基于猪流行性腹泻病毒S蛋白纳米抗体的阻断ELISA方法的建立

论文摘要

猪流行性腹泻病毒（PEDV）,冠状病毒成员。2010年底,我国发生了大范围严重的猪流行性腹泻（PED）疫情,造成了巨大的经济损失。发病猪可见呕吐、水样腹泻、脱水等临床症状,造成猪生长迟缓,甚至死亡,被PEDV感染的仔猪死亡率较高,对发病猪进行病理检查可见萎缩性肠炎。PED的临床症状与组织病理学特征类似于猪传染性胃肠炎（TGE）,所以这两种疾病的鉴别诊断主要依靠分子和血清学检测。PEDV包含4个结构蛋白和17种非结构蛋白,其中纤突蛋白（S）以三聚体的形式定位在病毒表面,其主要介导病毒与细胞膜融合和受体结合等基本生物功能,并包含多个中和表位,可以诱导宿主产生中和抗体。因此,猪血清中PEDV S蛋白的抗体水平更能代表猪体内的中和抗体水平。本研究将纯化后的截短PEDV S重组蛋白通过皮下注射免疫双峰驼,并利用噬菌体展示技术共筛选出6株氨基酸序列不相同的纳米抗体。之后,我们将一株纳米抗体进行了生物素标记,并建立了一种检测猪血清中PEDV S蛋白抗体的阻断ELISA方法。主要内容与结果如下:1.将纯化后的截短PEDV S重组蛋白通过皮下注射免疫双峰驼,四次免疫后,双峰驼血清中的特异性抗体效价达到了1:256000。分离双峰驼外周血淋巴细胞,提取淋巴细胞RNA,反转录得到cDNA,通过巢式PCR扩增VHH片段,并构建至pCANTAB-5E载体中,电转化至TG1感受态细胞,得到VHH噬菌体抗体展示文库。经鉴定,该文库多样性良好,库容量2.1×107pfu/mL,阳性率85%。通过对展示文库3轮的淘选富集,最终筛选出6株氨基酸序列不同的纳米抗体,均对PEDV S重组蛋白具有良好的结合力与特异性,命名为Nb1-Nb6。2.挑选纳米抗体Nb3,扩增其VHH片段并在3’端融合Avitag序列,构建至pET-21b载体,转化至BL21（DE3）感受态细胞中,并利用IPTG对其进行诱导表达,最终通过原核表达成功获得了Nb3-Avitag融合蛋白,经纯化后具有较高的纯度。之后对Nb3-Avitag融合蛋白进行了生物素标记,经鉴定,生物素化后的Nb3仍对PEDV S重组蛋白具有良好的结合能力。3.利用生物素化的纳米抗体Nb3（Nb3-Biotin）,建立了一种检测猪血清中PEDV S蛋白抗体的阻断ELISA方法。通过对各反应条件的摸索与优化,尽量缩短了反应时间（总反应时间3.5小时）,同时保证了最高的敏感性。经验证,该方法与TGEV、PRRSV、PCV、PRV、PPV、JEV抗体阳性血清均不存在交叉反应,且具有良好的重复性。在临床样品检测中,该方法与商业化诊断试剂盒具有92.59%的总体符合率。综上所述,本研究利用噬菌体展示技术筛选出了6株针对PEDV S蛋白的特异性纳米抗体,并基于生物素-链霉亲和素系统,建立了检测猪血清中PEDV S蛋白抗体的阻断ELISA方法,为PEDV的研究以及临床中和抗体的监测提供了工具。

论文目录

摘要

ABSTRACT

文献综述

第一章猪流行性腹泻病毒与纳米抗体的研究进展

1.1 猪流行性腹泻病毒的研究进展

1.1.1 猪流行性腹泻病毒的概述

1.1.2 猪流行性腹泻的流行情况

1.1.3 猪流行性腹泻病毒的分子病原学

1.2 纳米抗体

1.2.1 纳米抗体结构特征

1.2.2 纳米抗体的优势

1.2.3 纳米抗体的临床应用

1.3 本研究的目的与意义

试验研究

第二章 PEDV S蛋白特异性纳米抗体文库的构建及纳米抗体的筛选与鉴定

2.1 试验材料

2.1.1 主要仪器及耗材

2.1.2 主要试剂

2.2 试验方法

2.2.1 VHH噬菌体展示文库的构建

2.2.2 PEDV S蛋白特异性纳米抗体的筛选

2.3 结果

2.3.1 双峰驼免疫

2.3.2 VHH噬菌体展示文库的构建

2.3.3 PEDV S蛋白特异性纳米抗体的筛选

2.3.4 PEDV S蛋白纳米抗体特异性及效价的测定

2.4 讨论

2.5 小结

第三章 PEDV S蛋白纳米抗体Nb3的表达、纯化及生物素化标记

3.1 试验材料

3.1.1 感受态、载体及主要试剂

3.1.2 主要仪器

3.2 试验方法

3.2.1 原核表达载体pET21b-Nb3-Avitag的构建

3.2.2 纳米抗体Nb3-Avitag融合蛋白的表达与可溶性鉴定

3.2.3 Nb3-Avitag重组蛋白的纯化

3.2.4 Nb3-Avitag融合蛋白的生物素化

3.2.5 Nb3-Avitag融合蛋白生物素标记的效果验证

3.3 结果

3.3.1 pET21b-Nb3-Avitag原核表达载体的构建

3.3.2 重组纳米抗体Nb3-Avitag融合蛋白在大肠杆菌中的表达与可溶性鉴定

3.3.3 Nb3-Avitag融合蛋白的纯化

3.3.4 Nb3-Avitag融合蛋白生物素标记的效果验证

3.4 讨论

3.5 小结

第四章基于生物素化纳米抗体检测猪血清中PEDV S蛋白抗体的阻断ELISA方法的建立

4.1 试验材料

4.2 试验方法

4.2.1 摸索最佳抗原包被量与纳米抗体稀释比例

4.2.2 确定最佳血清稀释比例

4.2.3 确定血清最佳孵育时间

4.2.4 确定Nb3-Biotin最佳孵育时间

4.2.5 确定酶标二抗最佳孵育时间

4.2.6 阻断ELISA临界值的确定

4.2.7 重复性评价

4.2.8 特异性评价

4.2.9 符合率评价

4.3 结果

4.3.1 摸索最佳抗原包被量与纳米抗体稀释比例

4.3.2 确定最佳血清稀释比例

4.3.3 确定血清最佳孵育时间

4.3.4 确定Nb3-Biotin最佳孵育时间

4.3.5 确定酶标二抗最佳孵育时间

4.3.6 阻断ELISA临界值的确定

4.3.7 重复性评价

4.3.8 特异性评价

4.3.9 符合率评价

4.4 讨论

4.5 小结

结论

附录

参考文献

致谢

个人简介

文章来源

类型: 硕士论文

作者: 王天宇

导师: 肖书奇,李爽

关键词: 猪流行性腹泻,蛋白,噬菌体展示技术,纳米抗体,阻断

来源: 西北农林科技大学

年度: 2019

分类: 基础科学,农业科技

专业: 生物学,畜牧与动物医学

单位: 西北农林科技大学

基金: 国家重点研发计划项目(编号:2017YFD0501102)

分类号: S852.4

总页数: 74

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