任小巧[1]2003年在《老龄大鼠脑缺血/再灌注细胞凋亡及相关基因表达和脑脉通对其影响》文中研究说明缺血性脑血管病是老年人常见病，随着老年人口的增多及老龄化社会的到来，发病人数将进一步增加。其病理基础与缺血后引起的神经元坏死和迟发性神经元死亡密切相关。其治疗主要是溶栓、应用神经保护剂（包括谷氨酸拮抗剂、钙通道阻滞剂等）、外科治疗等，虽然取得了一定疗效，但因缺乏满意效果或安全性使其临床应用受到限制。新的神经保护剂正在试验中。中医认为正虚血瘀，浊毒内蕴是老年缺血性卒中发生的前提，肝风旋动，挟浊毒损伤脑络是老年脑缺血损伤的发展的关键；解毒降浊、益气活血法是治疗老年脑缺血/再灌注损伤的主要方法。而目前中医药、西医药及中西医结合方法防治缺血性脑血管病的实验研究中多以青年动物为对象，忽视了人类脑血管疾病中增龄因素的重要性。这对于探讨老年缺血性脑血管病病理生理特点及用于指导临床防治方面有一定的差距。因此，本课题以老龄大鼠脑缺血/再灌注后神经细胞凋亡的特征、细胞凋亡调控基因表达变化及其与中医气虚血瘀，浊毒损络的关系为研究的切入点,用“益气活血”、“解毒降浊”的脑脉通进行干预以阻断缺血损伤因果转换、恶势循环，保护神经细胞。采用大脑中动脉栓塞（线栓）致缺血3h、再灌注3 h、6h、12h、24h、72h为模型，用病理形态学、免疫组织化学法、免疫荧光法、分子生物学技术等实验方法，从整体、细胞、分子、基因表达水平上，动态观察不同时间点青年与老龄大鼠脑缺血/再灌注后神经细胞凋亡的特征及凋亡调控基因表达的异同,并进一步研究了脑脉通对老年脑缺血/再灌注后神经细胞凋亡及凋亡调控基因表达的影响。主要实验内容与结果如下。1 老龄大鼠脑缺血/再灌注后神经细胞凋亡特征及脑脉通的保护作用应用整体观察包括神经功能评分、脑组织含水量、梗塞面积等及一般形态学方法包括HE染色、尼氏染色、透射电镜,琼脂糖凝胶电泳等技术对比研究了老龄与青年大鼠脑缺血/再灌注后不同时间点整体和形态学变化特征的异同及脑脉通对其影响。结果发现老龄大鼠容易遭受缺血/再灌注损伤, 其损伤出现的时间早，损伤程度重,缺血损伤后梗塞面积大,其损害可随着缺血及再灌注时间的延长而加重,凋亡细胞数、凋亡小体呈现先少再多后少的变化规律，坏死细胞数随再灌注时间延长而增加。缺血性损伤发生不可逆时，在损伤中心区有坏死细胞增多,凋亡细胞减少，这些特征可能与增龄导致的细胞衰老有关。脑脉通中、大剂量可明显改善脑缺血/再灌注所致的神经元损伤，表现为改善神经功能、减轻脑组织含水量、缩小梗塞面积、减轻神经细胞损伤，保护神经元。其可能机理是合成自身修复所需的内源性蛋白，从而有利于神经元的修复；或可保护神经胶质细胞及血管内皮细胞，上调星形胶质细胞的活化状态,而有利于神经元的修复。这些作用可能与其益气扶正，解毒降浊的作用有关。2 老龄大鼠脑缺血/再灌注后神经细胞凋亡基因表达的变化及脑脉通对其调节作用。在取得上述结果的基础上，进一步应用免疫组织化学法、免疫荧光法、分子生物学等实验方法，动态观察了不同时间点青年与老龄大鼠脑缺血/再灌注后神经细胞凋亡调控基因表达的异同及脑脉通对其影响。结果如下。<WP=3>2.1 老龄大鼠脑缺血/再灌注后细胞膜Fas、Fasl的表达及脑脉通的作用 脑缺血后Fas、Fasl均在缺血后注定死亡的细胞上表达，以半暗带区表达最强，缺血中心区及周边区亦可见弱表达； Fas、Fasl均随再灌注时间的延长而表达增强。老龄大鼠Fas、Fasl表达的增强时间均较青年大鼠早，其高表达持续时间较长。脑脉通解毒降浊，可以下调Fas、Fasl的表达，从而抑制细胞凋亡的发生，其效果等同于尼莫地平。2.2 老龄大鼠脑缺血/再灌注后细胞浆Bcl-2、Bax的表达及脑脉通的作用老年脑缺血后Bcl-2可见弱阳性表达，但其表达无时间规律性。青年大鼠脑缺血后Bcl-2均呈全脑性的增高,以缺血损伤侧为强，并随着缺血时间的延长先升后降，至再灌注72h时与假手术组比较无明显差异，其与缺血后细胞凋亡成负相关。青年或老龄大鼠脑缺血/再灌注后诱发Bax持续表达, 其表达与细胞凋亡成正相关。老龄大鼠Bax表达的增强时间及高峰时间均较青年大鼠早，其高表达持续时间较长。Bcl-2是抑制凋亡的基因，Bax是促进凋亡的基因，表达Bcl-2的细胞其形态多正常，表达Bax的细胞其形态多异常。老年脑缺血再灌注后Bcl-2的低表达或不表达及Bax的早表达和高表达可能与增龄导致的内源性保护能力降低有关，从而使老年脑缺血后神经元损伤较青年大鼠重。脑脉通益气扶正，解毒降浊可以上调Bcl-2的表达，抑制Bax基因表达，对缺血神经元有保护作用。其对缺血前期的保护效应等同于尼莫地平，晚期的保护效应优于尼莫地平。2.3 老龄大鼠脑缺血/再灌注后细胞核caspase-3活性变化及脑脉通的作用Caspase-3是缺血后神经细胞凋亡的关键蛋白酶，其活性变化与缺血后神经元凋亡密切相关。 caspase-3的激活位于Fas、Fasl的下游。老龄大鼠缺血/再灌注后 caspase的激活早于青年大鼠。本实验显示应用脑脉通可降低脑缺血/再灌注后脑组织caspase－3的活性，说明脑脉通可能通过作用于caspase－3前酶或调节其上游基因的表达，抑制其激活；或直接抑制caspas
翟水红[2]2016年在《基于调节GSK3β、JNK的脑脉通对I/R老龄大鼠脑微血管生成的实验研究与临床疗效评价》文中研究说明背景缺血性脑血管病(ICVD)是一种常见病、多发病,其发病率、病死率、致残率、复发率均高,严重威胁人类的健康。在缺血性脑血管病的治疗中,缺血脑组织需要迅速的血管再通,以恢复血氧供应,而脑血流的再灌注会出现损伤加重现象,即脑组织缺血再灌注(I/RIschemic reperfusion)损伤,是导致多种脑血管疾病重要的病理生理基础,减轻脑缺血再灌注损伤是治疗缺血性脑血管病的关键环节。研究表明,脑缺血再灌注损伤后,自身可通过调节多种信号转导通路促进血管生成,以减轻再灌注损伤,促进神经功能的恢复。这种自身调节血管再生过程缓慢,不足以代偿缺血区的血氧供应及血管网重建[1],需要有效手段的干预促进血管生成,而关于中医药促进I/R后血管生成方面的研究报道较少。为此本课题从动物实验和临床观察两个方面研究,首先在前期研究的基础上,通过观察模型大鼠缺血脑组织的病理变化、新生血管场面积和p-GSK-3β、JNK信号效应分子的表达变化,来探讨老龄大鼠脑I/R后病理生理特点和中药脑脉通对其微血管生成的促进作用及可能的影响机制;同时观察脑脉通的临床疗效对于老年缺血性中风患者,来研究脑脉通对缺血性脑损伤的保护作用,为中医药治疗缺血性脑血管疾病提供了临床和实验依据。目的1通过观察各组大鼠脑缺血及再灌注后不同时间点损伤脑组织的病理变化和新生血管场面积变化,揭示老龄大鼠脑I/R损伤的特点及脑脉通对脑组织的保护作用。2通过测定各组大鼠脑缺血及再灌注后不同时间点缺血半暗带p-GSK-3β、JNK的表达变化,研究老龄大鼠脑I/R后脑微血管生成的可能机制及脑脉通对其影响。3通过比较老年缺血性卒中患者入院治疗后不同时间点NIHSS量表评分、中医症状分级(气血血瘀证)量化表评分,探讨脑脉通对老年脑梗死患者的临床疗效。方法1以sd大鼠为研究对象,采用大脑中动脉闭塞(mcao)法制备大鼠局灶性脑缺血(i)3h再灌注(i/r)24h、3d、6d、12d动物模型,分别采用he染色、免疫组织化学方法观察各组大鼠各时间点缺血脑组织病理损伤特点及微血管场面积变化。2应用免疫组织化学方法观察各组大鼠不同时间点缺血半暗带p-gsk3β、jnk蛋白阳性表达变化,研究脑脉通促进血管生成的可能作用机制。3将临床缺血性卒中患者分为脑脉通组和对照组,观察比较两组治疗前、治疗第14天、28天时nhiss量表评分及中医症状量化表评分,评价脑脉通的临床疗效。结果1老龄大鼠脑i/r后的病理改变和微血管场面积变化及脑脉通对其影响1.1脑组织病理变化常规he染色,通过光镜观察各组大鼠缺血脑组织发现,i3h出现组织水肿,水肿程度随时间逐渐加重;i/r6d时水肿程度最重,可见神经元细胞、胶质细胞变性坏死,微血管结构破坏;i/r12d时神经元、神经纤维减少,可见坏死液化灶。老龄模型组缺血脑组织病理损伤较严重,相比于青年模型组,其恢复亦慢;脑脉通组和尼莫地平组病理损伤较老龄模型组均轻,恢复较快,尤以脑脉通组显着。1.2微血管场面积变化老龄模型组i/r1d、3d、6d、12d场面积较青年组相同时间点均降低(p<0.05,p<0.01),老龄模型组血管场面积于i/r1d达峰值,后逐渐降低;与老龄模型组比,脑脉通组i/r1d、i/r3d、i/r6d、i/r12d血管场面积增加(p<0.05,p<0.01);脑脉通组i/r1d、i/r3d、i/r12d血管场面积较尼莫地平组相同时间点增加(p<0.01)。2老龄大鼠脑i/r后p-gsk3β蛋白表达变化及脑脉通对其表达的影响青年、老龄假手术组均可见p-gsk-3β蛋白少量表达;与各相应假手术组比较,青年、老龄模型组各时间点脑组织p-gsk-3β表达均增加;青年模型组i/r1d阳性表达上升,随着i/r时间的延长,阳性表达呈现增加改变,i/r6d达最高;老龄模型组其阳性表达较相同时间点青年模型组均低(P<0.05);脑脉通组和尼莫地平组p-GSK-3β阳性表达较老龄模型组相同时间点均增高(P<0.01)。3老龄大鼠脑I/R后JNK蛋白表达变化及脑脉通对其表达的影响青年、老龄假手术组均可见JNK蛋白少量表达;与各相应假手术组比较,青年、老龄模型组各时间点脑组织JNK表达均增加;青年模型组I/R3d JNK阳性表达达到峰值;与比较,老龄模型组其阳性表达较青年模型组相同时间点降低(P<0.05);与比较,脑脉通组和尼莫地平组JNK阳性表达较老龄模型组相同时间点增高(P<0.01)。4老年缺血性卒中患者NHISS量表评分、中医症状分级量表变化及脑脉通对其影响与对照组比较,脑脉通组各对应时间点NHISS量表评分均低于对照组(P<0.05);脑脉通组各对应时间点中医症状分级量表评分亦低于对照组(P<0.05)。结论1在相同损伤条件下,老龄模型组大鼠脑组织损伤程度重,微血管生成减弱;药物干预后大鼠脑组织损伤较轻,修复较快,且新生血管管径增大,血液有效灌注量增加,提示脑脉通可明显改善老龄大鼠脑I/R后组织的损伤,促进有效血管新生。2大鼠脑I/R后,各组大鼠脑组织内均可见p-GSK-3β、JNK蛋白阳性表达,与老龄模型组相同时间点比较,药物干预组的蛋白表达水平均增高,揭示脑脉通促进老龄大鼠脑I/R后微血管生成,其机制可能与提高p-GSK-3β、JNK蛋白表达有关。3临床试验中老年脑梗死患者在发病急性期NHISS量表评分及中医症状分级量化表评分最高,随着时间的延长,评分均降低,脑脉通组变化较明显,提示脑脉通治疗老年性脑梗死具有比较满意的临床效果。
孟淑辉[3]2014年在《基于调节P-AKT1、FⅧR:Ag的脑脉通对老龄大鼠脑缺血/再灌注损伤脑微血管生成机制研究》文中认为背景缺血性脑血管病（ischemic cerebrovascular disease，ICVD）作为临床常见的危急重病之一，其高致残率及高死亡率已严重威胁人类健康。目前，大量的研究集中于挽救和改善神经元存活和功能恢复，而有关脑缺血后脑微血管再生、微循环重建等方面，较少引起关注。在脑缺血早期，通过血管生成以建立新的血管网，恢复缺血区的血供，将能挽救濒死的神经元，促进神经功能的恢复。血管新生可通过多种蛋白因子或信号转导通路的调节，而PI3K/AKT作为细胞内重要的信号转导通路，常作为改善脑血管病患者预后的一个重要的治疗靶点。脑缺血后自身“代偿性血管再生”为缺血性脑血管病的病理机制研究提供了新的思路，但由于这种自然代偿过程缓慢，且产生的侧枝循环常灌注不足[1]，不能挽救濒死的神经元而导致神经功能的损害，因此，选取有效的药物或其他干预手段促进缺血后血管生成显得尤为重要。近年来，关于中医药治疗缺血性脑血管病的研究较多，且已获得一定的疗效，虽然其作用机制相当复杂，但促进血管再生可能是其重要作用机制之一。而本课题前期实验已证实，中药复方脑脉通对缺血再灌注损伤有显着的保护作用，促进缺血区血管新生是其保护脑损伤的重要途径。因此，本课题在以前研究的基础上，从p-Akt1及FⅧR:Ag表达变化方面探讨老龄大鼠脑缺血/再灌注脑微血管生成机制，并以此为切入点进一步阐释中药复方脑脉通对微血管生成的促进作用及其可能的作用机制。目的1以SD大鼠为研究对象，采用线栓法制备局灶性大脑中动脉脑缺血动物模型，观察脑缺血再灌注损伤后青年和老龄大鼠脑缺血（I）3h再灌注（I/R）24h、3d、6d、12d行为学改变及脑血管超微结构变化；研究脑脉通对老龄大鼠脑缺血/再灌注损伤的保护作用。2采用免疫组织化学方法检测青年和老龄大鼠脑缺血（I）3h再灌注（I/R）24h、3d、6d、12d脑微血管p-Akt1表达变化；研究脑脉通对老龄大鼠脑缺血再灌注损伤p-Akt1表达变化的影响。3采用免疫组织化学方法检测青年和老龄大鼠脑缺血（I）3h再灌注（I/R）24h、3d、6d、12d脑微血管FⅧR:Ag表达变化；研究脑脉通对老龄大鼠脑缺血再灌注损伤FⅧR:Ag表达变化的影响。方法1采用MCAO线栓法复制大鼠局灶性脑缺血3h，再灌注24h、3d、6d、12d动物模型，观察脑缺血3h，再灌注1d、3d、6d、12d神经功能评分、并通过电镜观察各组大鼠在脑I/R后不同时间点脑组织超微结构变化，以进一步探讨脑脉通对老龄大鼠脑缺血再灌注损伤后脑组织病理改变的影响。2采用MCAO线栓法复制大鼠局灶性脑缺血（I）3h再灌注（I/R）24h、3d、6d、12d动物模型，运用免疫组织化学方法比较各组大鼠在脑缺血3h再灌注1d、3d、6d、12d后脑组织p-Akt1的表达变化，观察脑脉通对老龄大鼠缺血再灌注后p-Akt1表达变化的影响。3采用MCAO线栓法复制大鼠局灶性脑缺血（I）3h再灌注（I/R）24h、3d、6d、12d动物模型，运用免疫组织化学方法比较各组大鼠在脑缺血3h再灌注1d、3d、6d、12d后脑组织FⅧ:Ag的表达变化，观察脑脉通对老龄大鼠缺血再灌注后FⅧ:Ag表达变化的影响。结果1老龄大鼠脑缺血/再灌注（Ischemia/Reperfusion，I/R）后神经功能评分、脑组织超微结构变化及脑脉通对其表达的影响1.1各组大鼠脑缺血后神经功能综合评分：青年模型组各时间点大鼠神经功能评分均低于青年假手术组（P<0.01）。青年模型组I/R1d、3d、6d、12d组神经功能评分均低于青年模型组I3h（P<0.01）；青年模型组I/R3d、6d神经功能评分低于青年模型组I/R1d（P<0.01），青年模型组I/R12d神经功能评分高于青年模型组I/R1d（P<0.01）；青年模型组I/R6d神经功能评分低于青年模型组I/R3d（P<0.01），青年模型组I/R12d神经功能评分高于青年模型组I/R3d（P<0.01）；青年模型组I/R12d神经功能评分高于青年模型组I/R6d（P<0.01）。老龄模型组各时间点大鼠神经功能评分均低于老龄假手术组（P<0.01）。老龄模型组I/R1d、3d、6d、12d组神经功能评分均低于老龄模型组I3h（P<0.01）；老龄模型组I/R3d、6d神经功能评分低于老龄模型组I/R1d（P<0.01），老龄模型组I/R12d神经功能评分高于老龄模型组I/R1d（P<0.01）；老龄模型组I/R6d神经功能评分低于老龄模型组I/R3d（P<0.01），老龄模型组I/R12d神经功能评分高于老龄模型组I/R3d（P<0.01）；老龄模型组I/R12d神经功能评分高于老龄模型组I/R6d（P<0.01）。与老龄模型组相同时间点比较，脑脉通组及尼莫地平组神经功能障碍评分均增高（P<0.01，P<0.05）。脑脉通组I/R1d、3d、6d、12d组神经功能评分均低于脑脉通组I3h（P<0.01）；脑脉通组I/R3d、6d神经功能评分低于脑脉通组I/R1d（P<0.01），脑脉通组I/R12d组神经功能评分高于脑脉通组I/R1d（P<0.01）；脑脉通组I/R6d组神经功能评分低于脑脉通组I/R3d（P<0.01），脑脉通组I/R12d组神经功能评分高于脑脉通组I/R3d（P<0.01）；脑脉通组I/R12d神经功能评分高于脑脉通组I/R6d（P<0.01）。与尼莫地平组相同时间点比较，脑脉通组I/R1d、I/R3d、I/R6d神经功能障碍评分均增加（P<0.01，P<0.05）。1.2各组大鼠脑缺血后脑组织超微结构的变化青年假手术组大鼠脑皮质微血管结构完整，基膜及管周均无水肿。血管基底膜连续完整，无溶解、断裂、卷曲、脱落、缺失等。内皮细胞胞浆正常，无水肿。线粒体结构清淅，无肿胀、断裂。粗面内质网结构正常。青年模型组可见管周围轻度水肿（I3h、I/R6d、 I/R12d，照片2、5、6）、中重度水肿（I/R1d、 I/R3d，照片3、4）。内皮细胞线粒体可轻度水肿（I3h、I/R6d、I/R12d，照片2、5、6）。基底膜部分扭曲，基底膜部分水肿（I/R1d、I/R3d，照片3、4），血管基底膜溶解、断裂、缺损（I/R1d、I/R3d、I/R6d，照片3-5）。老龄假手术组大鼠脑皮质微血管结构完整，基膜及管周无明显水肿，血管基底膜连续完整，无溶解、断裂、卷曲、脱落、缺失等（照片7）。老龄模型组可见管周围轻度水肿（I/R6d、I/R12d，照片11、12）、中重度水肿（I3h、I/R1d、I/R3d，尤以I/R3d最重，照片8-10）。内皮细胞线粒体水肿（I3h、I/R1d、I/R6d，照片8、9、11）。血管基底膜溶解、断裂、缺损（I3h、I/R1d、I/R3d、I/R6d，照片8-11）。脑脉通组可见管周围轻度水肿（I/R6d，照片16），内皮细胞线粒体水肿（I3h、I/R1d、I/R6d，照片13、14、16）。尼莫地平组内皮细胞线粒体水肿（I3h、I/R1d、I/R3d、I/R6d、I/R12d，尤以I/R12d最重，照片18-22）。2老龄大鼠脑缺血/再灌注损伤p-Akt1表达变化及脑脉通对其表达的影响青年模型组各时间点大鼠p-Akt1表达水平强于青年假手术组（P<0.01）。青年模型组I/R1d、6d表达强于青年模型组I3h（P<0.01），青年模型组I/R3d、12d表达弱于青年模型组I3h（P<0.01）；青年模型组I/R6d表达强于青年模型组I/R1d（P<0.01），青年模型组I/R3d、12d表达弱于青年模型组I/R1d（P<0.01）；青年模型组I/R6d表达强于青年模型组I/R3d（P<0.01）；青年模型组I/R12d表达弱于青年模型组I/R6d（P<0.01）。与青年模型组相同时间点比较，老龄模型组p-Akt1表达均减弱（P<0.01）。老龄模型组各时间点大鼠p-Akt1表达水平强于老龄假手术组（P<0.01）。老龄模型组I/R1d、6d表达强于老龄模型组I3h（P<0.01），老龄模型组I/R12d表达弱于老龄模型组I3h（P<0.01）；老龄模型组I/R6d表达强于老龄模型组I/R1d（P<0.01），老龄模型组I/R3d、12d表达弱于老龄模型组I/R1d（P<0.01）；老龄模型组I/R6d表达强于老龄模型组I/R3d（P<0.01），老龄模型组I/R12d表达弱于老龄模型组I/R3d（P<0.01）；老龄模型组I/R12d表达弱于老龄模型组I/R6d（P<0.01）。与老龄模型组相同时间点比较，脑脉通组及尼莫地平组p-Akt1表达水平增强（P<0.01，P<0.05）。脑脉通组I/R1d、3d、6d、12d表达均强于脑脉通组I3h（P<0.01）；脑脉通组I/R6d表达强于脑脉通组I/R1d（P<0.01），脑脉通组I/R3d、12d表达弱于脑脉通组I/R1d（P<0.01）；脑脉通组I/R6d、12d表达强于脑脉通组I/R3d（P<0.01，P<0.05）；脑脉通组I/R12d表达弱于脑脉通组I/R6d（P<0.01）。3老龄大鼠脑缺血/再灌注损伤F Ⅷ R:Ag表达变化及脑脉通对其表达的影响青年模型组各时间点大鼠FⅧR:Ag表达水平均强于青年假手术组（P<0.01）。青年模型组I/R3d、6d表达均强于青年模型组I3h（P<0.01，P<0.05），青年模型组I/R1d表达弱于青年模型组I3h（P<0.01）；青年模型组I/R3d、6d、12d表达均强于青年模型组I/R1d（P<0.01）；青年模型组I/R6d表达强于青年模型组I/R3d（P<0.01）青年模型组I/R12d表达弱于青年模型组I/R3d（P<0.01，P<0.05）；青年模型组I/R12d表达弱于青年模型组I/R6d（P<0.01）。与青年模型组相同时间点比较，老龄模型组FⅧR:Ag表达水平降低（P<0.01）。老龄模型组各时间点表达均较老龄假手术组增强（P<0.01）。老龄模型组I/R3d、6d大鼠表达强于老龄模型组I3h（P<0.01），老龄模型组I/R1d表达弱于老龄模型组I3h（P<0.01）；老龄模型组I/R3d、6d、12d表达强于老龄模型组I/R1d（P<0.01）；老龄模型组I/R6d表达强于老龄模型组I/R3d（P<0.01），老龄模型组I/R12d表达弱于老龄模型组I/R3d（P<0.01）；老龄模型组I/R12d表达弱于老龄模型组I/R6d（P<0.01）。脑脉通组及尼莫地平组各时间点大鼠FⅧR:Ag表达水平均强于老龄模型组（P<0.01）。脑脉通组I/R3d、6d、12d表达均强于脑脉通组I3h（P<0.01），脑脉通组I/R1d表达弱于脑脉通组I3h（P<0.01）；脑脉通组I/R3d、6d、12d表达强于脑脉通组I/R1d（P<0.01）；脑脉通组I/R6d表达强于脑脉通组I/R3d（P<0.01）；脑脉通组I/R12表达弱于脑脉通组I/R3d（P<0.01）。结论1通过对脑缺血/再灌注损伤后老龄大鼠神经功能症状及脑组织超微结构变化的观察，与青年模型组相同时间点比较，老龄模型组大鼠脑I/R后组织损伤出现较早，损伤程度较重，且恢复较慢。而随着大鼠缺血再灌注时间的延长，各组大鼠均可见不同程度的组织损伤及修复，尤以脑脉通组大鼠脑组织损伤程度最轻，修复最快。2PI3K/AKT信号转导通路激活后，可诱导Akt1磷酸化表达，促进血管新生。而脑脉通可能通过激活PI3K/AKT信号转导通路的，上调p-Akt1表达增加，参与血管再生。3FⅧR:Ag多在新生血管大量表达，且其表达的强度与血管新生的程度呈正相关。脑脉通可刺激内皮细胞释放FⅧR:Ag表达增多，提示脑脉通可促进脑缺血后脑微血管生成。
皮建彬[4]2017年在《基于调节CREB、p-CREB的脑脉通对I/R老龄大鼠脑微血管生成的实验研究与临床疗效评价》文中提出背景缺血性脑血管病(ischemic cerebrovascular disease,ICVD),是指脑血管病变或全身性疾病导致的脑组织缺血、缺氧的一系列循环障碍,继而出现神经功能缺损障碍的一类脑血管病。由于社会的不断变化,国家政策的调整,目前社会面临较为严峻的人口老龄化问题,预示着我国年老人数的比例将会达到历史上的新高。在我国国民死因调查中发现急性的缺血性脑卒中已经是造成我国国民死亡的极其重要的病因之一,即使侥幸存活下来,其中75%的患者都会有不同程度的残疾。在我国卫生部2012年的调查中显示,我国因脑卒中死亡的人口中年龄在四十岁以上的超过1000万,其中80%是由于缺血性脑卒中,造成严重的社会负担和经济负担。对老年缺血性脑血管病的各种病理生理机制进行全面的研究,寻求效果最佳的治疗方案,在一定程度上能够缓解这一疾病所引起的医学与社会负担。中心坏死区及其周边的缺血性半暗带是急性缺血性病变的脑部组织形式。中心坏死区神经细胞不可逆损伤,缺血半暗带区处于低氧、低灌注状态。及时恢复半暗带区所需要的血供,尽管对治疗这一疾病有显着的效果,可是,在帮助缺血脑组织的血供恢复到以往状态的同时,通过复杂而又快速的级联反应,脑组织被破坏以及功能障碍可进一步加重是有很大可能性的,即脑缺血再灌注损伤(cerebral ischemia-reperfusion injury,CIRI)。根据与之有关的调查研究可以看出,在CIRI之后,大脑就会启用自己本身的血管生成功能,慢慢构建形成旁枝循环,可以用来适应或者预防大脑部分区域的缺血和缺氧,提高神经元的恢复速度并且不断改善它的防御,这也为治疗性血管新生(therapeutic angiogenesis,TAG)的稳定发展打下了一定的基础。同时,脑缺血缺氧后新生血管的形成也受某些特定信号通路激活的调节,其中AC-c AMP-PKA通路是最经典通路。AC-c AMP-PKA通路通过作用于相关因子(如CREB、p-CREB)等,调节细胞新增、分裂、死亡,加快了新血管的形成,同时对治疗脑缺血再灌注(ischemic reperfusion,I/R)病情起到了十分关键的作用。在实验研究的过程当中,本课题在初期研究的基础上,全面运用SD雄性大鼠局灶性大脑中动脉栓塞模型,经过对神经功能障碍进行评估,对脑组织超微结构进行密切观察,采用免疫组化实验的方法对CREB与p-CREB阳性表达的具体变化等诸多方面进行全面的研究,同时也对老龄大鼠脑I/R后微血管的生成机制进行研究,再原有的基础上对脑脉通加快微血管生成的主要原因进行更为深入的剖析。临床研究方面,应用NHISS量表及中医症状分级量表,对脑部缺少血液而带来损伤的老年患者,在复方脑脉通这种中药的治疗下产生作用的有效性进行合理评估。目的1.在本次实验中我们将选择的实验载体为雄性的大鼠,实验将经过对每个模拟实验组包括有(老龄、喂服尼莫地平的大鼠模拟、青年模型及运用实验药物脑脉通等诸多组)当中的大鼠实行实验的对比,各组在脑缺血(I)叁时、缺血再持续灌注(I/R)二十四小时、叁天、六天、十二天当中对神经功能性障碍的评估及对大脑组织超微结构所产生的变化,认真观察实验中中药脑脉通对老龄模拟实验组大鼠脑I/R病情的治疗情况与作用效果,记录所有观察到的现象和反应;2.经过对老龄、尼莫地平、脑脉通、青年等诸多小组在对大鼠实行I叁小时和I/R二十四小时、I/R叁天、I/R六天以及I/R十二天的大脑皮质缺血的周围CREB和p-CREB阳性所产生的变化,根据实验结果进行判断老龄大鼠脑I/R后CREB、p-CREB表现的规律,同时经过观察后科学判断分析其脑部表现是否受到中药脑脉通的作用或者影响;3.临床研究方面,经过对脑脉通小组卒中病人与对照小组卒中病人进行比较,通过对在入院当天、治疗十四天和治疗二十八天NIHSS量表及中医症状分级量表进行评估,针对急性脑缺血病人的神经功能进行调节脑脉通的治疗作用实行有效的评分,评分影响程度。方法1.采用改进后的Longa8分制法以及电子显微镜观察对比青年组、老龄组、尼莫地平组及脑脉通组大鼠在I3h、I/R24h、3d、6d、12d时,神经功能的破坏程度以及脑的组织超微结构的明显变化;2.采用免疫组化实验方法处理大鼠脑组织切片,并应用光镜观察对比青年小组、老龄小组、尼莫地平及脑脉通小组在对大鼠的脑部缺少血液进行(I)叁个小时、缺血/再灌注(I/R)二十四个小时、叁天、六天、十二天的时候对大脑皮质缺少血液的周围CREB、p-CREB阳性所体现出的变化;3.运用NIHSS量表和中医症状分级量表s对老年缺血性卒中病人在入院的当天、进行治疗第十四天和治疗第二十八天的神经功能损害所产生的变化进行详细的评估。结果1.神经功能障碍及脑组织超微结构变化在各组大鼠脑缺血后的表现1.1神经功能障碍老龄小组在不同时间的神经功能障碍分数会跟时间延长出现正相关,于I/R 24h达到顶峰后逐渐下降,I/R 6d、12d降低明显(P<0.05,P<0.01);必须在保证部分变量相同的前提下研究其他变化,采取控制变量法,因此我们采用同一时间节点进行比较判断与青年小组的实验情况,比较结果显示,老龄小组I/R 24小时、3天的神经功能障碍计分分数都趋向于上升现象(P<0.05)。和老龄小组在同一时间节点对比,尼莫地平小组神经功能障碍的分数在I/R 24小时下降(P<0.05),脑脉通小组I/R24小时、3天的神经功能障碍分数也是表现出下降(P<0.05)的现象。脑脉通小组和尼莫地平小组在同一时间节点进行对比发现,神经功能障碍得分的差距不是非常明显。得分跟随时间上升的是脑脉通小组神经功能障碍,在I/R 24小时达到最高处后慢慢呈现下降趋势,并且在I/R 12天时达到最低(P<0.01)。1.2脑组织超微结构变化青年假手术小组在对大鼠脑的组织进行实验时发现,经过运用电子显微镜查出脑组织的微血管结构并没有出现任何损坏现象,血管基膜也没有任何的损坏,基膜和管周也没有出现水肿。(照片1)。线粒体结构以及粗面内质网未出现明显异常表现。在完成实验之后,使用高精度电子显微镜下观察对比青年模型小组在显微镜下显示出的生物现象可知,在脑缺血3小时,缺血再灌注6天、12天时,血管周边有轻微的水肿表现(具体见照片2、5、6)、在缺血再灌注24小时、3天时可发现血管周围水肿加重(具体见照片3、4)。在缺血3小时、缺血再灌注6天、12天的情况,观察内皮细胞的线粒体,可发现其伴有轻微水肿(具体见照片2、5、6)。在缺血再灌注24小时、3天时,通过电子显微镜观察得知,基底膜部分扭曲伴有水肿(具体见照片3、4)。而与上面所说的青年假的手术小组结果差不多相同的是老龄假的手术小组(照片7)。通过对比,观察得出,老龄模型组在高精度电子显微镜下显示,在脑缺血再灌注6天、12天时,管周围有轻微水肿现象(具体见照片11、12)、在脑缺血3小时、缺血再灌注24小时、3天时,观察得知,其水肿程度较前加重(具体见照片8、9、10)。其内皮细胞线粒体在脑缺血3小时、缺血再灌注24小时、6天时伴随有水肿发生(具体见照片8、9、11)。脑脉通小组在脑缺血再灌注6天时,可以看到管周围几乎没有明显的水肿现象(具体见照片45),在脑缺血3小时,缺血再灌注24小时、6天时,内皮细胞线粒体则显示相对较为显着性的水肿现象(具体见照片42、44、45)。尼莫地平组在脑缺血3小时,缺血再灌注24小时、3天、6天、12天时,其内皮细胞线粒体出现水肿表现,其中在缺血再灌注12天时症状最为明显。(具体见照片37-41)。2.老龄大鼠脑I/R后脑组织CREB表达变化及脑脉通对其影响老龄假手术小组可见少量CREB表达,它的表达根据时间的增加而逐渐增加,呈现出正比的形式,于老龄模型组I/R 24h出现峰值后又开始呈现下降趋势,老龄模型组I/R 6d、12d下降明显,并于老龄模型组I/R 12d降到最低(P<0.05,P<0.01),此时出现峰谷。对比CREB阳性在青年假手术小组和老龄假手术小组中,将会很清楚的发现,后者表现出升高(P<0.01)趋势;在同一时间点内和青年大鼠小组进实行比较,老龄模型小组I/R二十四小时CREB阳性表达出现升高(P<0.05),老龄模型组I/R 3d、6d CREB阳性表达均降低(P<0.05,P<0.01)。和老龄模型小组在相同的时间点进行对比,尼莫地平小组I/R叁天、六天、十二天的CREB阳性表达都有所升高(P<0.01),脑脉通小组I/R 24h、3d、6d、12d CREB阳性表达均升高(P<0.05,P<0.01)。脑脉通组与尼莫地平组单独比较,在与尼莫地平小组在相同的时间内实行比较得出,脑脉通小组在I/R叁天CREB阳性所出现明显的降低的现象(P<0.01),的趋势,脑脉通小组在I/R六天、十二天CREB阳性显示均提高了(P<0.05,P<0.01)。脑脉通小组的CREB阳性表达是按照时间的增长逐渐提升,在I/R六天可到达相对较高的趋势之后逐渐出现降低的现象,I/R十二天能降到最低(P<0.05,P<0.01)。3.老龄大鼠脑I/R后脑组织p-CREB阳性表达变化及脑脉通的作用老龄假手术小组样本,通常可以见到数量不多的p-CREB阳性显示,它的显示会根据时间增加慢慢变高,在老龄小组I/R 24小时,阳性表达到达最高处后会有显着的下降,老龄小组I/R 12d时其在最低处(P<0.05,P<0.01)。在进行样本对比时,发现老龄假手术小组p-CREB阳性比青年假手术小组变高(P<0.01);与青年模型小组同时间点相比,老龄模型小组I/R 3h、24h p-CREB阳性表达升高(P<0.01),老龄小组样本I/R 3d、6d、12d p-CREB阳性显示都下降(P<0.05,P<0.01)。和老龄小组在同一时间节点进行对比时可得出,尼莫地平小组I/R 3天、6天p-CREB阳性显示都是上升(P<0.01)趋势,脑脉通小组I/R 3d、6d、12d CREB阳性表达均升高(P<0.01);与尼莫地平小组同时间点相比,脑脉通小组I/R24h p-CREB阳性表达下降(P<0.05),脑脉通小组I/R 6d、12d p-CREB阳性表达升高(P<0.01)。脑脉通小组p-CREB阳性表达随着时间的增加不断的增加依然是线性正比变换情况,但在I/R 6天到达峰值点之后开始线性下降(P<0.05,P<0.01)。4.脑脉通的临床疗效评价分析老年脑梗死患者的NIHSS量表评分、中医症状分级量表分别在脑脉通组和对照组两组间、入院当天、治疗14天和28天叁个时间点间均有统计学意义(P<0.05);脑脉通小组和对照小组在治疗进行到14天、28天时NIHSS量表和中医症状分级量表评分,都显示比住院当天有显着的下降(P<0.05);脑脉通组在治疗28天时NIHSS量表评分较对照组明显降低(P<0.05),分别在治疗14天和治疗28天这两个时间点上对比观察得知,中医症状分级量表评分均较对照组显着降低(P<0.05)。结论1.随着增龄,老龄大鼠脑I/R损伤程度重、出现早、恢复慢;2.脑脉通的促血管新生作用机制与其提高CREB、p-CREB蛋白表达有关;3.脑脉通可改善老年脑梗死患者的神经功能损伤以及中医气血运行状况。
武利娟[5]2014年在《基于调节PI3K/Akt信号转导通路的脑脉通对I/R老龄大鼠脑微血管生成机制的研究》文中进行了进一步梳理背景脑缺血后若能及时在再灌注时间窗内恢复半暗带区的血氧供应，可以挽救神经元生理功能，改善患者预后。然而，随着缺血区血液供应的恢复，也可能导致进一步的组织损伤和功能障碍，即缺血再灌注损伤。因此，如何减轻脑缺血再灌注损伤成为目前缺血性脑血管病治疗的关键环节。最近研究表明，缺血缺氧后，脑组织可上调细胞内信号转导通路的表达，启动自身性血管生成机制，逐渐建立起自身侧支循环，以适应或抵抗脑局部缺血缺氧，减轻再灌注损伤。缺血性脑卒中后参与血管生成的胞内信号转导通路较多且机制较为复杂，其中PI3K/Akt信号转导通路与脑部缺血半暗带区微血管生成和侧枝循环的建立密切相关，其信号效应分子的表达，受细胞内外多种因素的调节，从而在疾病的发生发展过程中发挥重要作用。然而这种内源性的血管生成机制，不足以代偿缺血区的血氧供应，需药物干预的手段促进血管生成，这就为中药作用于血管新生及信号通路的研究，提供了广阔的前景。本课题在前期研究的基础上，从模型大鼠缺血区和半暗带α-SMA、PI3K、Akt1的表达变化来探讨老龄大鼠脑缺血/再灌注后微血管生成的特点及中药制剂对老龄大鼠脑缺血/再灌注微血管生成的影响及可能的作用机制，这对深入探讨老年缺血性脑血管疾病的病理生理特点，探索中医药治疗缺血性脑血管疾病的作用途径，具有重大的社会意义及科学价值。目的1通过观察青年模型组、老龄模型组、尼莫地平组、脑脉通组大鼠脑缺血（I）3h再灌注（I/R）24h、3d、6d、12d后脑组织损伤的病理变化，揭示老龄大鼠脑I/R损伤的特点及脑脉通对其的脑保护作用；2通过研究青年模型组、老龄模型组、尼莫地平组、脑脉通组大鼠脑缺血（I）3h再灌注（I/R）24h、3d、6d、12d大脑皮质区半暗带微血管α-SMA表达变化，揭示老龄大鼠I/R脑微血管生成的特点及脑脉通对其影响；3通过研究青年模型组、老龄模型组、尼莫地平组、脑脉通组大鼠脑缺血（I）3h再灌注（I/R）24h、3d、6d、12d大脑皮质区半暗带PI3K、Akt1表达变化，揭示老龄大鼠I/R微血管生成的可能机制及脑脉通对其影响。方法1采用MCA线栓法制备大鼠局灶性脑缺血（I）3h再灌注（I/R）24h、3d、6d、12d动物模型，通过光镜等技术观察各组大鼠在脑I/R后不同时间点大脑皮质脑组织损伤的病理特点，进一步探讨脑脉通对老龄大鼠脑缺血再灌注损伤后脑组织病理改变的影响。2采用MCA线栓法制备大鼠局灶性脑缺血（I）3h再灌注（I/R）24h、3d、6d、12d动物模型，运用免疫组织化学方法比较各组大鼠在I3h、I/R1d、I/R3d、I/R6d、I/R12d后大脑皮质区半暗带微血管α-SMA的表达变化，研究脑脉通对老龄大鼠缺血再灌注后微血管α-SMA表达变化的影响。3采用MCA线栓法制备大鼠局灶性脑缺血（I）3h再灌注（I/R）24h、3d、6d、12d动物模型，运用免疫组织化学方法比较各组大鼠脑缺血3h再灌注1d、3d、6d、12d后大脑皮质区半暗带PI3K、Akt1表达变化，研究脑脉通对老龄大鼠缺血再灌注后脑组织PI3K、Akt1表达的影响。结果1老龄大鼠I/R脑组织损伤的病理观察及脑脉通对其的影响通过常规HE染色，光镜下观察模型组大脑皮质缺血中心区与半暗带区脑组织损伤的病理变化发现，在I3h开始出现组织水肿；I/R24h、I/R3d天时水肿程度较严重，神经纤维紊乱，血管间隙增宽；I/R6d时水肿达到高峰，同时可见大量神经细胞、胶质细胞变性坏死，微血管壁破坏；I/R12d时水肿基本消失，神经元、胶质细胞、神经纤维减少，坏死液化灶出现。与青年模型组相同时间点比较，老龄模型水肿出现早，组损伤较严重，恢复速度较慢；与老龄模型组相同时间点相比，脑脉通组和尼莫地平组病理组织损伤较轻。2老龄大鼠脑I/R α-SMA蛋白表达时程变化及脑脉通对其表达的影响通过免疫组化结果发现：青年和老龄假手术组均可见α-SMA弱阳性表达；青年模型组I24h阳性表达开始上升，随着I/R时间点的变化，阳性表达呈上升趋势，I/R6d、12d维持在较高水平；与青年模型组比较，老龄模型组I3h、I/R24h、I/R3d、I/R12d表达均低于青年模型组（P<0.05，P<0.01）；与老龄模型组同时间点比较，脑脉通组和尼莫地平组α-SMA阳性表达均高于老龄模型组（P<0.05）。3老龄大鼠脑I/R PI3K、Akt1蛋白表达时程变化及脑脉通对其表达的影响通过免疫组化结果发现：青年和老龄假手术组均可见PI3K弱阳性表达；青年模型组I24h阳性表达开始上升，随着I/R时间点的变化，阳性表达呈上升趋势，I/R6d达到峰值，I/R12d呈降低趋势；与青年模型组相同时间点比较，老龄模型组阳性表达均较低（P<0.05）；与老龄模型组相同时间点比较，脑脉通组和尼莫地平组各时间点PI3K阳性表达均高于老龄模型组（P<0.01）。青年和老龄假手术组均可见Akt1弱阳性表达；青年模型组I24h阳性表达开始上升，随着I/R时间点的变化，阳性表达呈上升趋势，I/R6d达到峰值，I/R12d呈降低趋势；与青年模型组相同时间点比较，老龄模型组Akt1阳性表达均较低（P<0.05）；与老龄模型组相同时间点比较，脑脉通组和尼莫地平组各时间点阳性表达均高于老龄模型组（P<0.01）；与尼莫地平组相同时间点比较，脑脉通组阳性表达高于尼莫地平组（P<0.01）。结论1.在遭受相同条件的I/R损伤时，与青年模型组相同时间点比较，老龄模型组大鼠损伤出现较早，损伤较重，恢复慢。与老龄模型组相同时间点比较，脑脉通组及尼莫地平组组织病理损伤程度较轻，尤以脑脉通组大鼠脑组织损伤程度最轻，修复最快，提示脑脉通可明显改善老龄大鼠脑I/R后组织的损伤。2.老龄大鼠脑I/R损伤后，脑组织内可见微血管生成标记物α-SMA蛋白的表达，且随脑I/R时间的延长，表达逐渐增多；与老龄模型组相同时间点比较，脑脉通组及尼莫地平组α-SMA蛋白的表达水平增高，尤以脑脉通组显着，提示脑脉通促进老龄大鼠脑I/R后微血管生成。3.老龄大鼠脑I/R损伤后，脑组织内有PI3K、Akt1信号效应分子表达，提示在脑I/R早期即激活了PI3K/Akt1信号转导通路，调节缺血再灌注损伤；与老龄模型组相同时间点比较，脑脉通及尼莫地平组蛋白表达水平均增高，尤以脑脉通组显着，提示脑脉通对老龄大鼠脑I/R后损伤的保护机制可能与提高缺血半暗带区PI3K、Akt1信号效应分子表达，调节PI3K/Akt1信号转导通路，促进血管生成有关。
陶录岭[6]2014年在《基于调节SDF-1α/CXCR4轴的脑脉通对脑缺血/再灌注老龄大鼠脑微血管生成机制研究》文中提出背景缺血性脑血管疾病(ischemic cerebrovascular disease,ICVD)作为临床危、急、重病之一，发病既有其慢性复杂的病理基础，又有其凶险多变的急性演变过程，且其发病率和死亡率均随年龄增加而增高，严重危害老年人的身心健康。在我国，随着老年人口的增多及老龄化社会的到来，深入研究老年缺血性脑卒中的发病机制，寻求有效的治疗方案已显得十分迫切。近年来，治疗性血管生成概念的引入，为ICVD的治疗提供了新的思路。血管生成不仅是一个复杂的组织学和生物学过程，同时也是一个在动态平衡中的复杂信号转导调控变化的过程，而对此调控机制的深入研究既是全面认知血管生成复杂过程的重要途径，又可使我们进一步明确ICVD的病理生理特点，并为治疗缺血性脑血管疾病开辟新的途径。随着对信号转导通路在脑缺血/再灌注(I/R)血管生成中机制的研究，逐渐认识到信号转导通路调节的血管生成在重构新的血管网方面的作用，但有关I/R后血管生成尤其是老年血管生成方面的研究鲜见报道。本课题在前期研究的基础上，从通过评估神经功能障碍评分的改变，观察脑梗死面积及缺血脑组织病理损伤变化，运用免疫组化法研究α-SMA、SDF-lα、CXCR4蛋白阳性的表达变化来探讨老龄大鼠脑I/R脑微血管生成机制，并以此为切入点进一步阐释中药复方脑脉通对脑微血管生成的促进作用及其可能的作用机制。目的1通过比较青年组、老龄组、尼莫地平模型组和脑脉通模型组大鼠脑I/R后神经功能障碍评分、脑组织缺血面积及缺血后脑组织病理的变化，来探讨老龄大鼠脑I/R后脑组织损伤特点及脑脉通对老龄大鼠I/R后脑组织的保护作用。2通过观察青年组、老龄组、尼莫地平模型组和脑脉通模型组大鼠I/R后脑组织α-SMA蛋白的表达，来探讨老龄大鼠脑I/R后脑组织α-SMA蛋白的表达规律及脑脉通对老龄大鼠I/R后脑组织微血管生成的促进作用。3通过观察青年组、老龄组、尼莫地平模型组和脑脉通模型组大鼠I/R后脑组织SDF-lα、CXCR4蛋白的表达，来探讨老龄大鼠脑I/R后脑组织SDF-lα、CXCR4蛋白的表达规律及脑脉通对SDF-lα、CXCR4蛋白表达的调节作用。方法1采用神经功能综合评分法、TTC染色法及光镜技术观察分别比较各组大鼠脑缺血态(I)3h再灌注(I/R)24h、3d、6d、12d时神经功能障碍评分、脑组织缺血面积及缺血区脑组织病理损伤的改变。2采用免疫组织化学方法观察各组大鼠脑缺血(I)3h再灌注(I/R)24h、3d、6d、12d时脑组织α-SMA蛋白阳性表达变化。3采用免疫组织化学方法观察各组大鼠脑缺血(I)3h再灌注(I/R)24h、3d、6d、12d时脑组织SDF-lα、CXCR4蛋白阳性表达变化。结果1老龄大鼠脑I/R后神经功能障碍、脑组织梗死面积和脑组织病理改变及脑脉通对其改变的影响1.1神经功能障碍与青年假手术组及老龄假手术组比较，各相应模型组时间点神经功能障碍综合评分均减低（P<0.01，P<0.05），且其神经功能障碍综合评分随时间的延长呈现减低趋势，并在脑I/R6d时神经功能障碍评分最低（P<0.01），相对于I/R6d时，其神经功能障碍在I/R12d呈减轻改变（P<0.05）；与青年模型组各相同时间点比较，老龄模型组I/R6d、I/R12d神经功能障碍评分均减少（P<0.01，P<0.05）；与老龄模型组各相同时间点比较，脑脉通组、尼莫地平组各时间点神经功能障碍评分均增加（P<0.01，P<0.05）；与尼莫地平组相同时间点比较，脑脉通组I/R3d、I/R6d、I/R12d神经功能障碍评分均增加（P<0.01，P<0.05）。1.2脑组织梗死面积与青年假手术组及老龄假手术组比较，各相应模型组时间点脑组织梗死面积均增大，且其梗死面积随时间的延长呈现增大趋势，并在脑I/R6d时其梗死面积最大（P<0.01），相对于I/R6d时，其梗死面积在I/R12d呈减小改变；与青年模型组各相同时间点比较，老龄模型组I/R6d、I/R12d时间点脑组织梗死面积增大（P<0.01，P<0.05）；与老龄模型组各相同时间点比较，脑脉通组、尼莫地平组各时间点脑组织梗死面积均减小（P<0.01，P<0.05）；与尼莫地平组各相同时间点比较，脑脉通组I/R6d、I/R12d脑组织梗死面积均减小（P<0.01，P<0.05），尤以12d为着（P<0.01）。1.3脑组织病理改变通过常规HE染色，光镜下观察各模型组大脑皮质缺血中心区与半暗带区脑组织损伤的病理变化发现，在I3h开始出现组织水肿；I/R24h、I/R3d天时水肿程度逐渐加重，神经纤维紊乱，血管间隙增宽；I/R6d时水肿达到高峰，同时可见大量神经细胞、胶质细胞变性坏死，微血管结果破坏；I/R12d时水肿基本消失，神经元、胶质细胞、神经纤维减少，坏死液化灶出现。与青年模型组相同时间点比较，老龄各模型组水肿出现早，组损伤较严重，恢复速度较慢；与老龄模型组相同时间点相比，药物干预各模型组病理组织损伤较轻，药物可以明显减轻老龄大鼠脑I/R病理损伤，尤以脑脉通组脑保护作用为着。2老龄大鼠脑I/R后脑组织α-SMA蛋白表达变化及脑脉通对其表达的影响免疫组化检测结果发现：青年假手术组和老龄假手术组脑组织内均可见α-SMA蛋白弱阳性表达；与青年假手术组和老龄假手术组比较，各相应模型组时间点脑组织α-SMA蛋白表达均增加，且其表达随时间的延长呈现增加趋势，并在脑I/R12d时表达最高（P<0.01）；与青年模型组相同时间点比较，老龄模型组各时间点脑组织α-SMA蛋白表达均减少（P<0.01，P<0.05）；与老龄模型组相同时间点比较，脑脉通组、尼莫地平组各时间点脑组织α-SMA蛋白表达均增加（P<0.01，P<0.05）；与尼莫地平组相同时间点比较，脑脉通组各时间点脑组织α-SMA蛋白表达均增加（P<0.01， P<0.05）。3老龄大鼠脑I/R后SDF-lα、CXCR4蛋白表达变化及脑脉通对其表达的影响免疫组化检测结果发现：青年假手术组和老龄假手术组脑组织内均可见SDF-lα、CXCR4蛋白弱阳性表达；与各相应假手术组比较，各模型组各时间点脑组织SDF-lα、CXCR4蛋白表达均增加，且其表达随时间的延长呈现增加趋势，并在脑I/R6d时表达最高（P<0.01），相对于I/R6d时，其表达在I/R12d呈减少改变；与青年模型组各相同时间点比较，老龄模型组各时间点脑组织SDF-lα、CXCR4蛋白表达均减少（P<0.01，P<0.05）；与老龄模型组各相同时间点比较，脑脉通组、尼莫地平组各时间点脑组织SDF-lα、CXCR4蛋白表达均增加（P<0.01，P<0.05）；与尼莫地平组各相同时间点比较，脑脉通组各时间点脑组织SDF-lα、CXCR4蛋白表达均增加（P<0.01， P<0.05）。结论1随着增龄，在相同损伤条件下，老龄大鼠脑I/R后脑组织损伤出现早、程度重、恢复慢；随着脑I/R时间的延长，各模型组脑组织损伤均有不同程度的修复，与其他模型组相比，脑脉通可明显改善老龄大鼠脑I/R后组织的损伤。2大鼠脑I/R后，各模型组脑组织内可见α-SMA蛋白表达，且随着I/R时间的延长，各模型组脑组织内α-SMA蛋白阳性率表达逐渐升高，尤以脑脉通组表达相对较高，提示脑脉通促进了老龄大鼠脑I/R后脑组织微血管的生成。3大鼠脑I/R后，各模型组脑组织内可见SDF-lα、CXCR4蛋白表达，尤以脑脉通组表达相对较高；脑脉通对老龄大鼠脑缺血再灌注后微血管生成的作用机制，可能与提高缺血半暗带区信号效应分子SDF-lα、CXCR4蛋白表达，激活SDF-lα/CXCR4信号转导轴，募集大量血管生成因子到缺血脑组织，从而促进血管生成有关。
刘轲[7]2004年在《脑脉通对老龄大鼠脑缺血/再灌注微血管基底膜损伤的保护作用》文中认为缺血性脑卒中作为临床危、急、重病之一,发病既有其慢性复杂的病理基础,又有其凶险多变的急性演变过程,且其发病率和死亡率均随年龄增加而增高。在我国,随着老年人口的增多及老龄化社会的到来,深入研究老年缺血性脑卒中的发病机制,寻求有效的治疗方案显得十分迫切。 脑缺血再灌注损伤是引起多种脑血管病的重要病理生理机制,抗脑缺血再灌注损伤是治疗脑梗死的有效措施。在脑缺血再灌注损伤机制中,细胞内蛋白酶起着重要作用,能够水解细胞外基质的两个主要酶系统为基质金属蛋白酶系统和纤溶酶原激活系统。目前,从细胞外基质成分改变及其相关降解酶类,动态研究脑缺血再灌注微血管损伤病理生理的机制甚为少见,尤以老年动物为研究对象国内尚未见报道;在开展对老年缺血性脑血管疾病的实验研究中多使用青年动物,忽视了人类脑血管疾病中增龄因素的重要性,致使实验研究结果与临床有较大差距;以解毒降浊、益气活血方药治疗老年脑缺血再灌注损伤的实验研究资料报道较少,特别以解毒降浊、益气活血方药对脑缺血再灌注血管基底膜成分改变及其相关降解酶类系统表达变化影响的研究国内尚未见报道。本课题以老龄大鼠脑缺血/再灌注微血管细胞外基质的损伤与气虚血瘀,浊毒损络为研究的切入点,从脑微血管结构、基底膜IV型胶原和层连蛋白等变化揭示老龄大鼠脑缺血/再灌注损伤的特点;从脑微血管基底膜MMPs、TIMP与PA、PAI 的变化揭示老龄大鼠脑缺血/再灌注微血管基底膜损伤机制。从脑微血管结构、基底膜IV型胶原和层连蛋白等变化证实脑脉通对老龄大鼠脑缺血/再灌注损伤具有保护作用;从脑微血管基底膜MMPs、TIMP与PA、PAI的变化揭示脑脉通对老龄大鼠脑缺血/再灌注微血管损伤的保护机制。1 老龄大鼠脑缺血/再灌注损伤变化及脑脉通的保护作用 采用大脑中动脉阻塞(MCAO)线栓法复制大鼠局灶性脑缺血3h、再灌注6h、12h、24h、3d、6d 动物模型。将青年和老龄大鼠分为青年假手术组、青年模型组(根据缺血及再灌注时间不同分为缺血3h、再灌注6h、12h、24h、3d、6d组)、老龄假手术组、老龄模型组(分组时间点同青年模型组)、脑脉通中剂量组(分组时间点同上,0.90g·kg-1·d-1)、尼莫地平组(分组时间点同上,6.00mg·kg-1·d-1)、脑脉通大剂量组(观察再灌注 24h、3d 两个时间点,1.80g·kg-1·d-1)、脑脉通小剂量组(分组时间点同脑脉通大剂量组,0.45g·kg-1·d-1)。应用整体观察包括神经功能评分、脑组织含水量、梗死面积等及一般形态学方法包括HE染色、透射电镜等技术对比研究老龄与青年大鼠脑缺血/再灌注后不同时间点整体和形态学变化特征的异同及脑脉通对其影响。 结果:①神经症状积分变化 青年大鼠模型组间比较:I/R 12h～I/R 6d组高于I 3h、I/R 6h 组;I/R 24h 组高于I/R 12h 组。老龄大鼠模型组间比较:I/R 12h～I/R 6d 组高于I3h;I/R 24h、I/R 3d 组高于I/R 6h 组;I/R 24h 组高于I/R 12h、I/R 6d 组;I/R 3d 组高于I/R 6d组。与青年大鼠模型组相同时间点比较:老龄大鼠模型组I/R 24h、I/R 3d增高。与老龄大鼠模型组相同时间点比较:脑脉通大、中剂量组I/R 24 h 和脑脉通中剂量 I/R 3d组下降。②脑组织含水量变化 青年大鼠组间比较:I/R 12h～I/R 6d组高于青年假手术组;<WP=6>2 脑脉通对老龄大鼠脑缺血/再灌注微血管基底膜损伤的保护作用I/R 12h～I/R 3d 组高于I 3h 组;I/R 24h、I/R 3d 组高于I/R 6h 组;I/R 24h 组高于I/R 12h、I/R 6d 组。老龄大鼠组间比较:I/R 12h～I/R 6d 组高于老龄假手术组、I 3h 组;I/R 24h、I/R 3d 组高于I/R 6h 组;I/R 24h 组高于I/R 12h 组。与老龄大鼠模型组相同时间点比较:脑脉通中剂量组I/R24h降低;脑脉通大、中剂量组I/R3d降低。③脑组织梗死面积变化 青年大鼠模型组间比较:I/R12h～I/R 6d 组高于 I 3h、I/R 6h 组;I/R 24h～I/R 6d 组高于I/R 12h 组;I/R 3d、I/R 6d 组高于I/R 24h 组。老龄大鼠模型组间比较:I/R 6h～I/R 6d组高于I 3h组;I/R 12h～I/R 6d组高于I/R 6h组;I/R 24h～I/R 6d组高于I/R 12h组;I/R 3d、I/R 6d 组高于I/R 24h 组。与青年大鼠模型组相同时间点比较:老龄大鼠模型组I/R6h～I/R 6d 增高。与老龄大鼠模型组相同时间点比较:脑脉通中剂量组 I/R 6h～I/R 6d 减小,脑脉通小剂量组I/R 24h、I/R 3d减小。与尼莫地平组相同时间点比较:脑脉通中剂量组I/R 12h、I/R 6d减小。④组织病理损伤 光镜下青年模型组可见到血管壁肿胀、壁结构模糊,管周水肿、炎性细胞浸润。管内有大量的红细胞淤集。与青年模型组比较,老龄模型组管周有炎性细胞浸润、管腔受压、甚或形成“血管套,管周有红细胞渗出物。脑脉通中剂量组(I/R24h)可见管壁水肿、组织结构欠清,管周水肿明显、管周有炎性细胞浸润、管腔受压变形。电镜下青年模型组可见管周围轻度、中度及高度水肿。血管壁厚薄不均。与青年模型组比较,老年模型组可见红细胞(出血灶)。基底膜厚薄不匀,可部分增厚,或折迭、扭曲,或分层、模糊,或溶解、断裂、缺损。脑脉通中剂量组(I/R 24h)可见血管周围水肿,基底膜局部水肿。 结论:?
刘昊飞[8]2017年在《基于调节cAMP、VEGF的脑脉通对I/R老龄大鼠脑微血管生成的实验研究及临床观察》文中研究说明背景:脑血管病(cerebrovascular disease,CVD)为临床神经内科多见的一类严重疾病,其发病人数与致残人数均居高不下。其中,缺血性脑血管病(ischemic cerebrovascular disease,ICVD)约占所有脑血管病的80%,目前已严重威胁我国高龄人群生命健康及生存质量,是以寻求更有效的ICVD治疗手段和药物迫在眉睫。自血管新生(Angiogenesis)于肿瘤治疗中被应用后,该方法得到医学诸多领域的日益重视,其中包括对缺血性脑血管疾病(ICVD)的治疗。研究发现,一些信号转导通路的表达所产生的级联效应可以上调某些细胞因子的表达,进而启动内源性血管生成机制[1-2]。此中,c AMP/PKA信号通路与VEGF/VEGFR系统关系十分紧密,两者间的信号输递介入了脑缺血后微血管结构的重新构生。本课题制备大鼠局灶性大脑中动脉栓塞模型(middle cerebral artery occlusion,MOCA),并对不同时刻大鼠神经障碍水平、缺血区光镜下病理形态学特征、c AMP和VEGF的阳性水平予以观察,进一步讨论ICVD大鼠旁支循环重构机理。同时,通过观察脑脉通颗粒干预下老龄大鼠中枢系统c AMP和VEGF的动态变化探讨脑脉通保护作用机理。临床观察部分主要通过对比两组入院患者治疗不同时刻NIHSS量表、中医症状分级量表评分来评估脑脉通的临床有效性。目的:1对青年ICVD和老年ICVD大鼠病情进展的不同时刻(缺血3小时,缺血/再灌注24小时、3天、6天、12天)神经功能障碍评定。同时选用光学显微镜对大鼠缺血脑组织进行病理观察,探讨大鼠脑缺血受损机制及青、老龄间差异;2对青年ICVD组、老龄ICVD组、尼莫地平组及脑脉通组在病情进展的不同时刻(缺血3小时,缺血/再灌注24小时、3天、6天、12天)c AMP和VEGF的阳性表达进行对比,分析不同组间c AMP和VEGF阳性水平,讨论脑脉通治疗ICVD机理;3对常规治疗组及脑脉通组患者入院当天、治疗14天、28天NIHSS量表、中医症状分级(气虚血瘀证)量表评分并予以统计互比,讨论脑脉通治疗ICVD、改善患者预后的中西医综合疗效。方法:1选用Longa 8分制法(进行一定改进)评测青年ICVD小组和老年ICVD小组大鼠于病情进展不同时刻(缺血3小时,缺血/再灌注24小时、3天、6天、12天)神经功能障碍;光镜观测互比青年ICVD小组和老年ICVD小组大鼠于病情进展不同时刻(缺血3小时,缺血/再灌注24小时、3天、6天、12天)病理形态学改变;2选用免疫组化法处理动物切片,后光镜观察对比青年ICVD大鼠组、老年ICVD大鼠组、尼莫地平组及脑脉通组在病情进展不同时刻(缺血3小时,缺血/再灌注24小时、3天、6天、12天)c AMP和VEGF的阳性水平;3选用NIHSS量表、中医症状分级量表评分评估入组患者基线期(第0天)、治疗第14天、第28天病情进展和预后改善。结果:1脑脉通可降低老年ICVD大鼠神经功能障碍评分评分结果显示:尼莫地平组与老龄ICVD大鼠组进行比较,尼莫地平组I/R 24h神经功能能障碍评分降低(P<0.05),脑脉通组I/R 24h、3d降低(P<0.05)。脑脉通组与尼莫地平组比较,脑脉通组I/R 24h、36d、12d均降低。2脑脉通可减轻老年ICVD大鼠病理形态学损伤在光学显微镜下对ICVD大鼠脑组织缺血中央区及周围血供缺少带进行观察,可以明显发现在缺血3小时后逐渐出现组织水肿,微血管及神经元周围间隙逐渐增大(见照片8)。I/R 24小时镜下可见神经元、胶质细胞坏死变性,微血管结构破坏,光镜显示明显缺血中心坏死区结构,微血管、神经元细胞间隙较I/R 3小时明显扩大(照片9)。I/R 6天时微血管、神经元细胞间隙出现缩小趋势,缺血中心区结构模糊(照片11);I/R12天时镜下神经元、神经纤维数目明显减少,病灶中央坏死液化灶逐渐形成(照片12)。较之于青年ICVD大鼠组,老龄ICVD大鼠组缺血脑组织病理损伤进展速度更快,损伤水平更高,水肿消退速度亦较为缓慢;脑脉通组及尼莫地平组病理损伤程度明显优于老年ICVD组大鼠,水肿恢复速度较快,脑脉通组效果更加明显(照片14-24)。3脑脉通提高老年ICVD大鼠c AMP表达水平免疫组化观察结果提示:较之青年假手术组c AMP阳性水平,青年ICVD大鼠组各时间点均减弱,青年ICVD大鼠组I 3h、I/R 24h、3 d、6d、12 d的c AMP阳性水平均降低(P<0.05,P<0.01)。较之老年假手术组c AMP阳性水平,老龄ICVD大鼠组各时间点均减弱,老龄ICVD大鼠组I 3h、I/R 24h、3 d、6 d、12 d的c AMP阳性表达均降低(P<0.05,P<0.01)。老龄ICVD大鼠组c AMP阳性水平整体随缺血时间延长而逐渐低落,与I/R 3d时达到谷值后逐渐呈现缓慢上升,I/R6 d、12d时上升明显(P<0.05)。比之老龄ICVD大鼠组各时刻,尼莫地平组I 3h、I/R24h、3 d、6 d、12 d的c AMP阳性表达均升高(P<0.05,P<0.01)。比之老龄ICVD大鼠组各时刻,脑脉通组I 3h、I/R 24h、3 d、6 d、12 d的c AMP阳性表达均升高(P<0.05,P<0.01)。比之尼莫地平组各时刻,脑脉通组I 3h、I/R 24h、3 d、6 d、12 d的c AMP阳性表达均升高(P<0.05,P<0.01)。4脑脉通提高老年ICVD大鼠VEGF表达水平免疫组化观察结果提示:较之青年假手术组VEGF阳性水平,青年ICVD大鼠组各时刻VEGF阳性水平均上升,青年ICVD大鼠组I 3h、I/R24h、3 d、6 d、12 d的VEGF阳性水平均上升(P<0.05,P<0.01)。较之老年假手术组VEGF阳性水平,老龄ICVD大鼠组各时刻均有明显上升,老龄ICVD大鼠组I 3h、I/R 24h、3 d、6 d、12 d的VEGF阳性表达均上升(P<0.05,P<0.01)。青年ICVD大鼠组VEGF阳性水平随缺血时间延长逐步上升,与I/R 3d时达到最高后维持较高程度。老龄ICVD大鼠组VEGF阳性水平随缺血时间逐步上升,与I/R 24h时达到最高后维持较高程度。比之老龄ICVD大鼠组各时刻,尼莫地平组I 3h、I/R 24h、3d、6 d、12 d的VEGF阳性表达均升高(P<0.05,P<0.01)。比之老龄ICVD大鼠组各时刻,脑脉通组I 3h、I/R 24h、3 d、6 d、12 d的VEGF阳性表达均升高(P<0.05,P<0.01)。比之尼莫地平组各时刻,脑脉通组I 3h、I/R 24h、3 d、6 d、12 d的VEGF阳性表达均升高(P<0.05,P<0.01)。5脑脉通对老年ICVD患者神经功能障碍、中医气血运行状况的调节作用临床疗效评估结果提示:与常规治疗组相比较,治疗14天及治疗28天时脑脉通组NIHSS量表评分降低(P<0.01)。在常规治疗组14天、28天相比,脑脉通组中医症状分级量表评分都显着降低(P<0.01)。结论:1因增龄带来的中枢系统差异,老年大鼠在脑缺血后神经功能受损及病理受损程度较之青年大鼠更重,损伤进展也更快。脑脉通可明显减轻老年ICVD大鼠病理受损程度、改善神经功能障碍,与其推动脑内微血管新生、缓解能量代谢障碍有关;2老龄大鼠脑缺血后,缺血中心区及半暗带周边可发现c AMP阳性表达减弱,缺血初期(I3h-24h)随时间进行迅速降低,于I 24h时出现谷值,后缓慢回升。脑脉通通过加强c AMP在I/R不同时刻的水平,促进ICVD大鼠微血管的新生。3老龄大鼠正常状态下脑组织VEGF全脑可见、表达量较少。脑缺血后,缺血中央区可发现VEGF阳性显示,I 3h-24h逐渐增强,于I 3d时出现峰值,后缓慢回落。该特点可能为缺氧诱导因子(HIF)引发VEGF大量生成所导致。脑脉通通过增强VEGF在I/R不同时刻的水平,促进ICVD大鼠微血管的新生。
参考文献：
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[2]. 基于调节GSK3β、JNK的脑脉通对I/R老龄大鼠脑微血管生成的实验研究与临床疗效评价[D]. 翟水红. 河南中医药大学. 2016
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[4]. 基于调节CREB、p-CREB的脑脉通对I/R老龄大鼠脑微血管生成的实验研究与临床疗效评价[D]. 皮建彬. 河南中医药大学. 2017
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[6]. 基于调节SDF-1α/CXCR4轴的脑脉通对脑缺血/再灌注老龄大鼠脑微血管生成机制研究[D]. 陶录岭. 河南中医学院. 2014
[7]. 脑脉通对老龄大鼠脑缺血/再灌注微血管基底膜损伤的保护作用[D]. 刘轲. 北京中医药大学. 2004
[8]. 基于调节cAMP、VEGF的脑脉通对I/R老龄大鼠脑微血管生成的实验研究及临床观察[D]. 刘昊飞. 河南中医药大学. 2017
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