN5后组蛋白H3K9的乙酰化水平的表达情况;ChIP实验检测GCN5与E2F1启动子及敲低GCN5后E2F1启动子处乙酰化H3K9的结合情况。5.蛋白免疫印迹实验检测TSA处理及敲低GCN5后c-Myc的表达情况;蛋白质免疫沉淀实验(immunoprecipitation,IP)检测过表达GCN5及敲低GCN5对c-Myc蛋白乙酰化的影响;蛋白免疫印迹实验和PI实验检测c-Myc敲低对E2F1蛋白表达及细胞周期的影响;ChIP实验检测敲低GCN5后c-Myc与E2F1的启动子结合情况;突变c-Myc(K323R)质粒检测其表达及对E2F1启动子结合的影响。研究结果1.HPV E7上调GCN5表达。RT-PCR和蛋白免疫印迹结果显示,GCN5 mRNA和蛋白表达水平在E7表达的NIKS和RPE1细胞中显着上调。瞬时转染编码HPV-16 E7的质粒结果显示GCN5蛋白水平增加。2.在HPV-16 E7表达细胞中,敲低GCN5导致G1期停滞并抑制DNA合成。流式细胞术实验结果显示,GCN5敲低后,RPE1细胞的G1期比例增加,且E7表达细胞G1期比例增加更多。BrdU实验结果显示,敲低GCN5后,RPE1-Vector和RPE1-E7细胞及Bleomycin处理的RPE1-E7细胞S期显着降低。这些结果证明GCN5在E7表达细胞的G1期转化和S期进入中有重要作用。3.在HPV-16E7表达细胞中,GCN5依赖E2F1调节Cdk1。免疫印迹实验检测细胞周期相关蛋白的变化,结果显示,E2F1,Cdk1,CyclinA和p53在E7表达细胞中都显着上调。敲低GCN5结果显示E2F1,Cdk1和Cyclin A的蛋白水平下调。RT-PCR结果显示,GCN5敲低后,E2F1的mRNA水平下调。说明GCN5在转录水平影响E2F1的表达。免疫印迹结果显示,敲低E2F1,其下游的Cdk1和Cyclin A蛋白水平都下调。流式细胞术结果显示,敲低E2F1,并用Bleomycin处理细胞,E7表达细胞中G1期比例增加,S期比例减少,说明GCN5敲低诱导的G1停滞和下调的Cdk1依赖于E2F1。在敲低GCN5的基础上过表达E2F1质粒,结果进一步证明,E2F1的过表达可部分回复GCN5敲低引起的E7表达细胞中的G1期阻滞。这些结果表明GCN5通过影响E2F1来参与E7介导的G1期调控。4.在HPV-16 E7表达细胞中,GCN5结合并增加E2F1启动子的组蛋白H3乙酰化。免疫印迹实验检测E7表达细胞中组蛋白3赖氨酸9(H3K9)的乙酰化水平,结果显示,在E7表达细胞中,乙酰化的H3K9表达水平增加,尤其用TSA处理后;GCN5敲低后,H3K9的乙酰化水平降低,表明GCN5影响E7表达细胞中H3K9的乙酰化水平。ChIP实验结果表明,GCN5可以与E2F1启动子结合。GCN5敲低后,E2F1启动子处H3K9的乙酰化水平显着降低,表明敲低GCN5影响E2F1启动子的H3乙酰化。5.在HPV-16E7表达细胞中,GCN5乙酰化c-Myc,并有助于其稳定性和调节E2F1表达的能力。蛋白免疫印迹实验检测GCN5对c-Myc表达情况的影响,结果显示,GCN5敲低后,c-Myc的蛋白水平降低,当用TSA处理后,c-Myc的蛋白质水平有所回复;过表达GCN5可增加c-Myc乙酰化,而敲低GCN5则降低c-Myc的乙酰化,且E7表达细胞中c-Myc的乙酰化水平高于对照细胞。这些结果表明在E7表达细胞中GCN5增加c-Myc乙酰化。免疫印迹和流式细胞术实验检测c-Myc在E7表达细胞中调节E2F1和G1检验点的潜在作用,结果显示,敲低c-Myc,E2F1蛋白表达水平降低,G1期比例增加,表明在E7表达细胞中,c-Myc通过E2F1在G1检验点中起作用。ChIP实验结果显示,c-Myc与E2F1的启动子结合。敲低GCN5后,c-Myc与E2F1启动子的结合水平显着降低,这表明GCN5对c-Myc的乙酰化影响c-Myc与E2F1启动子的结合能力。构建在K323处具有突变的c-Myc突变体(K323R,模仿脱乙酰化状态;K323Q,模拟乙酰化状态),检测c-Myc的K323残基乙酰化对其稳定性的影响。免疫印迹结果显示,c-Myc的K323R突变体的蛋白水平低于野生型。ChIP实验结果显示,对于突变体K323R,c-Myc与E2F1启动子结合的相对水平降低,这表明c-Myc乙酰化对其稳定性非常重要。研究结论1.HPVE7上调GCN5表达,且GCN5对HPVE7细胞的G1/S转换有重要作用。2.在HPVE7细胞中,GCN5结合并增加E2F1启动子的组蛋白H3乙酰化。3.GCN5乙酰化c-Myc,保持其稳定性,影响其与E2F1启动子结合的水平,促进E2F1表达,进而调节细胞周期进展。研究意义与创新性本研究揭示了 E7功能的新机制,即E7通过上调GCN5来乙酰化组蛋白和c-Myc以调节E2F1表达,促进细胞周期进展。(本文来源于《山东大学》期刊2018-05-28）
张珊姗[2]（2018）在《细胞周期检验点激酶2磷酸化Beclin 1在细胞自噬中的作用及其机制研究》一文中研究指出目的:细胞自噬是细胞对于有害或者衰老的自身成分进行降解和清除的行为,是生物进化过程中高度保守的自我吞噬过程,对于维持细胞稳态和机体平衡起到重要作用。在代谢应激条件下,细胞可以通过自噬反应及时清除细胞内的有害成分并通过此过程为细胞提供能量和其生存的必要物质来维持细胞内稳态。细胞周期检验点激酶2(Checkpoint Kinase2,Chk2)作为DNA损伤修复应答反应信号通路中重要的一员,在DNA损伤与修复中发挥极其重要的作用,我们近期的研究还发现,Chk2还参与细胞在代谢应激条件下自噬的发生,揭示了Chk2在自噬调控中的重要作用。通过进一步的研究,我们还发现,在众多自噬相关蛋白中,酵母自噬相关基因6(Autophagy-related gene 6,Atg6)的同系物Beclin 1在代谢应激条件下可以与Chk2结合增强,且作为丝苏氨酸激酶的Chk2可以通过磷酸化Beclin 1来调节自噬过程。因此,在本研究中,我们将致力于进一步探讨Chk2参与细胞在代谢应激条件下细胞自噬发生的信号通路,阐明其调节自噬的分子机制,可以为DNA损伤修复应答反应和细胞自噬行为间的交互对话提供理论依据。方法:1.利用人肺腺癌H1299细胞系和小鼠胚胎成纤维细胞明确Chk2在细胞自噬中的作用,比较代谢应激条件下细胞自噬水平的差异。2.通过免疫共沉淀实验探索Chk2在代谢应激条件下调控细胞自噬的生理性底物。3.通过体外激酶实验进一步明确了Chk2磷酸化Beclin 1的具体磷酸化位点,并生产位点特异性的磷酸化抗体,在细胞内分别过表达或沉默Chk2,观察Beclin 1的位点磷酸化情况,从而确定在代谢应激条件下,活化的Chk2可以磷酸化Beclin 1的S90/S93位点。4.通过蛋白质免疫印迹和免疫共沉淀等手段证实Chk2磷酸化Beclin 1参与细胞自噬的分子机制。结果:1.Chk2参与调控代谢应激条件下的细胞自噬发生。2.Chk2调节自噬的生理性底物为Beclin 1。3.代谢应激条件下,Chk2会磷酸化Beclin 1 S90/S93位点4.代谢应激条件下,Chk2可以通过磷酸化Beclin 1减弱Beclin 1与Bcl-2之间的结合并促进细胞自噬。结论:1.细胞周期检验点激酶2即Chk2参与调控自噬过程。2.活化的Chk2可以磷酸化Beclin 1 S90/93位点抑制Beclin 1与Bcl-2之间的结合。3.活化的Chk2磷酸化Beclin 1 S90/93位点促进自噬进程。(本文来源于《中国医科大学》期刊2018-03-01）
高俊娜,连雪,孙海伟,李泽君,张训海[3]（2016）在《鸡细胞周期检验点激酶2(cChk2)单克隆抗体制备和鉴定》一文中研究指出目的制备特异性鸡细胞周期检验点激酶2(cChk2)单克隆抗体(m Ab)。方法反转录PCR扩增cChk2基因,将其克隆入原核表达质粒p GEX-4T-3中,在BL21(DE3)中经异丙基硫代半乳糖苷(IPTG)诱导表达,经SDS-PAGE检测可溶性。用cChk2腹腔免疫BALB/c小鼠,利用间接免疫荧光法(IFA)和Western blot法检测抗血清;血清检测阳性后,取小鼠脾脏与小鼠骨髓瘤细胞Sp2/0融合,利用IFA和有限稀释法筛选阳性单克隆杂交瘤细胞株。结果 cChk2主要以包涵体形式存在,多抗血清具有良好的效价,获得9株阳性杂交瘤细胞株,即1F4、2D9、2G1、3D9、3E3、4B5、4E2、5C9及5F7。结论成功制备了特异性良好的cChk2 m Ab。(本文来源于《细胞与分子免疫学杂志》期刊2016年09期）
刘晓明[4]（2015）在《小鼠卵巢中六种microRNAs和细胞周期检验点蛋白Chk1/2的功能和调控机制研究》一文中研究指出哺乳动物卵泡发育和卵母细胞成熟过程由多种细胞因子和调控途径的参与,是一个复杂的调控网络,涉及细胞增殖、凋亡、周期及细胞分化调控,而基因转录过程中转录水平(如micro RNA调控)及翻译后水平调控(如SUMO化修饰)发挥着重要作用。利用本课题组已经获得的小鼠出生后至初情期不同时期及超数排卵过程中的micro RNA深度测序结果,本课题选择了可能参与调控细胞周期检验点激酶1(Chk1,DNA损伤检验点和正常细胞周期调控)、p53(细胞凋亡调控)及类泛素分子SUMO-1(蛋白质翻译后修饰)表达的6种micro RNAs(miR-15a、miR-16、miR-410、miR-485、miR-495和mir-133a),研究了这6种micro RNAs在不同大小卵泡中的表达规律及对卵泡刺激素FSH和黄体生成素LH的反应性;micro RNAs在体外培养腔前卵泡或颗粒细胞中的作用及机制;Chk1/2在卵泡发育、颗粒细胞生长和卵母细胞成熟过程中的作用和调控机制;检测并验证了调控p53、Chk1及SUMO-1的几种micro RNAs。研究结果如下:1.所选6种microRNAs在卵泡发育过程中的表达规律、作用和调控途径(1)不同直径大小卵泡中6种microRNAs的表达规律。分离并检测了腔前卵泡(100-130μm和200-280μm)和有腔卵泡(排卵前期卵泡450-550μm和围排卵期卵泡500-600μm)中micro RNA的表达规律。Q-PCR结果显示miR-410和miR-495在较大直径的腔前卵泡(200-280μm)内的表达显着性低于其它3个时期卵泡内的表达(P<0.01;P<0.05);miR-485在较大直径腔前卵泡(200-280μm)内的表达低于其它3个时期卵泡内的表达,同时其在有腔卵泡(500-600μm)内的表达显着高于腔前卵泡内的表达(P<0.01);miR-15a和miR-133a在较小腔前卵泡(100-130μm)内表达量最高,随着卵泡直径增加其表达水平显着性降低(P<0.001;P<0.001);miR-16在有腔卵泡内的表达水平显着性的高于腔前卵泡内的表达水平(P<0.01)。(2)FSH和LH对体外培养颗粒细胞中6种micro RNAs表达水平的调控。21日龄雌性小鼠卵巢分离获得的颗粒细胞(3w-GCs)进行体外培养,添加FSH培养6 h后,miR-485、miR-495、miR-15a和miR-133a的表达水平与0 h相比显着性降低(P<0.001),miR-410和miR-16的表达水平显着性升高(P<0.001;P<0.05);21日龄雌性小鼠腹腔注射PMSG 48 h后卵巢分离获得的颗粒细胞(pre-GCs)体外培养过程中添加lh,3h后mir-410、mir-485和mir-133a的表达水平与0h相比显着性升高(p<0.001),mir-15a和mir-16的表达水平显着性降低(p<0.05);lh培养24h后,mir-410、mir-485和mir-133a的表达水平降低。此外,利用microrna模拟物转染颗粒细胞过表达mir-485和mir-495,同时添加fsh培养。q-pcr结果显示fsh也可以显着下调模拟物对mir-485或mir-495的过表达水平(p<0.01;p<0.001)。(3)6种micrornas对腔前卵泡体外生长影响的初步研究。12-14日龄雌鼠卵巢分离得到的100-130μm直径腔前卵泡经过2d的预培养后,分别转染microrna模拟物过表达该种microrna,继续培养4-6d,每隔2d检测卵泡直径。结果显示转染mir-485模拟物过表达后,在前期(培养4d)实验组和对照组卵泡直径和卵泡生长速率没有显着差异,而培养到第6d过表达mir-485组卵泡直径显着低于对照组(p<0.01),其第4-6d卵泡的生长速率也显着低于对照组(p<0.05);转染mir-495模拟物过表达后,培养4d实验组和对照组卵泡直径没有显着差异,然而其第2-4d卵泡生长率显着低于对照组(p<0.05)。这些结果说明mir-485和mir-495可能抑制腔前卵泡的生长,这一结果与较小直径腔前卵泡高表达而较大直径腔前卵泡低表达mir-485和mir-495的结果一致。转染mir-133a、mir-15a和mir-16模拟物过表达后,对卵泡的生长和生长速率均没有显着性影响。但是,过表达该3种micrornas后,其第4-6d卵泡生长率均高于对照组。(4)6种micrornas对体外培养有腔卵泡颗粒细胞增殖和凋亡的影响。分别利用microrna模拟物或抑制物转染体外培养的排卵前卵泡颗粒细胞,转染48h后检测细胞增殖或凋亡情况。结果显示:过表达mir-485可以促进颗粒细胞增殖(p<0.001),抑制颗粒细胞凋亡(p<0.01);过表达mir-495抑制颗粒细胞的增殖(p<0.01),诱导颗粒细胞凋亡(p<0.01),使细胞周期阻滞在s期(p<0.01);过表达mir-133a可以抑制颗粒细胞的增殖(p<0.01),使细胞周期阻滞在g1期(p<0.01),而降低mir-133a可以促进颗粒细胞的增殖(p<0.001);过表达mir-15a可以促进颗粒细胞的增殖(p<0.001)。这些结果暗示这些micrornas可能通过对颗粒细胞增殖和凋亡的调控参与卵泡生长和闭锁调控。(5)mir-495对体外培养颗粒细胞中雌激素分泌的影响。体外培养的颗粒细胞经microrna模拟物转染48h后检测培养液中雌激素的含量。结果发现:过表达mir-495可以显着降低培养液中雌激素水平(p<0.001),同时,q-pcr检测相关基因表达发现mir-495模拟物可以抑制颗粒细胞中类固醇激素合成相关基因(cyp11a1、cyp19a1和star)mrna表达水平。这一结果暗示mir-495可能通过调控颗粒细胞中类固醇激素合成酶的表达而参与雌激素的合成和分泌,进而影响卵泡的生长和发育。(6)靶基因筛选和验证。利用双荧光素酶报告系统和颗粒细胞体外培养体系,成功筛选并验证了3个micrornas的靶基因。mir-485可以与p533’utr结合,并在转录水平调控p53mrna和蛋白的表达水平;mir-15a和mir-16可以与chk1mrna的3’utr结合,其中mir-16可以同时降低chk1的mrna和蛋白水平表达,推测其可能通过与chk1的3’utr区结合并介导其mrna降解,从而降低其蛋白表达水平,而mir-15a只能降低chk1的蛋白表达而对其mrna表达水平无显着影响,暗示mir-15a可能是通过结合chk1的3’utr后抑制其mrna翻译而调控chk1蛋白表达水平;mir-133a可以与sumo-1基因的3’utr结合,降低sumo-1蛋白表达水平,暗示mir-133a可能通过抑制sumo-1mrna翻译而调控其蛋白表达水平。2.chk1/2在小鼠腔前卵泡发育,颗粒细胞生长和卵母细胞成熟过程中的作用和调控机制研究(1)利用chk1/2特异性抑制剂azd7762抑制chk1/2后阻碍腔前卵泡的体外生长。腔前卵泡体外培养4d,抑制剂培养卵泡同对照组卵泡相比表现不生长或负生长的现象。通过显微镜观察卵泡的形态,发现抑制剂培养卵泡表现为卵泡闭锁。(2)抑制chk1/2后颗粒细胞生长阻滞。不同浓度chk1/2抑制剂azd7762培养颗粒细胞3d,结果发现抑制chk1/2后可以显着性的抑制颗粒细胞的增殖(p<0.001),具有时间和剂量依赖性;细胞周期被阻滞在s和g2期(p<0.001)。chk1/2抑制剂培养2d后可以显着性诱导颗粒细胞的凋亡(p<0.05)。同时,增殖相关基因pcna的mrna和蛋白表达水平被chk1/2抑制剂显着性的下调(p<0.01;p<0.01);凋亡相关基因bax的mrna和蛋白表达水平被chk1/2抑制剂显着性的上调(p<0.001;p<0.05)。(3)抑制chk1/2后可以降低卵母细胞的体外成熟率。卵母细胞体外成熟培养初期添加chk1/2或chk1抑制剂(azd7762和sb218078),结果发现抑制chk1/2或chk1对gvbd率没有显着性的影响,但是却显着性的降低pb1率(p<0.05);通过不同培养时间添加抑制剂AZD7762的方法,发现卵母细胞被阻滞在减数分裂的中期或前中期。(4)抑制Chk1/2破坏卵母细胞体外成熟培养过程中纺锤体的组装和染色体的凝集,改变α-tubulin、γ-tubulin、Securin和CREST的定位,诱导phospho-P38-MAPK表达升高。(5)抑制Chk1/2可以破坏成熟卵母细胞纺锤体形态并抑制卵母细胞激活率。超数排卵获得成熟卵细胞在含Chk1/2抑制剂AZD7762中继续培养1-2 h。发现培养1 h后卵母细胞纺锤体形态正常,而培养2 h卵母细胞中纺锤体结构显示严重异常。成熟卵母细胞在体外激活前添加Chk1/2抑制剂后再激活培养,其第二极体排放率和原核形成率均显着低于对照组(P<0.01;P<0.001)。总之,本论文揭示了6种micro RNAs在大小不同直径腔前卵泡和有腔卵泡中的表达规律及体外培养颗粒细胞中所选micro RNAs对FSH和LH的反应规律,初步探讨了其在腔前卵泡体外生长和颗粒细胞增殖、凋亡、周期和雌激素合成和分泌中的作用,检测并验证了参与调控p53、Chk1和SUMO-1表达的几种micro RNAs,并对Chk1/2在卵泡发育、颗粒细胞生长和卵母细胞成熟过程中的作用和调控机制进行了研究。该研究结果将为进一步深入探讨micro RNAs如何通过调控p53、Chk1及SUMO-1表达而参与调控卵泡生长和闭锁、颗粒细胞增殖和凋亡及分化奠定重要理论基础,为理解哺乳动物卵泡发育、排卵和卵子成熟机制提供理论参考。(本文来源于《华中农业大学》期刊2015-12-01）
舒丽娟[5]（2012）在《细胞周期中G1/S检验点的研究进展》一文中研究指出细胞周期事件中存在叁个主要的调控转换点,其中起始检验点是最为重要的,而在起始检验点又存在多种作用机制影响着细胞通过它,近年来随着人们对它研究和认识的深入,不断有新的理论和认识提出,现就其研究进展综述如下。(本文来源于《中国医学工程》期刊2012年07期）
施寒清[6]（2010）在《细胞周期检验点蛋白Nbs1的转录调控及功能》一文中研究指出Nbs1是细胞应答DNA损伤时起重要作用的蛋白,特别是在应答DNA双链断裂时。它在DSB监测、DNA损伤应答、细胞周期检验点、DNA损伤的修复和DNA复制中都起到重要作用,对维持基因组的保真性和细胞的存活有重要贡献。虽然有报道c-Myc可以调控Nbs1的表达,但是关于Nbs1的转录调控的具体机制未见报道。c-Myc是一个泛在性转录因子,在细胞中调控了大量的靶基因,影响许多细胞进程,包括了细胞增殖、生长、凋亡、能量代谢、分化等。c-Myc的表达失调与肿瘤发生和治疗密切相关,关于c-Myc对肿瘤细胞的药物敏感性的影响及其机制还有待阐明。本文探讨了Nbs1的表达调控的机制和意义以及c-Myc对肿瘤细胞的药物敏感性与Nbs1和DNA修复机制的关系。我们的研究证实了Nbs1是c-Myc的靶基因,存在于Nbs1启动子区的两个E-box序列对c-Myc结合是重要的。我们的实验结果也显示,组蛋白乙酰化酶p300参与Nbs1的表达调控,p300促进Nbs1的表达。染色质免疫沉淀表明c-Myc招募p300到Nbs1启动子,而且引起了Nbs1启动子区的组蛋白H4乙酰化。通过点突变和染色质免疫沉淀我们确定了Nbs1启动子区的两个E-box序列对c-Myc招募p300有重要作用。通过集落形成实验我们发现,过表达c-Myc和Nbs1都可以降低骨肉瘤细胞U2OS的阿霉素敏感性。通过小RNA干涉和补偿实验我们发现c-Myc对阿霉素作用的影响与其调控Nbs1有关,增强DNA损伤修复能力可能是c-Myc影响阿霉素的疗效的一个重要因素。用小RNA干涉进行的集落形成实验结果也显示,要提高c-Myc高表达细胞的阿霉素敏感性,干涉Nbs1可能比直接干涉c-Myc更有效。我们对Nbs1的表达调控的机制的研究阐明了c-Myc调控Nbs1的机制,从DNA损伤修复角度说明了c-Myc对骨肉瘤细胞药物抗性的影响机制,为肿瘤的治疗提供了依据。(本文来源于《东北师范大学》期刊2010-05-01）
牟华[7]（2009）在《细胞周期检验点与肿瘤发生之间关系的研究进展》一文中研究指出DNA损伤反应引起的基因组不稳定性并不足以导致肿瘤发生,还需要一些协同突变促进肿瘤的生长或存活,因此,基因组结构不稳定和周期检验点突变失活是肿瘤发生的重要因素。与正常细胞不同,肿瘤细胞中细胞周期检验点反应缺陷,当肿瘤细胞遭受基因毒药物损伤时,可通过激活周期检验点反应阻滞细胞周期进程,加强损伤修复,导致耐药表型的产生。因此,寻找特异性的检验点抑制剂来加强化疗药物或辐射对肿瘤细胞的杀伤效应,已成为肿瘤治疗的一个研究方向。(本文来源于《生物技术通讯》期刊2009年01期）
潘宇,邵荣光[8]（2008）在《靶向细胞周期检验点的肿瘤治疗》一文中研究指出目前最常用的抗肿瘤药物是直接损伤细胞DNA的化疗药物,而细胞中存在的细胞周期检验点(cell cycle checkpoints)以及DNA修复机制是影响DNA损伤药物疗效和造成肿瘤细胞耐药的主要因素。深入了解肿瘤细胞周期检验点的调控机制,不仅有助于阐明(本文来源于《解放军医学杂志》期刊2008年11期）
马云彤,齐浩[9]（2006）在《CDC25在细胞周期运行和细胞周期检验点应答中的作用和调控机制》一文中研究指出细胞分裂周期运行和不同时相的转换通过CDC25磷酸酶去磷酸化和激活周期蛋白依赖性激酶(CDK)复合物来调控.在哺乳动物中发现3种CDC25同工物:CDC25A、CDC25B和CDC25C.早期认为在特定的细胞周期时相CDC25的3个同工物间没有功能上的重迭,然而最近发现多个CDC25同工物协同调节每个细胞周期转换过程.CDC25的活性通过多种在某种程度上重迭的机制严格调控,包括细胞内含量、亚细胞定位和磷酸化状态.CDC25也是细胞周期检验点应答中的关键调节因子,而CDC25B在检验点诱导的G2-M阻滞的恢复中起作用.未来对CDC25调控机制的阐明,将有助于发展出以CDC25为靶目标的、更为有效的抗肿瘤药物.(本文来源于《西安文理学院学报(自然科学版)》期刊2006年04期）
张伟,明镇寰[10]（2001）在《依赖P53的P53 R2基因在细胞周期检验点对损伤DNA的修复作用》一文中研究指出1 .ｐ5 3基因及Ｐ5 3蛋白ｐ5 3基因最初被认为是一个普通的癌基因 ,其产物的作用是刺激肿瘤细胞的生长。但后来发现原先研究的ｐ5 3基因只是野生型ｐ5 3基因的突变体 ,只有突变型ｐ5 3基因的产物才能刺激不正常细胞 (如癌细胞 )的生长 ,而野生(本文来源于《生命的化学》期刊2001年01期）
细胞周期检验点论文开题报告
（1）论文研究背景及目的
此处内容要求：
首先简单简介论文所研究问题的基本概念和背景，再而简单明了地指出论文所要研究解决的具体问题，并提出你的论文准备的观点或解决方法。
写法范例：
目的:细胞自噬是细胞对于有害或者衰老的自身成分进行降解和清除的行为,是生物进化过程中高度保守的自我吞噬过程,对于维持细胞稳态和机体平衡起到重要作用。在代谢应激条件下,细胞可以通过自噬反应及时清除细胞内的有害成分并通过此过程为细胞提供能量和其生存的必要物质来维持细胞内稳态。细胞周期检验点激酶2(Checkpoint Kinase2,Chk2)作为DNA损伤修复应答反应信号通路中重要的一员,在DNA损伤与修复中发挥极其重要的作用,我们近期的研究还发现,Chk2还参与细胞在代谢应激条件下自噬的发生,揭示了Chk2在自噬调控中的重要作用。通过进一步的研究,我们还发现,在众多自噬相关蛋白中,酵母自噬相关基因6(Autophagy-related gene 6,Atg6)的同系物Beclin 1在代谢应激条件下可以与Chk2结合增强,且作为丝苏氨酸激酶的Chk2可以通过磷酸化Beclin 1来调节自噬过程。因此,在本研究中,我们将致力于进一步探讨Chk2参与细胞在代谢应激条件下细胞自噬发生的信号通路,阐明其调节自噬的分子机制,可以为DNA损伤修复应答反应和细胞自噬行为间的交互对话提供理论依据。方法:1.利用人肺腺癌H1299细胞系和小鼠胚胎成纤维细胞明确Chk2在细胞自噬中的作用,比较代谢应激条件下细胞自噬水平的差异。2.通过免疫共沉淀实验探索Chk2在代谢应激条件下调控细胞自噬的生理性底物。3.通过体外激酶实验进一步明确了Chk2磷酸化Beclin 1的具体磷酸化位点,并生产位点特异性的磷酸化抗体,在细胞内分别过表达或沉默Chk2,观察Beclin 1的位点磷酸化情况,从而确定在代谢应激条件下,活化的Chk2可以磷酸化Beclin 1的S90/S93位点。4.通过蛋白质免疫印迹和免疫共沉淀等手段证实Chk2磷酸化Beclin 1参与细胞自噬的分子机制。结果:1.Chk2参与调控代谢应激条件下的细胞自噬发生。2.Chk2调节自噬的生理性底物为Beclin 1。3.代谢应激条件下,Chk2会磷酸化Beclin 1 S90/S93位点4.代谢应激条件下,Chk2可以通过磷酸化Beclin 1减弱Beclin 1与Bcl-2之间的结合并促进细胞自噬。结论:1.细胞周期检验点激酶2即Chk2参与调控自噬过程。2.活化的Chk2可以磷酸化Beclin 1 S90/93位点抑制Beclin 1与Bcl-2之间的结合。3.活化的Chk2磷酸化Beclin 1 S90/93位点促进自噬进程。
（2）本文研究方法
调查法：该方法是有目的、有系统的搜集有关研究对象的具体信息。
观察法：用自己的感官和辅助工具直接观察研究对象从而得到有关信息。
实验法：通过主支变革、控制研究对象来发现与确认事物间的因果关系。
文献研究法：通过调查文献来获得资料，从而全面的、正确的了解掌握研究方法。
实证研究法：依据现有的科学理论和实践的需要提出设计。
定性分析法：对研究对象进行“质”的方面的研究，这个方法需要计算的数据较少。
定量分析法：通过具体的数字，使人们对研究对象的认识进一步精确化。
跨学科研究法：运用多学科的理论、方法和成果从整体上对某一课题进行研究。
功能分析法：这是社会科学用来分析社会现象的一种方法，从某一功能出发研究多个方面的影响。
模拟法：通过创设一个与原型相似的模型来间接研究原型某种特性的一种形容方法。
细胞周期检验点论文参考文献
[1].乔立君.人乳头瘤病毒HPVE7癌蛋白调控细胞周期G1检验点的机制研究[D].山东大学.2018
[2].张珊姗.细胞周期检验点激酶2磷酸化Beclin1在细胞自噬中的作用及其机制研究[D].中国医科大学.2018
[3].高俊娜,连雪,孙海伟,李泽君,张训海.鸡细胞周期检验点激酶2(cChk2)单克隆抗体制备和鉴定[J].细胞与分子免疫学杂志.2016
[4].刘晓明.小鼠卵巢中六种microRNAs和细胞周期检验点蛋白Chk1/2的功能和调控机制研究[D].华中农业大学.2015
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论文知识图
