若干锌指蛋白质识别（亚）端粒DNA的结构生物学研究

论文摘要

端粒长度的动态平衡决定着细胞增殖潜能,对于相应的细胞功能至关重要。端粒长度缩短过程主要有细胞分裂过程中端粒缩短和端粒修剪（Telomere trimming）快速调控。端粒长度延长过程则是通过激活端粒酶活性或端粒延伸替代机制（ALT）延长反应。端粒缩短和端粒延长之间动态平衡决定干细胞和生殖细胞的端粒长度,表明端粒长度应当受到严格控制,而此过程中相关端粒结合蛋白起到重要作用。目前已知直接结合端粒重复序列蛋白质组包括shelterin复合物的三个成员（TRF1,TRF2和POT1结合单链DNA）和HOT1蛋白质。而本文主要分三部分阐述若干锌指蛋白质识别（亚）端粒DNA的结构生物学研究。论文第一部分为人源TZAP蛋白质（ZBTB48,更名为端粒相关锌指蛋白质）与端粒DNA TTAGGG结构与功能的研究。TZAP蛋白质可直接结合到端粒双链DNA TTAGGG序列并诱发端粒修剪过程,参与端粒长度调控。TZAP蛋白质由N-端BTB/POZ结构域和C-端的11个串联C2H2锌指（Znf1-11）组成。研究发现TZAP对端粒DNA TTAGGG结合能力定位于第9-11个锌指Znf9-11,并且进一步研究表示结合能力主要由ZnF1 1贡献。虽然C2H2锌指结合DNA的特异性和机制已被深入研究,但TZAP是第一个直接结合端粒DNA的C2H2锌指蛋白质。端粒结合蛋白TRF1,TRF2和HOT1以homeodomains结构域识别双链端粒DNA,且不识别亚端粒DNA,而TZAP蛋白质偏好性地识别不同类型亚端粒DNA。因此,TZAP特异性识别（亚）端粒DNA的机制仍需进一步研究。TZAPZnF9-11-C蛋白质与18bp TTAGGG双链核苷酸复合物晶体结构证明第11个锌指Znf1 1负责识别G4G5G6三联体,C末端保守氨基酸负责识别T2A3,该复合物晶体结构为TZAP识别端粒DNA提供分子基础。论文第二部分为ZBTB10、Znf827、TR4/COUP-TF2 C4等锌指蛋白质与（亚）端粒序列结构与功能的研究。Dennis Kappei课题组筛选得到TZAP蛋白质时,获得另一个端粒DNA结合蛋白质ZBTB10。ZBTB10与TZAP（ZBTB48）皆属于Kruppel-like C2H2锌指蛋白质家族,其含有N端BTB/POZ结构域和C端两个串联C2H2（Znf1-2）锌指结构域。分析ZBTB10核酸序列,发现在两个串联C2H2锌指结构域后还存在一个保守C2HR类锌指结构域。通过荧光偏振实验发现C2HR类锌指对于ZBTB10蛋白质识别端粒序列至关重要。因此,旨在解析ZBTB10蛋白质与端粒DNA高分辨率复合物晶体结构,为阐述ZBTB10蛋白质识别端粒DNA的特异性提供分子基础。目前已获得初筛晶体,仍需进一步重复和优化晶体。澳大利亚悉尼大学HildaAPickett研究组发现锌指蛋白质Znf827能够募集NuRD（Nucleosome Remodeling and histone Deacetylase complex）复合物至ALT端粒区域,促进ALT机制发生。课题组孙爱爱博士阐述Znf827如何募集NuRD复合物,但Znf827-NuRD复合物如何定位到ALT端粒区域仍有待研究。Hilda A Pickett在文章中提出TR4和COUP-TF2两个孤儿核受体（orphan nuclear receptor）蛋白质可能在募集Znf827-NuRD中起重要作用。另一方面,关注到Znf827蛋白质自身包含9个C2H2（Znf1-9）锌指,可能也具有ALT端粒DNA结合能力。此课题期望通过解析TR4/COUP-TF2 C4锌指、Znf827与（亚）端粒DNA复合物晶体结构,阐述其定位于ALT端粒区域的结构基础。目前已获得初筛晶体,仍需进一步重复和优化晶体。论文第三部分初步探索AEBP2锌指蛋白质结构与功能。多梳抑制家族复合物PRC2的游离组分AEBP2与核心组分RBBP4和SUZ12相互作用,从而进一步增加PRC2核心复合物稳定性,同时也一定程度地提高PRC2多元复合物酶活性。AEBP2串联三个C2H2锌指结构域C端存在一段富含精氨酸和赖氨酸区域（RRK区域）,与TZAP蛋白质C端保守序列相似,由此猜测AEBP2 RRK区域可能对于AEBP2蛋白质识别dsDNA有重要作用。本课题期望解析AEBP2锌指蛋白质与DNA复合物晶体结构,并且阐述其分子机制。目前已通过荧光偏振实验证明RRK区域对于AEBP2蛋白质结合T1 DNA序列尤为重要,仍需进一步获得复合物晶体结构。

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摘要

ABSTRACT

第1章绪论

1.1 引言

1.2 端粒长度的调控

1.3 端粒结合蛋白质

1.4 TZAP参与端粒长度的调控

第2章实验材料与方法

2.1 基因克隆

2.1.1 边界的选择及引物设计

2.1.2 PCR产物的鉴定

2.1.3 PCR产物、酶切产物的回收

2.1.4 质粒的抽提

2.1.5 双酶切方法

2.1.6 连接

2.1.7 转化

2.1.8 保菌测序

2.2 蛋白质纯化

2.2.1 目的蛋白质的表达

2.2.2 目的蛋白质的纯化

2.2.3 蛋白质电泳SDS-PAGE

2.2.4 凝胶过滤层析（GFC）

2.2.5 蛋白质与核酸均一复合物的获得

2.3 复合物晶体的筛选、优化及数据处理

2.4 蛋白质TZAP定点突变

2.5 荧光偏振实验（FP）

2.6 静态光散射（SEC-MALS）

2.7 免疫荧光检验法（Immunofluorescence）

第3章实验结果与讨论

3.1 边界的选择与克隆的构建

3.2 TZAP蛋白质的表达纯化及野生型荧光偏振实验

Znf9-11-C与核酸TTAGGG复合物的获得'> 3.3 TZAP_Znf9-11-C与核酸TTAGGG复合物的获得

Znf9-11-C与核酸TTAGGG复合物晶体筛选与数据处理'> 3.4 TZAP_Znf9-11-C与核酸TTAGGG复合物晶体筛选与数据处理

Znf9-11-C与核酸TTAGGG复合物的结构及分析'> 3.5 TZAP_Znf9-11-C与核酸TTAGGG复合物的结构及分析

3.6 TZAP突变体荧光偏振数据分析

3.7 TZAP BTB domain的分析及免疫荧光（IF）数据分析

第4章锌指蛋白质ZBTB10、TR4/COUP-TF2、Znf827与（亚）端粒结构与功能的研究

4.1 引言

4.2 材料与方法

4.2.1 边界的选择及克隆的构建

4.2.2 蛋白质的表达纯化

4.2.3 锌指蛋白质与端粒DNA相互作用实验及晶体筛选

4.3 结果与分析

4.3.1 蛋白质表达纯化结果

4.3.2 锌指蛋白质与端粒DNA相互作用实验与晶体筛选

4.4 展望

第5章锌指蛋白质AEBP2结构与功能的研究

5.1 引言

5.2 材料与方法

5.2.1 AEBP2边界的选择及克隆的构建

5.2.2 AEBP2的表达纯化及与DNA相互作用实验

5.3 结果与分析

5.4 展望

参考文献

致谢

在读期间发表的学术论文与取得的其他研究成果

文章来源

类型: 硕士论文

作者: 赵亚青

导师: 施蕴渝,吴季辉

关键词: 锌指蛋白质,亚端粒,端粒修剪,结晶,荧光偏振

来源: 中国科学技术大学

年度: 2019

分类: 基础科学

专业: 生物学,生物学

单位: 中国科学技术大学

分类号: Q75

总页数: 82

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