正调控元件拷贝数对黑曲霉PglaA启动子的影响

正调控元件拷贝数对黑曲霉PglaA启动子的影响

论文摘要

为获得转录水平更高的强启动子,提高黑曲霉中重组蛋白表达量,研究在黑曲霉葡萄糖淀粉酶基因启动子PglaA基础上,构建分别含2、4、6个拷贝的正调控元件片段PglaA2R、PglaA4R、PglaA6R启动子。以黑曲霉木聚糖酶基因xynB为目的基因,研究正调控元件拷贝数对PglaA启动子的影响。构建黑曲霉表达载体pSZHG2R-xynB、pSZHG4R-xynB、pSZHG6R-xynB,采用农杆菌介导法转化黑曲霉CICC2462。获得目的基因表达框整合在葡萄糖淀粉酶基因位点的纯合黑曲霉重组菌株PglaA2R-xynB、PglaA4R-xynB、PglaA6R-xynB。经SDSPAGE检测观察到重组菌株分泌约24.0 ku木聚糖酶蛋白条带。经酶活检测表明,木聚糖酶活力在第8天达最高,重组菌株PglaA4R-xynB(7 705.36 U·mL-1)、PglaA6R-xynB(8 466.32 U·mL-1)比PglaA2R-xynB(5 890.77 U·mL-1)分别提高1.31倍和1.44倍。荧光定量PCR结果表明,重组菌株PglaA4R-xynB、PglaA6R-xynB的xynB基因mRNA比PglaA2R-xynB分别提高2.2倍和5.3倍。可知,PglaA启动子正调控元件多拷贝显著提高木聚糖酶表达。

论文目录

  • 1 材料与方法
  •   1.1 材料
  •     1.1.1 菌株和质粒
  •     1.1.2 主要试剂
  •     1.1.3 主要仪器
  •   1.2 方法
  •     1.2.1 基因克隆
  •     1.2.2 PglaA重组启动子构建
  •     1.2.3 黑曲霉重组表达载体构建
  •     1.2.4 农杆菌介导法转化黑曲霉
  •     1.2.5 SDS-PAGE检测
  •     1.2.6 木聚糖酶活力检测
  • 2 结果与分析
  •   2.1 构建PglaA重组启动子
  •   2.2 构建重组表达载体
  •   2.3 冻融法转化农杆菌
  •   2.4 黑曲霉转化子筛选和鉴定
  •   2.5 SDS-PAGE蛋白检测
  •   2.6 木聚糖酶活力检测
  •   2.7 重组木聚糖酶荧光定量PCR分析
  • 3 讨论与结论
  • 文章来源

    类型: 期刊论文

    作者: 李杰,丁纯洁,鄢健楠,安欣,刘天奇,张会

    关键词: 黑曲霉,启动子,多拷贝,木聚糖酶

    来源: 东北农业大学学报 2019年06期

    年度: 2019

    分类: 农业科技,基础科学

    专业: 生物学

    单位: 东北农业大学生命科学学院

    基金: 黑龙江省自然科学基金联合引导项目(JJ2019LH1309)

    分类号: Q933

    DOI: 10.19720/j.cnki.issn.1005-9369.2019.06.004

    页码: 28-35

    总页数: 8

    文件大小: 1294K

    下载量: 124

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