武晓静[1]2004年在《MSCs修复血管内膜及对平滑肌部分生物学行为的影响》文中提出研究背景:平滑肌细胞增生迁移是血管损伤后再狭窄、动脉粥样硬化、高血压等多种增殖性血管疾病的共同病理生理基础,关于增殖性血管疾病治疗的研究热点也主要集中于平滑肌增生机制的探讨及如何有效抑制平滑肌细胞过度增生。虽然医学研究的迅速进展使人们对细胞因子、信号转导途径和相关基因在动脉粥样硬化和再狭窄发病机制中的认识越来越深,但对最终调节平滑肌增生的靶分子、关键基因和共同通路仍缺乏本质认识。直接抑制、破坏细胞分裂、增生的措施虽然能显着抑制平滑肌过度增生,如药物洗脱支架和血管内放射治疗都是临床防治再狭窄的有效手段,但其往往还会干扰内皮修复,远期效果并不十分肯定。血管内皮细胞能合成和分泌多种血管活性物质,在维持血管正常结构和血液功能方面发挥重要作用。多项研究表明,生理状态下血管内皮分泌的促增殖、缩血管物质和抑制增殖、舒血管物质维持动态平衡,而血管损伤后则分泌的促增殖和缩血管物质明显占优势。这些研究提示,虽然平滑肌增生是构成血管增殖的直接病因,但内皮损伤在增殖性血管疾病发病中可能起着始动和促进的作用。因此,这些研究也提示,对增殖性血管疾病的防治不能只重视如何有效抑制、破坏平滑肌细胞增生,更要重视如何促进内皮再生、改善内皮功能。利用细胞移植替代、修复受损组织或器官的结构与功能是疾病治疗的新方法,虽然自体静脉内皮细胞移植能促进损伤动脉再内皮化和减轻新生内膜增生,但静脉内皮与动脉内皮相比存在异质性,且取材需外科手术。骨髓基质干细胞(Marrow stromal stem cells,MSCs) 是骨髓中存留的一种成体干细胞,在体外促内皮生长分化的细胞因子诱导下能分化为内皮细胞,且相对易于分离和扩增,理论上是进行细胞移植较为理想的种子细胞。目前已经发现骨髓基质干细胞移植能促进缺血组织血管新生和梗死心肌再生,但尚不清楚骨髓基质干细胞移植能否促进内膜修复、抑制平滑肌细胞增生,防治损伤性血管疾病。研究目的:1. 观察不同内皮细胞生长状态与平滑肌增殖迁移能力的关系,探讨内皮再生在增殖性血管疾病发病中的作用;2. 观察骨髓基质干细胞体外修复血管内膜时向内皮分化本课题受国家自然科学基金资助(NO.30270568)
苗莉[2]2007年在《AT2R基因在体可调控表达抑制大鼠颈动脉损伤后新生内膜形成的实验研究》文中研究说明研究背景和目的:经皮冠状动脉介入(PCI)治疗是继冠状动脉旁路手术(CABG)后治疗冠心病又一革命性突破,但PCI术后冠状动脉再狭窄(RS)严重影响其远期疗效,常规经皮腔内冠状动脉成形术(PTCA)后RS率高达40～60%,支架植入术后为20～40%。药物洗脱支架虽然可减少RS的发生,但术后RS率仍有10%左右,且费用昂贵,此外,药物洗脱支架植入后存在后期、远期支架内血栓形成而危及生命等问题。因而探索经济、有效的RS防治措施仍是心血管病学领域颇为重要的课题。RS的突出病理改变是血管内膜增生,对新生内膜增生的发生机制及防治研究已成为攻破RS的突破口。近来研究发现AngⅡ的2型受体(AT2R)具有拮抗AngⅡ的型受体(AT1R)的作用,对细胞的增殖、迁移具有负性影响,本实验室已有研究结果证明,通过局部导入AT2R使其表达增强,可以明显减轻新生内膜的面积。利用转基因技术治疗的过程中,导入体内基因的表达能否被实时、定量的控制甚为重要。正常情况下,AT2R在心血管组织中表达极少,若引入的AT2R基因表达处于无调控状态,将可能造成严重后果。因此,如何主动控制引入体内的靶基因需要得到解决。既往研究发现来源于骨髓的间充质干细胞(MSC)在血管内皮损伤后黏附于损伤的血管局部,在此基础上进一步分化为血管平滑肌细胞(VSMC)和内皮细胞,从而参与血管的损伤后修复过程。并且MSC具有多向分化潜能,容易通过转基因技术获得目标基因并在体内外长期表达,且取材方便,不存在组织配型及免疫排斥问题,是基因治疗中接受目标基因的优秀载体细胞。本实验体外观察MSC与VSMC在直接接触培养下的分化情况,并以MSC为载体,通过体外细胞基因转染及筛选,获得双重稳定受到强力霉素(Dox)调控表达AT2R基因的MSC,将此受到调控表达的AT2R基因导入大鼠颈动脉球囊损伤动物模型中,观察MSC细胞移植实现AT2R基因在体可调控表达在新生内膜中形成的作用及潜在意义。研究方法:(1)密度梯度离心法及胶原酶消化法分别培养原代大鼠MSC及VSMC,细胞共培养并行免疫荧光化学染色和透射电镜观察超微结构;(2)组成受Dox调控的哺乳动物表达系统(Dox-on)的四种成分的转化、扩增及提纯并酶切鉴定;(3)采用常规分子生物学方法连续两个回合转染体外培养的MSC,并分别采用发光计检测不同细胞克隆萤光素酶活性改变以及RT-PCR方法检测AT2R目的基因mRNA表达情况,根据各个细胞克隆受Dox调控表达的程度,选择低背景、高诱导表达AT2R的细胞系,作为双重稳定MSC细胞系;蛋白免疫印迹法观察该细胞系在Dox调控下AT2R表达的时相性、持续性及在不同浓度Dox调控下的表达情况;(4)建立大鼠颈动脉球囊损伤动物模型,将双重稳定MSC在术中导入血管,分别于14 d、28 d进行病理切片,检测可调控AT2R对新生内膜增生的影响;采用RT-PCR免疫组织化学免疫荧光等技术观察AT2R基因在新生内膜中的表达以及细胞外基质(ECM)成分表达的改变,TUNEL法检测血管组织中细胞凋亡的变化情况。研究结果:(1)免疫荧光显示共培养后MSC出现SM-α-actin、calponin及CD31阳性染色,电镜下可见肌丝状结构。单独培养及VSMC条件培养液培养的MSC仅SM-α-actin表达阳性;(2)Dox-on系统由四个质粒组成:调节质粒pUHD17-1 hyg,荧光报告质粒pUHC 13-3,筛选质粒pSV2neo以及含目的基因AT2R的应答质粒pUHD10-3/AT2R,以上质粒经鉴定均与其背景资料相符合,可用于实现目的基因片段在靶细胞中可调控表达研究;(3)本实验通过连续两个回合的转染及抗生素压力筛选,经Dox诱导表达后获取出低背景、高诱导表达AT2R基因的克隆。该MSC克隆受到Dox给予/去除的紧密调控,诱导后48 h就可使AT2R明显表达,在Dox干预72 h后AT2R表达进一步增强;Dox在一定的浓度范围(10-3ng/ml～104ng/ml)内呈剂量依赖性的增加该MSC细胞系中AT2R蛋白的诱导表达量,Dox浓度在102ng/ml～103ng/ml时达到峰值,更高浓度的Dox反而降低AT2R蛋白的表达;在转染后至少8w内,该MSC细胞系中AT2R蛋白均可以在Dox 1 ug/ml干预72 h后被显着诱导表达,强度不受时间延长的影响。(4)球囊损伤后14 d～28 d,新生内膜增生显着, MSC组和MSC转染组与对照组相比新生内膜无显着差异(P>0.05),而Dox组新生内膜面积显着下降(P<0.01);(5)免疫组织化学、免疫荧光及RT-PCR检测显示,各时相点Dox组较对照组、MSC组及MSC转染组AT2R表达显着增高(P<0.01);(6)血管损伤后MMP-2、LN、FN、OPN、COL-Ⅳ均出现显着增高表达,Dox组MMP-2、LN、FN、OPN的表达水平在术后14 d及28 d时均显着低于其它各损伤组(均P<0.05),COL-Ⅳ在术后14 d时高于其它各损伤组(P<0.05),28 d时各组间无差异(P>0.05);(7)血管损伤后新生内膜中出现凋亡细胞,其中Dox组细胞凋亡率显着高于对照组、MSC组及MSC转染组(P<0.05)。研究结论:(1)与VSMC直接接触可以诱导MSC向血管成分细胞分化;(2)构建的Dox-on可调控的MSC细胞株诱导活性可靠,使外源AT2R基因的表达处于有效的主动控制下;(3)局部导入MSC不影响球囊损伤后大鼠颈动脉新生内膜增生;(4)由MSC介导的AT2R可调控表达受到Dox的良好调控,可有效抑制球囊损伤后大鼠颈动脉新生内膜增生;(5)AT2R影响血管损伤后修复时ECM成分的表达,并促进细胞凋亡的发生,可能是AT2R介导抑制新生内膜形成的机制。
李俊[3]2012年在《血管平滑肌细胞凋亡诱导产生SDF-1α促进移植物动脉硬化》文中进行了进一步梳理目的：移植物动脉硬化是以弥漫性内膜增生为特征的慢性血管增殖性疾病,也是导致远期移植器官功能丧失、限制其远期疗效的主要原因。移植物动脉中膜平滑肌细胞凋亡是器官移植后的早期事件,有研究提示移植物动脉中膜平滑肌细胞凋亡可能通过募集骨髓间充质干细胞参与移植物动脉硬化。本研究拟探讨移植物动脉中膜平滑肌细胞凋亡对移植物动脉硬化的促进作用及其分子机制。方法：原代培养大鼠血管平滑肌细胞,构建并转染携带SM-22a启动子的野生型p53基因慢病毒载体,采用DAPI细胞核染色和流式细胞术检测过表达p53对血管平滑肌细胞凋亡的诱导作用,采用Western blot和ELISA分析检测观察血管平滑肌细胞凋亡对细胞因子SDF-1a,TGF-β和PDGF-BB表达的影响。体外培养大鼠骨髓间充质干细胞,制备p53过表达血管平滑肌细胞条件培养液,采用Transwell细胞迁移分析和BrdU标记法检测血管平滑肌细胞凋亡对骨髓间充质干细胞迁移和增殖的影响；并应用选择性细胞信号阻断剂对骨髓间充质干细胞进行预处理,以探讨血管平滑肌细胞凋亡诱导骨髓间充质干细胞迁移和增殖的分子机制。建立大鼠主动脉移植模型,构建并转染携带SM-22a启动子的BclxL基因慢病毒载体,采用TUNEL分析检测移植动脉中膜平滑肌细胞凋亡情况；采用免疫组化染色检测移植动脉壁中SDF-1a的蛋白水平；采用HE和Masson染色进行组织病理学分析,探讨BclxL基因转染对移植动脉新生内膜形成的影响；并应用免疫双荧光染色探讨BclxL基因转染对骨髓间充质干细胞参与内膜增生的影响。同时,建立异系大鼠主动脉移植模型,对受体大鼠分别给予mTOR抑制剂rapamycin和MAPK/ERK抑制剂PD98059治疗,检测其对移植动脉新生内膜形成的影响,以探讨PI3K/Akt/mTOR和MAPK/ERK信号通路在移植物动脉硬化中的作用。结果：慢病毒介导p53过表达有效诱导血管平滑肌细胞凋亡,凋亡血管平滑肌细胞释放趋化因子SDF-1a,并诱导周围血管平滑肌细胞表达SDF-la,引起p53过表达血管平滑肌细胞培养液中SDF-1a水平明显升高。血管平滑肌细胞凋亡可诱导骨髓间充质干细胞的迁移和增殖,以SDF-la中和抗体可阻断该作用。Western blot分析显示血管平滑肌细胞凋亡活化骨髓间充质干细胞的PI3K/Akt/mTOR和MAPK/ERK信号通路,且该作用是由SDF-1a介导。用PI3K/Akt/mTOR抑制剂Ly294002和rapamycin或MAPK/ERK抑制剂PD98059对骨髓间充质干细胞进行预处理,可有效阻断血管平滑肌细胞凋亡诱导的骨髓间充质干细胞迁移和增殖。与同系移植相比,异系移植动脉中膜平滑肌细胞大量凋亡,SDF-1a蛋白水平明显升高,8周后异系移植动脉新生内膜形成并伴有新生内膜细胞PI3K/Akt/mTOR和MAPK/ERK信号通路的活化。慢病毒介导转染BclxL基因,在SM-22a启动子调控下目的基因选择性在移植动脉中膜平滑肌细胞高表达,使中膜平滑肌细胞凋亡明显减少,移植动脉中膜SDF-1a的表达下调及其在血清中的含量下降；并且,伴随早期移植动脉中膜平滑肌细胞凋亡抑制,8周后异系移植动脉新生内膜中CD90和CD105双阳性细胞的数量明显减少,且血管新生内膜面积和管腔狭窄程度均显着减少。同样,rapamycin和PD98059均能有效减少骨髓间充质干细胞募集至新生内膜以及移植动脉硬化。结论：移植动脉中膜平滑肌细胞凋亡通过产生SDF-1a募集骨髓间充质干细胞,从而在移植物动脉硬化的发生发展中发挥关键作用。PI3K/Akt/mTOR和MAPK/ERK信号传导通路活化是血管平滑肌细胞凋亡诱导骨髓间充质干细胞迁移和增殖的分子机制。以血管平滑肌细胞凋亡为干预靶点将是防治移植物动脉硬化的一个有效策略。
胡海洋[4]2009年在《平滑肌祖细胞参与哮喘气道重塑的探索性研究》文中研究指明支气管哮喘是呼吸系疾病中常见病和多发病之一。近20年来,全世界支气管哮喘的患病率和死亡率均呈逐渐上升趋势,这已经引起全球的广泛重视。既往支气管哮喘的研究过多地关注哮喘炎症反应的控制,然而对气道重塑及气道平滑肌的作用研究相对很少。由于哮喘的发病机制异常复杂,所以炎症的控制也异常困难,这方面的研究已经多年没有突破性进展。所以很多学者开始不断地调整哮喘研究主攻方向,寻找新的研究领域,哮喘气道重塑正是在这样的背景下开始引起学者的广泛关注,并逐渐成为支气管哮喘研究的热点之一。气道重塑作为慢性哮喘的核心病理改变,是影响慢性哮喘患者生活质量和劳动能力的最重要因素,它主要导致气流阻塞的可逆性减小,呼气期为主的通气功能障碍加重,肺内残气量增加,进而导致不同程度的阻塞性肺气肿,甚至肺源性心脏病。如果能有效地控制气道重塑就可以最大限度地保护患者的肺功能,但是由于长期以来对其重视不足,导致具体体制至今不明,而且始终缺乏有效的治疗手段,所以控制气道重塑已经成为哮喘预防和治疗的当务之急。慢性哮喘气道重塑是全气道复杂改变的复合体,包括哮喘患者气道不同于正常气道的全部组织学改变,主要有气道平滑肌增生及肥大、细胞外基质沉积、上皮下纤维化、管腔狭窄、黏膜肥厚、气管壁增厚、炎症细胞浸润等。气道平滑肌是气道重塑过程中核心的病理改变,气道重塑的主要变化都是围绕着气道平滑肌细胞展开的。学者已经认识到哮喘的治疗离不开气道平滑肌的治疗,所以针对气道平滑肌的治疗也已经成为哮喘治疗的重要突破口。平滑肌祖细胞是近年来血管重构领域研究的重大发现。传统的观念曾认为在血管损伤部位的平滑肌细胞,是由受损部位的中膜迁移到新生内膜的。但是现在的观点认为血管损伤部位的平滑肌细胞更有可能或至少有相当一部分来源于其外周血中的前体细胞--平滑肌祖细胞(SPCs)。目前平滑肌祖细胞的研究工作还是处于起步阶段。现有研究认为SPCs作为平滑肌细胞的前体细胞可能是一种或者一大类细胞;最有可能的来源就是骨髓中的多功能干细胞;现今仍未能找到SPC区别于其他细胞的特异性分子标记;因为SPCs同时具有平滑肌细胞和干细胞部分特征,所以目前研究SPC所使用的细胞标记大多都是干细胞、内皮祖细胞、平滑肌细胞的标记物。平滑肌祖细胞与慢性哮喘气道重塑之间的关系尚未见文献报道,但是平滑肌祖细胞在血管重构中所发挥的作用已经给我们一个全新的启示。因为在既往哮喘研究中很多学者都发现气道平滑肌细胞存在独特的迁移、肥大和增殖等现象,但对其具体机制不甚清楚;再有在哮喘相关研究中还发现①哮喘动物外周血和肺组织中的CD34+细胞出现增加;②PDGF-BB参与哮喘气道重塑的相关机制的调控,但是学者并没有对这两个现象产生的机制及意义给出非常令人信服的答案。然而PDGF-BB和CD34+均与平滑肌祖细胞密切相关,前者与平滑肌祖细胞的分化诱导相关,后者是平滑肌祖细胞的重要特征标志之一。将上述信息整合后,我们就自然联想到平滑肌祖细胞存在参与哮喘致病过程中的可能性,即平滑肌祖细胞在特定哮喘炎性因子的作用下出现趋化、定植和分化,并参与了慢性哮喘的气道重塑。为求证上面的假说我们设计了本研究课题,首先通过对比检测哮喘大鼠与正常大鼠在外周血单个核细胞中平滑肌祖细胞含量上的差别,初步分析平滑肌祖细胞含量变化与哮喘状态的是否有潜在联系;再利用性别差异Y染色体的特征基因—SRY(sex-determining region on the Y chromosome)作为外源平滑肌祖细胞示踪标记物,通过原位杂交检测SRY基因表达的方法观察雄性大鼠来源SPCs在雌性哮喘大鼠气道平滑肌层内定植和分化情况,判断SPCs是否参与了哮喘气道重塑;最后再通过使用可能影响SPCs作用的药物西司莫罗,观察药物作用后SPCs在哮喘气道重塑中作用的变化。力求阐明慢性哮喘大鼠外周血中的平滑肌祖细胞可以参与慢性哮喘的气道重塑;来源于SPCs的平滑肌细胞在气道重塑中占有重要比例;抑制平滑肌祖细胞分化、增殖可以明显改善哮喘的气道重塑,为今后慢性哮喘气道重塑的预防和治疗开拓了新的领域。第一部分OVA雾化吸入对哮喘大鼠的外周血中平滑肌祖细胞含量的影响目的:研究OVA雾化吸入对哮喘大鼠的外周血中平滑肌祖细胞含量的影响方法:OVA致敏、雾化激发制作哮喘大鼠模型,常规观察、HE染色和肺泡灌洗液细胞计数鉴定评价模型哮喘模型;取正常大鼠和哮喘大鼠的外周血,Ficoll法分离外周血单个核细胞,通过流式细胞仪检测其中SM-MHC和CD34阳性的表达情况,以此了解外周血单个核细胞中平滑肌祖细胞含量。结果:哮喘组大鼠支气管肺泡灌洗液中巨噬细胞、淋巴细胞、中性粒细胞和嗜酸性细胞数量分别为(1.34±0.06)×10~6、(0.54±0.07)×10~6、(3.20±0.79)×10~6和(5.85±0.86)×10~6肤,均明显高于正常对照组大鼠肺泡灌洗液相应细胞含量(0.96±0.11)×10~6、(0.04±0.02)×10~6、(0.43±0.16)×10~6和(0.21±0.11)×10~6;哮喘组大鼠外周血单个核细胞中CD34+为1.10±0.17%,MHC+为12.02±1.80%,CD34/MHC均阳性的比例为0.95±0.09%,亦明显高于对照组的比例:0.22±0.07%、1.65±0.11%和0.21±0.05%(P <0.05)。结论:哮喘组大鼠的外周血单个核细胞中平滑肌祖细胞含量要高于正常对照组大鼠。在哮喘状态下平滑肌祖细胞可能受到特定炎性因子刺激后,数量上升并参与到哮喘的致病过程中。第二部分大鼠骨髓间充质干细胞分离、鉴定和平滑肌祖细胞鉴定目的:分离大鼠骨髓间充质干细胞并诱导其分化为平滑肌祖细胞方法:取正常雄性Wistar大鼠四肢长骨,无菌状态用无血清培养基冲洗骨髓腔,取骨髓细胞悬液接种至培养瓶内,使用全贴壁法培养骨髓间充质干细胞,培养传代鉴定;观察细胞的生长状态,流式仪检测其细胞表型特点;观察其在体外条件下分化为成骨和脂肪细胞的能力。再取P4骨髓间充质干细胞用含PDGF-BB的培养液中诱导2周,检测其中α-SMA和CD34阳性的表达情况,了解其分化为平滑肌祖细胞情况。结果:全骨髓贴壁法培养骨髓间充质干细胞是一种确实可行的办法,培养获得的骨髓间充质干细胞符合MSC的典型特点。在体外条件下,骨髓间充质干细胞可分化为成骨和脂肪细胞。骨髓间充质干细胞在含PDGF-BB的培养液作用下,细胞性质发生明显地改变,可以同时具有干细胞和平滑肌细胞的特点,CD34阳性上升至32%,α-SMA表达阳性率为62%。结论:体外培养的骨髓间充质干细胞可以在被诱导分化为平滑肌祖细胞,可以作为研究平滑肌祖细胞的重要工具。第叁部分平滑肌祖细胞在慢性哮喘气道重塑中的作用目的:观察平滑肌祖细胞在慢性哮喘气道重塑中的作用方法:采用正常雌性Wistar大鼠复制慢性哮喘气道模型,在哮喘模型雾化激发的第4周开始将雄性来源的平滑肌祖细胞(10~6个)经鼠尾静脉注射入,每周1次,连续4周。第12周分别取动物的气道组织标本制作切片,并同时分离气管进行气道平滑肌细胞进行原代培养,通过原位杂交检测SRY阳性细胞气道组织标本制作切片中表达情况;再通过原位杂交检测SRY阳性细胞在纯化后的气道平滑肌细胞中表达情况;观察平滑肌祖细胞在慢性哮喘气道重塑中的定位和分化情况。结果:雌性哮喘大鼠在尾静脉注射雄性来源的SPCs后平滑气道平滑肌层出现表达SRY阳性的平滑肌细胞,而雌性正常对照组动物的气道中未见SRY阳性平滑肌细胞定植;在分离培养的同组动物气道平滑肌细胞中也发现SRY阳性的平滑肌细胞。结论:平滑肌祖细胞在慢性哮喘病程中可以定植到气道并分化为气道平滑肌参与哮喘的气道重塑。第四部分西罗莫司对哮喘气道重塑中平滑肌祖细胞作用的影响目的:观察西罗莫司对哮喘气道重塑中平滑肌祖细胞作用的影响方法:将SPC分别放在DM、0.1ng/ml、1 ng/ml、10 ng/ml和100 ng/ml不同药物浓度的培养基中作用48小时后,通过观察MTT吸光度值和计数变化,了解西罗莫司对平滑肌祖细胞增殖的影响。在含PDGF-BB的培养液中加入不同浓度的西罗莫司(对照组、0.1ng/ml和1 ng/ml),分别对MSC作用10天后,观察α-SMA阳性表达情况,了解西罗莫司对平滑肌祖细胞分化的影响。取正常雌性Wistar大鼠复制慢性哮喘气道模型,在模型制作的过程中将完成诱导的雄性来源的平滑肌祖细胞经鼠尾静脉注射入,在模型制作的后4周每天雾化激发后予以西罗莫司雾化吸入治疗,于12周分别取动物的气道组织标本制作切片,通过原位杂交检测SRY阳性细胞表达情况,观察西罗莫司雾化吸入治疗对平滑肌祖细胞在慢性哮喘气道重塑中作用的影响。结果:西罗莫司不同药物浓度组在作用48小时后,细胞计数和MTT法检测吸光度值也明显低于对照组,DM、0.1ng/ml、1ng/ml、10ng/ml和100ng/ml各药物浓度组中作用48小时后,各药物浓度组细胞的吸光度值分别为0.75±0.06、0.44±0.04、0.33±0.02、0.20±0.01和0.18±0.01(P <0.05)。西罗莫司不同药物浓度组(对照组、0.1ng/ml和1ng/ml)在作用10天后,细胞的α-SMA阳性表达率分别为71%、24%和4%(P <0.05)。OVA哮喘组和西罗莫司哮喘治疗组的气道平滑肌层中均出现SRY阳性表达的细胞,但西罗莫司治疗哮喘组大鼠气道组织中SRY阳性细胞数量要明显少于OVA哮喘组,PBS雾化对照组大鼠气道内未见SRY阳性细胞表达。结论:西罗莫司可以显着抑制平滑肌祖细胞的分化和增殖,其抑制作用与药物浓度及作用时间存在相关性;西罗莫司雾化吸入可以通过抑制平滑肌祖细胞的作用,改善慢性哮喘的气道重塑,为哮喘气道重塑的治疗开辟新的靶点。
陈建军[5]2011年在《骨髓间充质干细胞过表达MIR126移植通过AKT/ERK相关途径促进缺血心肌血管新生》文中提出研究背景目前,缺血性心肌病是人类死亡和致残的主要疾病之一。由于冠脉的狭窄和闭塞导致组织缺血和缺氧,伴随心绞痛、心梗、心律失常及心衰等症状,当心功能恶化到Ⅳ级时,1年死亡率可达60%。在过去几十年里,药物治疗、经皮冠状动脉腔内成形+支架术、冠状动脉搭桥术及心脏移植等已经显着改善了缺血性心肌病患者的预后。尽管这些治疗措施已经取得了很大的进步,但仍存在许多限制,因此,很多学者致力于干细胞移植的研究。心肌梗死的修复过程中常看到冠脉侧支循环的形成,侧支循环能够改善缺血心肌灌注,减少心肌坏死,恢复“冬眠”心肌细胞的活性,从而减少心功能障碍的发生。然而机体自身生成的新生血管往往不足以代偿冠脉闭塞诱发的心肌缺血。因此,刺激缺血区小血管生长,促进侧支循环的形成,完成缺血区血管的自我搭桥便成了十分诱人且似乎直观合理的治疗方法。近年来,随着对血管新生和血管生长因子研究的不断深入,治疗性血管新生已成为治疗缺血性心脏病的新方法。目前有关MSCs移植治疗心肌梗死的动物实验表明,MSCs植入损伤部位后可长期存活,并分化为具有心肌细胞特征的类心肌细胞,促进“血管新生”,改善血液动力学。但仍然存在着大量有待解决的问题。例如如何增加移植后的干细胞存活率；改善梗死区的微环境,增加迁移或归巢到梗死区干细胞的数量等。近来,对于miRNAs调控干细胞的发生发展、自我更新、分化、抗凋亡及炎症和血管新生等一系列生物过程知识的积累,有学者认为miRNAs可以作为干细胞移植治疗缺血性心肌病研究的一个新的切入点。MiRNA126是血管内皮上的特殊的MiRNA,它在心梗后的血管发生和维持血管的完整性起着重要作用。MiRNA126可通过细胞分裂素活化蛋白酶发信号给VEGF与FGF来起作用。Spred-1和PIK3R2/p85-b是对Ras/细胞分裂素活化蛋白酶的抑制因子,可被MiRNA126抑制,而Spred-1和PIK3R2/p85-b可能抑制ERKAKT途径从而抑制血管生成。因此,上调MiRNA126可减轻Spred-1和PIK3R2/p85-b对VEGF及FGF的抑制作用,有利于血管发生。我们推测MiRNA126通过对干细胞的调节可能为干细胞移植治疗缺血性心脏病开辟一条新途径。第一部分小鼠骨髓间充质干细胞的体外培养、诱导及鉴定研究目的建立小鼠骨髓间充质干细胞(MSCs)的分离、培养方法,研究其在体外生长增殖的生物学特性及表型特征.研究方法应用60%的Percoll细胞分离液分离骨髓间质干细胞,接着进行培养和传代。应用MTT方法测定培养细胞的生长曲线,应用流式细胞仪测定细胞周期和鉴定培养细胞的纯度,同时成骨诱导分化及成脂诱导分化鉴定骨髓间质干细胞实验结果原代培养的BMSCs24小时内贴壁并伸展成多角形、梭形,前3天为相对抑制期,其后细胞增殖速度逐渐加快,呈对数形式,7天左右至平台期,细胞覆盖率达90%左右,约在2周内传至第3代时可到106个数量级细胞,能够满足细胞移植数量的需要,应用流式细胞仪检测BMSCs的标志,显示CD29, CD44阳性,而CD34, CD45阴性,符合BMSCs特征。实验结论本课题应用60%Percoll细胞分离液成功地分离和培养出较为均一的骨髓间质干细胞。骨髓间质干细胞体外培养生长稳定,传代后细胞生长较快,适应能力较强,细胞大多数处于静止期,增殖潜力巨大。第二部分MiR126转染小鼠骨髓间充质干细胞研究目的：1构建miR-126的慢病毒表达载体,包装生产重组慢病毒,并进行慢病毒滴度、活性测定。2包装生产重组慢病毒,慢病毒滴度、活性测定研究方法我们利用Gateway clone构建pDown-miR126及pLV.EX3d.P/puro-TRE> miRl26>IRES/eGFP。制备编码了慢病毒颗粒的重组病毒质粒及其pLV/helper-SL3, pLV/helper-SL4, pLV/helper-SL5辅助包装原件载体质粒,叁种质粒载体分别进行高纯度无内毒素抽提,重组质粒DNA进行去内毒素质粒提取后,与包装系统质粒混合物按Invitrogen公司Lipofectamine2000使用说明进行共转染293TN细胞,然后进行慢病毒的包装,包装完成之后进行重组慢病毒滴度检测。实验结果：(1)成功构建miR-126的慢病毒表达载体。(2)成功进行了LV-miR-126重组病毒的生产和滴度测定。(3)慢病毒感染293TN细胞后,能够大大增强目的基因的表达。实验结论：通过慢病毒途径可以有效增强miR-126在宿主细胞中的表达第叁部分观察MiRNA126对ERKAKT调控作用研究目的：在MSCs中过表达miRNA126以观察其对ERKAKT的影响及体外诱导骨髓间充质干细胞分化为血管内皮细胞。研究方法：总RNA提取是根据All-in-One miRNA qRT-PCR Detection Kit生产厂家的说明进行,miR126的表达行quantitative real-time RT-PCR检测,测试miRNA以U6作为单拷贝基因对照。阴性对照组及控制组相比在过表达miRNA126的MSCs中ERKAKT的表达行Westernblot检测。在第3代,过表达miR-126骨髓间充质干细胞与骨髓间充质干细胞分别按1×109/L密度接种,加入含血管内皮细胞生长因子、碱性成纤维细胞因子的DMEM培养基向血管内皮细胞诱导分化,ECMatrixTM凝胶体外血管新生实验观察血管新生情况。实验结果：在过表达miRNA126的MSCs中ERKAKT表达明显增加及过表达miRNA126的MSCs中毛细血管密度明显增加。实验结论：在MSCs中过表达MiRNA126对ERKAKT具有调控作用,能促进干细胞分化为血管内皮细胞。第四部分骨髓间充质干细胞过表达MIR126移植通过AKT/ERK途径促血管新生及改善心脏功能研究目的：比较骨髓间充质干细胞过表达MIR126移植与单纯BM-MSCs移植在小鼠心梗模型中的促血管新生作用及其机制。研究方法：通过结扎C57小鼠冠状动脉前降支制备心肌梗死模型,C57小鼠随机分为3组：MIR126-MSC组(即过表达MIR126的MSCs移植,n=15),MSC组(单纯的MSCs移植,n=15)以及PBS对照组(注射PBS, n=15)。在术后14天,进行细胞移植。实验组每只C57小鼠接受总计5×106(0.1m1)个过表达MIR126骨髓间充质干细胞或MSCs,分成6个点注入C57小鼠缺血心肌；对照组注入同等体积的无菌PBS。6周后行组织学及超声检查。实验结果：细胞移植6周后,MSC组和MIR126-MSC组缺血肌肉组织的血管新生均明显增强,以MIR126-MSC组的毛细血管密度最高(P<0.01)。Western-blot结果显示,MSC组和MIR126-MSC组缺血肌肉组织中ERK1, AKT蛋白表达均明显高于PBS对照组,以MIR126-MSC组的表达量最高(P<0.05)。细胞移植6周后,组MiRNA126-MSCs组、BMSCs组心功能都较移植前有明显改善(p<0.05),而其中MiRNA126-MSCs细胞移植组EF、FS改善程度要明显好于单纯细胞移植组(P<0.05)。实验结论：与单纯的MSC细胞移植疗法相比,过表达MIR126骨髓间充质干细胞移植具有更强的促进血管新生和侧枝血管形成的能力。我们推测过表达MIR126骨髓间充质干细胞移植通过ERK/AKT途径改善心功能,MIR126可能为干细胞移植治疗缺血性心脏病开辟一条新途径。
邹思力[6]2013年在《骨髓来源细胞在主动脉瘤和夹层发病及组织修复中的作用》文中指出研究目的主动脉壁持续性暴露于生物学及血流动力学的各种刺激中,这些刺激可能导致血管损伤。主动脉壁的自身修复不良可能促进主动脉瘤或夹层(aortic aneurysm and dissection, AAD)的发病。人们目前对AAD中自发的血管修复过程所知甚少。骨髓来源细胞(bone marrow-derived cell, BMDC)能迁移到受损的组织,起到组织修复作用。AKT信号通路是生物体内具有多种重要功能的信号通路,参与多利细胞功能的调控,如细胞代谢、细胞存活、细胞增殖、细胞迁移等,并且在心血管系统的发育和功能维护中发挥重要作用。研究报道AKT2在AAD的发病中起到保护作用,AKT2信号通路受损将增加AAD的易感性。本课题试图通过检测小鼠AAD模型中BMDC的募集、分化潜能以及生长因子的产生,发现和探讨BMDC在AAD发病和组织修复中的作用。为进一步研究其作用机制,我们选择AKT2为研究对象,通过动物实验和体外细胞实验,来探讨AKT信号通路在调节BMDC参与AAD发病及组织修复中作用。研究方法给野生型C57BL/6小鼠喂食高脂饲料(AAD模型组；n=20)或正常饲料(对照组；n=8),4周后给与致死剂量照射。提取绿色荧光蛋白(green fluorescent protein, GFP)转基因小鼠的骨髓细胞,移植给经过照射的小鼠。移植后4周,通过皮下植入微泵,分别给与AAD模型组和对照组小鼠血管紧张素II或生理盐水。植入微泵4周后收取两组小鼠主动脉。通过免疫荧光染色观察BMDCs的募集、分化潜能以及生长因子的产生。为研究AKT2在调节BMDC参与AAD发病及组织修复中的作用,将Akt2基因敲除纯合子(Akt2-/-)小鼠与GFP转基因小鼠杂交,并让其后代继续杂交,经聚合酶链反应(polymerase chain reaction, PCR)基因型鉴定获得Akt-/-GFP转基因小鼠,用同前方法构建小鼠AAD模型,并做GFP+骨髓移植,以标记BMDC。受体均为C57BL/6野生型小鼠,供体骨髓分别来自于GFP转基因小鼠(WW组；n=14)和Akt2-/-GFP转基因小鼠(WA组；n=14)。通过主动脉形态学测量和组织切片,比较WW和WA两组小鼠AAD的发病率,明确AKT2是否参与调节BMDC在AAD发病及组织修复中的作用。通过组织化学染色明确WW和WA组的主动脉形态、组织结构有无明显区别。通过免疫荧光双标技术检测主动脉周围细胞的GFP与一系列细胞表面标记物的共表达,比较WW和WA两组中迁移到主动脉壁的BMDC的细胞类型、数量是否有区别,以揭示AKT2是否通过调节BMDC的分化或主动脉壁细胞构成来影响AAD发病。分离并原代培养小鼠主动脉血管平滑肌细胞(vascular smooth muscle cell, VSMC)和GFP转基因小鼠的或Akt2-/-GFP转基因小鼠的骨髓间充质干细胞(mesenchymal stem cell, MSC),在体外分别共培养VSMC和这两种MSC (WT MSC或Akt2-/-MSC),并建立VSMC的氧化应激模型,用蛋白质免疫印迹(western blotting, WB)检测两种MSC及与之分别共培养的VSMC中的Wnt信号通路相关分子Wnt5和P-catenin,用体外细胞学实验探讨AKT2调节BMDC参与AAD发病及组织修复中的分子机制。通过免疫荧光双标技术、免疫印迹技术、实时定量PCR等方法,研究AAD患者主动脉组织中Notch信号通路相关分子的表达水平,了解Notch信号通路在AAD的发病及组织修复中是否有潜在的作用。结果骨髓移植后导致AAD模型组和对照组各有1只小鼠死于移植失败,其余小鼠均获得移植成功,GFP+细胞取代了受体的全部骨髓细胞。AAD模型组小鼠中37%(11/19)发生了AAD,并且在该组小鼠中,募集到主动脉壁的BMDC明显多于对照组,以AAD发病的区域更为显着。虽然在AMD模型组小鼠的主动脉中未能检测到BMDC分化为平滑肌细胞,但我们检测到了大量的骨髓来源的Sca-1+干/始祖细胞,NG2+的周细胞,FSP-1+的成纤维细胞以及CD68+的巨噬细胞。此外,在AAD模型组小鼠主动脉中,我们检测到了Sca-1+BMDC分别与NG2, FSP-1,或CD68共表达,提示Sca-1+BMDC可分化为周细胞,成纤维细胞以及巨噬细胞。而且,包括骨髓来源的Sca-1+干/始祖细胞在内的BMDC能够产生多种血管生长因子,如胰岛素样生长因子(insulin-like growth factor, IGF),血小板源性生长因子(platelet-derived growth factor, PDGF),以及血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor, VEGF)。我们成功杂交获得了Akt2-/-GFP转基因小鼠,并提取其骨髓细胞作为WA组的供体移植物。移植了Akt2-/-骨髓细胞的WA组小鼠AAD发病率明显高于移植了正常骨髓细胞的WW组(64%vs.0%),且WA组未发病的小鼠主动脉中膜变薄,发生AAD的小鼠主动脉中层厚薄不均,弹力蛋白排列紊乱、断裂或变平直。免疫荧光结果显示WA组迁移至主动脉的BMDC少于WW组,且主动脉壁的细胞构成发生改变：WA组主动脉中NG2+周细胞、FSP-1+成纤维细胞所占比例少于WW组,CD68+巨噬细胞所占比例多于WW组,且WA组主动脉中NG2+BMDC少于WW组,原位的FSP-1+成纤维细胞少于WW组,CD68+巨噬细胞在BMDC中的比例高于WW组。另外,WA组主动脉中膜凋亡细胞多于WW组。体外细胞学实验发现,与Akt2-/-MSC共培养的VSMC凋亡多于与WT MSC共培养的VSMC,且不论是否存在氧化应激,Akt2-/-MSC产生Wnt5少于WT MSC,与Akt2-/-MSC共培养的VSMC中β-catenin少于与WT MSC共培养的VSMC。提示MSC中的AKT2能够通过Wnt-β-catenin信号通路影响VSMC的凋亡。通过对AAD患者主动脉样本的研究,我们发现在AAD患者主动脉中膜的VSMC中,Notch信号通路是下调的,而在CD34+及Stro-1+干/始祖细胞、成纤维细胞以及巨噬细胞中则是上调的。结论在AAD中,主动脉损伤能够诱导BMDC迁移至主动脉,并分化为巨噬细胞、周细胞或成纤维细胞,参与主动脉的炎症、修复及重塑过程,并能分泌各种生长因子,为组织修复创造良好的微环境。BMDC中的AKT2能影响主动脉壁的细胞构成比例,BMDC中的AKT2缺陷能使主动脉周围周细胞及成纤维细胞比例下降,巨噬细胞比例升高,并能通过Wnt-β-catenin信号通路影响VSMC的凋亡。可见AKT2在调节BMDC参与AAD发病及组织修复中发挥重要作用,有望成为治疗AAD的新的分子靶点。另外,Notch信号通路在AAD患者的主动脉中有改变,提示Notch信号通路在TAAD的主动脉炎症损伤及损伤后修复、组织重构中起到重要作用。
杜振宗[7]2006年在《骨髓间充质干细胞构建小口径组织工程化血管的实验研究》文中指出第一部分 成人骨髓间充质干细胞的分离和鉴定 目的 本实验拟通过体外细胞培养的方法，将间充质干细胞自骨髓血中分离出来，并加以纯化、鉴定，进一步在体外的培养条件下研究其增殖及生长的特性，从而探讨为组织工程化血管研究提供种子细胞的可能性。 方法 收集成人骨髓血，采用密度梯度离心和贴壁生长的方式，提取单个核细胞进行体外培养；收集第2～3代(P_2～P_3)细胞行流式细胞仪检测细胞抗原表达(CD34、CD45、CD11a，CD14、KDR、CD105、HLADR)；采用细胞计数的方法，绘制原代培养和传代培养细胞的生长曲线。 结果 通过密度梯度离心和贴壁生长的方法，可以获取具有一定形态特点、贴壁生长、增殖活跃的骨髓间充质干细胞；该细胞表达KDR、CD105，但不表达CD34、CD45、CD11a，CD14、HLADR等；原代培养曲线显示，第2～6d为生长潜伏期，第7～8d开始，贴壁细胞已形成大小不一的多个细胞克隆，第8～10d进入对数增长期；第12～14d进入个平台期；传代培养的细胞多于P_(10)后开始出现衰老的现象，传代培养的潜伏期为24～48h，传代培养的对数增长期为4～6d，接种后8～9d，细胞的增殖、生长逐渐缓慢，进入平台期。 结论 1．利用密度梯度离心和贴壁的方法可以获取较高纯度的BMMSCs；2．该BMMSCs具有大量增殖的功能，可满足组织工程种子细胞的需要；3．BMMSCs表达CD105、KDR，不表达HLA-DR、CD34、CD45、CD11a、CD14。 第二部 分骨髓间充质干细胞定向诱导为血管平滑肌样细胞、内皮样 细胞的实验研究 目的 本实验通过诱导动物骨髓间充质干细胞向血管平滑肌样细胞和血管内皮样细胞分化，通过形态学和相关抗原的鉴定，探讨其作为血管壁种子细胞的可行性。
王冰[8]2009年在《芪丹通脉片干预VEGF的内皮双向作用的机制研究》文中研究说明一、研究背景与目的血管内皮生长因子(VEGF,VEGFA)是促血管新生的关键而有力的调节因子之一。作为一种旁分泌蛋白质,VEGF具有抗内皮细胞凋亡、促内皮细胞有丝分裂和提高血管通透性等作用,是影响血管内环境稳态的重要分子。目前,人们对VEGF生物学作用的双面之争已成热点。一方面,无论在体内还是在体外,VEGF都是内皮细胞的一个促存活因子。缺血、缺氧均可诱导VEGF的表达和分泌。低氧可提高局部组织旁分泌VEGF,并作用在内皮细胞的VEGF受体上,刺激新血管的形成,以适应性调节局部血氧的供应。但是在另一方面,在冠心病、肿瘤、中风、糖尿病等许多疾病状态下,这一适应性调节会发生紊乱,VEGF的“保护性角色”反而转变成主要的致病性病理性因素。在针对这一争论的讨论中,人们逐渐发现,越来越多的依据提示VEGF量的改变与其不同的生物学效应关系密切。已知,血管内皮生长因子受体2(VEGFR2,Flk-1/KDR)是VEGF发挥内皮相关生物学效应的主要受体之一,VEGF激活作用下的KDR表达和胞内转运,调控着内皮细胞对新生血管信号的敏感性,以及下游分子的信号传导。传统中医药具有趋利避害性调节和维护机体的稳态平衡的优势。研究发现,益气活血类中药对VEGF表达和分泌有双面干预作用。一方面,益气活血中药通过下调VEGF分泌和表达而抑制肿瘤血管生成及血管内皮细胞的增生,减少组织的血供,抑制肿瘤的生长、转移及对机体有害的病理发展;另一方面,益气活血中药通过上调VEGF分泌和表达促进血管新生及血管内皮细胞的修复,在治疗缺血类疾病中独具特色。既往实验发现,芪丹通脉片(QDTMT)具有内皮细胞保护作用,可提高心肌缺血大鼠心室内VEGF表达,增加缺血区的微血管密度(MVD)。但是,在缺氧状态下,QDTMT是否对内源性VEGF分泌和表达水平存在双向调节,是否对其受体KDR也有调节作用尚属未知。以往关于活血化瘀中药影响VEGF的实验研究报道,基本上都设计在急性缺氧期,而有关VEGF影响血管增生的实验研究大多设计在疾病的病理改变形成后,后者需要的实验观察时间较长。因此,要进一步明确益气活血化瘀复方中药制剂干预VEGF不同生物效应的具体作用机制,还需要对疾病不同时段进行动态观察。为此,本研究在动物实验部分选用了便于动态观察的低压氧舱性大鼠缺氧模型。经QDTMT药物干预后,我们选择不同时间点动态测量了大鼠血清中的VEGF浓度变化,并相应观察了与本实验相关性较强的大鼠心、肝、肺多个组织内血管的病理形态改变。因为接近药物在体内作用的真实过程,血清药理学研究方法近些年发展迅速,本实验在设计中对此部分内容也有所借鉴。在制备了QDTMT含药血清后,为进一步探讨QDTMT的KDR相关分子机制,本实验还加入了体外细胞实验内容。通过培养并鉴定脐静脉内皮细胞(HUVECs),观察了QDTMT含药血清对低氧条件下的内皮细胞一般形态,超微结构和细胞活性的影响,并对细胞内KDR的表达变化进行了一定的观察。该实验从一定程度上证实了VEGF量的变化与其不同生物效应间的相关性,为QDTMT血管保护作用的分子机制提供了实验依据,丰富了中医传统理论中益气活血法有关的现代医学的科学内涵。二、芪丹通脉片对缺氧大鼠血管内皮生长因子的双向调节作用1研究方法和内容1.1动物模型的建立与评估健康雄性SD大鼠18只,置于全自动调节低压低氧舱,6h/d进行缺氧造模。除观察动物一般情况变化外,另取肺组织标本,HE染色观察肺组织内血管增生情况,对模型进行评估。1.2 QDTMT对缺氧大鼠VEGF的双向调节及血管保护作用健康雄性SD大鼠(n=30)随机分为正常对照组、低氧+QDTMT组(QDTMT组)、低氧+生理盐水组(生理盐水对照组)。动物造模方法同上,并分别在7d、14d两个时间点进行以下内容实验观察。1)动物麻醉后,从腹主动脉取血后分离血清,800rpm离心25min,分离血清,-70℃存放。使用前经56℃、30min灭活,0.22μm滤膜灭菌,-20℃保存备用。按ELISA试剂盒说明进行血清VEGF测定。2)取大鼠肺、心、肝组织,经4%多聚甲醛固定24h后,梯度乙醇脱水,石蜡包埋,HE染色,光镜下观察组织病理学改变。另取材3mm3大小肝组织块,经戊二醛固定后,透射电镜观察其超微结构改变。3) VEGF免疫荧光染色无菌条件下取胸主动脉组织,经4%多聚甲醛固定后,常规石蜡制片。按常规操作顺序进行免疫荧光染色。2实验结果2.1 ELISA结果:缺氧7d大鼠血清中VEGF浓度较缺氧前增加,缺氧14d大鼠血清中VEGF浓度进一步急剧增加,组间比较有统计学意义。缺氧7d,QDTMT组大鼠血清中的VEGF含量明显高于正常对照组和生理盐水对照组;而缺氧14d后,QDTMT组大鼠血清中VEGF含量低于生理盐水对照组,组间比较有统计学差异(P<0.05)。2.2形态学观察结果:光镜下可见,缺氧7d大鼠肺内血管结构改变不明显;缺氧14d大鼠肺组织血管增生明显。QDTMT组大鼠肺、心、肝组织血管增生性改变较生理盐水对照组轻。肝组织电镜结果提示,QDTMT组超微结构损伤较生理盐水对照组轻。而且,在QDTMT组大鼠肝组织内观察到VEGFR2相关的内体样超微结构。2.3 VEGF免疫荧光染色结果提示,缺氧7d,叁组大鼠主动脉内层VEGF表达变化不大;缺氧14d,生理盐水对照组大鼠主动脉内观察到大量VEGF阳性表达,与ELISA结果相一致。3结论与提示3.1低压氧舱性缺氧模型下,大鼠血清中的VEGF浓度在不同病理阶段有所变化。3.2 QDTMT对VEGF分泌呈双向动态调节作用,可能是其血管保护作用主要机制之一。叁、芪丹通脉片对缺氧脐静脉血管内皮细胞保护作用研究1研究方法和内容1.1体外培养人脐静脉血管内皮细胞(HUVECs)及鉴定参照文献记载的细胞培养方法,从人脐静脉分离内皮细胞进行原代及传代培养。利用显微镜和免疫荧光染色技术,从形态学和Ⅷ因子膜抗原鉴定培养的内皮细胞。1.2 QDTMT含药血清对缺氧HUVECs增殖、凋亡的影响1.2.1制备QDTMT含药血清成年雄性SD大鼠18只,分组及处理同动物实验部分内容。大鼠缺氧造模后,经腹主动脉取血并分离血清,存放于-70℃备用。参照文献及预实验比较,确定最佳含药血清浓度为10%后,用含100ml/L胎牛血清的M199培养基将3种血清的浓度均配制为10%。1.2.2 MTT法检测细胞活性选择生长状态良好的3-5代HUVECs,用含100ml/L胎牛血清的M199培养24h,再用无血清M199继续培养6h。将细胞分为A、B、C3份:(1)A份,加入10%空白对照组大鼠血清;(2)B份,加入10%生理盐水对照组大鼠血清;(3)C份,加入10%QDTMT组大鼠血清。除A份细胞在CO2培养箱正常培养24h外,其余两份细胞放入叁相气体培养箱中,在37℃、5%CO2以及2%O2浓度条件下培养24h。MTT法常规操作,检测叁份细胞的活性。1.2.3流式细胞术检测细胞凋亡细胞分组及处理同上,流式细胞仪常规操作测量细胞凋亡率。1.3 VEGFR2免疫荧光染色同上处理细胞后,使用常规免疫荧光技术,观察叁份细胞中VEGFR2的表达情况。1.4细胞超微结构观察细胞同上处理,经离心、收集后,戊二醛固定,制备电镜标本。透射电镜下观察叁份细胞超微结构。2实验结果2.1细胞鉴定及超微结构观察:在倒置显微镜下可见,培养的内皮细胞呈典型铺路石子状排列生长。免疫荧光鉴定结果提示,培养的内皮细胞胞浆呈Ⅷ因子阳性表达。透射电镜观察其超微结构,可见内皮细胞特有的短棒状细胞器Weible-Palade小体。2.2 QDTMT含药血清对缺氧HUVECs的影响1) MTT结果提示,与A份细胞相比,缺氧使B份和C份细胞增殖受到抑制;与B份相比,QDTMT含药血清干预后的C份内皮细胞增殖明显,组间比较有统计学差异(P<0.05)。2)流式细胞术检测结果提示,缺氧使B、C两份细胞的凋亡率较A份细胞凋亡率增高;QDTMT含药血清干预后的C份内皮细胞凋亡率低于B份细胞,组间比较有统计学差异(P<0.05)。2.3免疫荧光结果提示,C份内皮细胞上表达的VEGFR2阳性信号强于B份细胞。2.4电镜结果提示,在C份细胞的超微结构中发现与VEGFR2转运有关的内涵体结构。3结论与提示在低氧状态下,体外培养的脐静脉内皮细胞凋亡率增加、增殖减少,QDTMT含药血清干预后的HUVECs则表现出了细胞增殖提高、凋亡率降低。QDTMT对缺氧HUVECs的保护作用可能和它促进内皮细胞VEGFR2表达有关。
黄娟[9]2013年在《CTGF对体外培养的小鼠VSMC_S钙化的作用及其机制研究》文中研究表明目的：血管钙化(vascular calcification)是动脉粥样硬化、高血压、糖尿病血管病变、血管损伤、慢性肾脏疾病和衰老等普遍存在的病理表现,其关键环节是血管平滑肌细胞(vascular smooth muscle cells, VSMCs)转分化为成骨样细胞。研究表明结缔组织生长因子(connective tissue growth factor, CTGF)在与血管钙化密切相关的动脉粥样硬化、糖尿病肾病和高血压等疾病的病变区域中表达都增加。本实验研究CTGF对小鼠VSMCs钙化的影响及其可能的作用机制。方法：应用小鼠胸主动脉VSMCs进行体外实验,用免疫细胞化学方法鉴定VSMCs,用0.1%茜素红矿化结节染色,细胞钙沉积含量测细胞钙盐沉积,Real-time PCR和Western blot方法检测成骨细胞标志物碱性磷酸酶(ALP)、骨钙素(OC)、骨保护素(OPG)、成骨细胞特异性核转录因子(Cbfa-1/Runx-2)以及MAPKs,包括JNK. p38、ERK1/2的mRNA(?)口蛋白质的表达。同时用ERK的特异性抑制剂PD98059阻断ERK通路的激活。结果：培养的原代小鼠胸主动脉VSMCs呈梭型,α-SMA表达呈强阳性；CTGF持续作用14d后,Real-time PCR和Western blot表明CTGF可使成骨细胞标志物ALP.OC和OPG的mRNA表达以及成骨细胞特异性核转录因子(Cbfa-1/Runx-2) mRNA和蛋白质的表达增加,且呈浓度依赖性；0.1%茜素红染色和细胞钙含量测定发现CTGF可促进血管平滑肌细胞的钙化和钙沉积。Western blot表明CTGF对JNK及p-38无激活作用,但可以激活ERK通路且其激活高峰在30min左右。同时,应用ERK的特异性抑制剂PD98059,可以明显抑制CTGF诱导的VSMCs成骨细胞标志物的表达及VSMCs钙化。结论：CTGF可以促进体外培养的小鼠VSMCs的钙化,主要是通过ERK信号通路起作用。图16幅,参考文献42篇。
张巍[10]2013年在《PCI手术前后CGRP、HMGB1的变化及其与再狭窄临床相关性因素的研究》文中认为目的和背景：高迁移率族蛋白B1(HMGB1),是一类广泛表达于真核生物细胞核内的非组蛋白的DNA结合蛋白；作为组织损伤后释放的细胞因子,HMGB1可以通过激活Toll样受体、核转录因子(?)NF-κB)以及丝裂素活化蛋白激酶(MAKP)p38等信号通路启动炎症应答,在动脉粥样硬化和损伤血管的病理重构发生过程中起重要作用。而降钙素基因相关肽(CGRP)作为神经系统和心血管系统的血管活性肽,具有抑制血管平滑肌细胞(VSMC)增殖、抑制炎症反应和保护内皮细胞等作用,课题组前期的动物实验的研究资料显示CGRP在损伤血管再狭窄的发生和防治中发挥重要作用,且其效应机制与通过Toll样受体、NF-kB等炎症信号通路有关。那么,在临床上冠心病患者PCI手术前后血循环中CGRP和HMGB1水平如何呢?其浓度变化对再狭窄的的发生有无关系?,如果有,是否可以作为再狭窄发生和进展的预测因素?为回答上述问题,本课题拟通过观察临床冠心病患者PCI术前、术后血循环中CGRP、HMGB1的浓度水平,并与再狭窄发生进行相关性分析,探讨CGRP和HMGB1在临床冠心病PCI术后患者再狭窄的发生发展过程中可能存在的作用,以期对再狭窄的预防和治疗提供相关的临床资料。方法：选取2011年1月-2012年9月于遵义医学院附属医院心内科住院患者共196例,年龄36～79岁,所有患者均经冠状动脉造影(CAG)检查确诊冠心病并行PCI治疗,并于术后6-8个月返院复查CAG。按第二次入院时复查CAG结果分为支架内再狭窄(ISR)组和非ISR组；按临床诊断分为稳定型心绞痛(SAP)、不稳定型心绞痛(UAP)组和急性心肌梗死(AMI)叁个亚组；按传统危险因素分为糖尿病组、非糖尿病组,高血压组、非高血压组,肾功能不全组、肾功能正常组等；冠脉造影正常者作为对照组。采集所有纳入者PCI或CAG术前、术后15分钟冠状动脉窦口处动脉血10ml,分离血清置于-80℃下保存,待标本收集完备后应用酶联免疫吸附测定法(ELISA)法检测血清中HMGB1和CGRP浓度水平。结果：本次研究共入选196名患者,年龄36～79岁,平均(60.47±10.36)岁。对照组共30例,年龄31～70岁,平均(55.72±6.18)岁。两组中冠心病组年龄高于对照组,并且男性比例和吸烟的比例明显高于对照组(P<0.05)。两组患者临床合并糖尿病和高血压者在冠心病组明显高于对照组(P<0.05)。冠心病组根据诊断分为AMI组、UAP组和SAP组。AMI组35例,其中29例患者有急诊PCI手术指征并同意行急诊CAG+PCI治疗,另6例患者不具急诊PCI手术指征或拒绝行急诊手术而选择择期PCI治疗；UAP组和SAP组各为95例和66例。冠心病组中146例患者术后6-8月随访复查CAG,4例患者出现胸痛提前返院复查CAG,有16名患者发生ISR,ISR发生率为10.7%。研究发现PCI/CAG术后血清CGRP、HMGB1的浓度较术前升高。而冠心病组血清CGRP、HMGB1的浓度术后较术前升高的差值显着高于对照组(P<0.01),且术前术后二者浓度的升高程度呈正相关性(术前r=0.773,P=0.003；术后r=0.425,P=0.002)。在AMI组、UAP组和SAP组中患者PCI术前和术后血清CGRP、HMGB1的浓度均显着高于对照组(P<0.01),并且在AMI组最高,其次为UAP组,SAP组低于其他组(P<0.05)。通过Gensini积分评分系统评价,发现CGRP、HMGB1的浓度和Gensini积分在AMI组最高,其次为UAP组,SAP组低于其他组(P<0.05)。糖尿病组术前和术后的血清CGRP、HGMB1浓度均数显着高于非糖尿病组(P<0.01),而高血压组与非高血压组、肾功能不全组与肾功能正常组的术前、术后的二者浓度均数差异无统计学意义(P>0.05)。ISR组术前及术后血清中CGRP和HMGB1的浓度均数差异无统计学意义(P>0.05)。但ISR组术后血清CGRP、HMGB1浓度与非ISR组进行差异性比较P值分别为0.061和0.055,其差异性虽然没有统计学意义但在ISR组有升高的趋势。结论：PCI术后较术前血清HMGB1、CGRP浓度变化的程度可能作为判断术后再狭窄的指标,结合体外实验和动物实验结果,推测血清中HMGB1和CGRP的浓度能间接反应PCI对血管壁的损伤和炎症反应的程度,并且两者之间可能起到相互影响的作用。目的和背景：经皮腔内冠状动脉介入治疗(PCI)术后再狭窄是当今临床丞待解决的难题。目前认为冠心病PCI术后再狭窄与叁大因素相关,第一：患者本身存在的危险因素；第二：病变相关因素；第叁：手术相关因素。本研究通过回顾性分析在遵义医学院附属医院接受PCI手术治疗并于术后返院复查冠状动脉造影(CAG)的516例患者的临床资料,探讨多种临床相关因素与再狭窄发生之间的关系。方法：回顾性资料对象抽取2007年1月-2012年9月在遵义医学院附属医院心内科住院患者共516例,年龄30～85岁,所有患者均接受冠脉造影检查确诊冠心病,并行PCI治疗,并于术后返院复查CAG。采集内容包括患者本身存在的危险因素、病变相关因素、手术相关因素等资料。患者本身存在的危险因素包括吸烟、年龄、性别,合并高血压、糖尿病、心衰、高脂血症、’肾功能不全；病变相关因素包括病变长度、冠脉病变部位、血管大小、闭塞程度、狭窄程度、侧枝循环的形成、腔内血栓的存在；手术相关因素包括支架长度、支架直径、最大扩张压力。并根据复查造影时再狭窄的发生情况分为支架内再狭窄(ISR)组和非ISR组,并对多种相关因素进行再狭窄单因素或多因素相关性的分析。结果：入选患者ISR发生率为6.8%。ISR组患者年龄大于非ISR组(P<0.05)。ISR组患者糖尿病的发生率高于非ISR组患者(P<0.05)。两组患者吸烟史、饮酒史、高血压史、高脂血症病史、肾功能不全病史、心血管病家族史比较无统计学意义。ISR主要发生病变血管为右冠状动脉(RCA),其次是左前降支(LAD),而左回旋支(LCX)发生率最小。ISR组术后残余狭窄明显大于非ISR组(P=0.02)。在ISR组中植入支架直径小于3.0mm者明显多于非ISR组,差异有统计学意义(P<0.05)。术后最小官腔直径(MLD)与ISR呈负相关。病变长度、完全闭塞处、术前狭窄程度、术前MLD、腔内血栓形成、支架长度、最大扩张压力、串联支架数、与ISR无相关性。结论：ISR与年龄和糖尿病呈正相关。ISR与参考血管直径、术后MLD、植入支架直径呈负相关；与术后残余狭窄呈正相关。冠脉病变在LAD上的发生率最高,但是ISR主要发生在RCA。急性心肌梗死(AMI)、急诊PCI治疗以及植入重迭支架不会增加ISR的发生。
参考文献：
[1]. MSCs修复血管内膜及对平滑肌部分生物学行为的影响[D]. 武晓静. 第叁军医大学. 2004
[2]. AT2R基因在体可调控表达抑制大鼠颈动脉损伤后新生内膜形成的实验研究[D]. 苗莉. 第叁军医大学. 2007
[3]. 血管平滑肌细胞凋亡诱导产生SDF-1α促进移植物动脉硬化[D]. 李俊. 华中科技大学. 2012
[4]. 平滑肌祖细胞参与哮喘气道重塑的探索性研究[D]. 胡海洋. 第二军医大学. 2009
[5]. 骨髓间充质干细胞过表达MIR126移植通过AKT/ERK相关途径促进缺血心肌血管新生[D]. 陈建军. 中南大学. 2011
[6]. 骨髓来源细胞在主动脉瘤和夹层发病及组织修复中的作用[D]. 邹思力. 第二军医大学. 2013
[7]. 骨髓间充质干细胞构建小口径组织工程化血管的实验研究[D]. 杜振宗. 中国协和医科大学. 2006
[8]. 芪丹通脉片干预VEGF的内皮双向作用的机制研究[D]. 王冰. 第四军医大学. 2009
[9]. CTGF对体外培养的小鼠VSMC_S钙化的作用及其机制研究[D]. 黄娟. 中南大学. 2013
[10]. PCI手术前后CGRP、HMGB1的变化及其与再狭窄临床相关性因素的研究[D]. 张巍. 遵义医学院. 2013
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