吴胜勇[1]2004年在《应用组织芯片研究耐药相关基因在肺癌中的表达及临床意义》文中研究指明目的：构建组织芯片，研究耐药基因蛋白P-gp、MRP、LRP和谷光苷肽硫转酶GST-π在肺癌组织中的表达及意义。方法：采用组织芯片技术制作226例肺癌组织及23例正常肺组织芯片，并用S-P法免疫组化检测组织芯片中耐药基因蛋白P-gp、MRP、LRP和谷光苷肽硫转酶GST-π的表达。结果：在226例肺癌组织中P-gp、MRP、LRP和GST-π表达的阳性率分别为46.0％、42.0％、54.4％、62.4％，与正常肺组织差异显着(P＜0.001)，中、高分化与低分化、非小细胞癌与小细胞癌差别显着(P＜0.05)；P-gp、MRP、GST-π的阳性率由高到低为腺癌、鳞癌、小细胞癌，相对应临床化疗敏感性由低到高；化疗病例高于未化疗者，差别显著(P＜0.05)；术后复发转移的阳性率高于无复发转移者，MRP、LRP虽然也高于后者，但统计学上无意义(分别x~2=3.08及1.37，P＞0.05)；各阳性表达在肺癌患者的性别、年龄、肿瘤大小、临床分期中无明显差异(P＞0.05)。结论：肺癌耐药由多基因及多途径参与发生，联合检测肺癌组织中耐药相关基因的表达有助于判断化疗疗效及预后。应用组织芯片大规模高效检测肺癌组织样本是可行的。
吴胜勇, 吴佩宁, 张绍明, 段德溥[2]2008年在《应用组织芯片研究肺癌多药耐药相关基因的表达及临床意义》文中认为背景与目的:肺癌的耐药性是影响肺癌化疗效果的重要因素,但是到目前为止,尚无有效的解决办法。本研究旨在通过检测耐药基因蛋白P-糖蛋白(P-gp)、多药耐药相关蛋白(MRP)、肺耐药相关蛋白(LRP),谷胱甘肽硫转酶(GST-π)在肺癌组织中的表达,探讨耐药基因间的相互关系及在临床中对肺癌诊断、治疗及患者预后的意义。方法:采用组织芯片技术制作226例肺癌组织及23例正常肺组织芯片,并用S-P法免疫组化检测组织芯片中耐药基因蛋白P-gp、MRP、LRP和GST-π的表达。结果:在226例肺癌组织中P-gp、MRP、LRP和GST-π表达的阳性率分别为46.0%、42.0%、54.4%、62.4%,正常肺组织中分别为17.4%、13.0%、17.4%、21.7%,两组间差异有显着性(P<0.001);中高分化非小细胞癌与低分化非小细胞癌、非小细胞癌(NSCLC)与小细胞癌(SCLC)相比,差异有显着性(P<0.05),其中中高分化非小细胞癌的阳性表达分别为59.7%、58.1%、73.6%、79.1%,低分化非小细胞癌分别为33.3%、22.8%、33.3%、47.4%,非小细胞癌分别为51.6%、47.3%、61.3%、69.4%,小细胞癌分别为20.0%、17.5%、22.5%、30.0%;P-gp、MRP、GST-π的阳性率由高到低依次为腺癌、鳞癌、小细胞癌,相对应临床化疗敏感性由低到高;术前化疗病例(84.1%、61.9%、69.8%、93.7%)高于未化疗者(31.3%、34.4%、48.5%、50.3%),两组间差异有显着性(P<0.05);术后复发转移的P-gp和GST-π阳性率(55.7%、71.1%)高于无复发转移者(31.4%、47.1%),MRP、LRP虽然也高于后者,但差异无显着性(分别χ2=3.08及1.37,P>0.05)。结论:肺癌耐药由多基因及多途径参与发生,联合检测肺癌组织中耐药相关基因的表达有助于判断化疗疗效及预后。应用组织芯片大规模高效检测肺癌组织样本是可行的。
于文娟[3]2007年在《应用非小细胞肺癌组织芯片检测P-gp、LRP、MRP和GST-π的表达及其临床意义》文中研究表明目的探讨非小细胞肺癌(NSCLC)中P-糖蛋白(P-gp)、肺耐药相关蛋白(LRP)、多药耐药相关蛋白(MRP)和谷胱甘肽转移酶S(GST-π)的表达及新辅助化疗对其表达的影响和临床意义。方法应用组织芯片及图像定量分析技术，对92例NSCLC标本(其中52例未经化疗的直接手术标本，20例同时具备化疗前活检标本和化疗后手术标本)中P-gp、LRP、MRP和GST-π的表达进行检测。结果未经化疗NSCLC标本P-gp、LRP、MRP、GST-π表达的阳性率分别为65.22％、76.09％、81.52％、84.78％。未经化疗标本，P-gp、LRP和GST-π在腺癌中的表达水平均高于鳞癌(P＜0.05，P＜0.001，P＜0.001)，在低分化癌中表达水平低于高分化癌，且随分化程度的降低表达水平降低(均为P＜0.05)；MRP表达与组织学类型及分化程度无关(P＞0.05)；P-gp、LRP、MRP和GST-π表达水平均与患者年龄、肿瘤大小、临床分期及有无淋巴结转移无关(P＞0.05)。新辅助化疗后，P-gp、GST-π平均光密度与积分光密度在不同临床分期、组织学类型、分化程度、肿瘤大小、年龄以及淋巴结有无转移组中，均高于化疗前(P＜0.05或P＜0.001)；而上述各组中LRP、MRP平均光密度与积分光密度在新辅助化疗前、后均无显着性差异(P＞0.05)。结论(1)化疗前P-gp、LRP和GST-π在NSCLC的表达水平与组织学类型及分化程度有关；(2)同体新辅助化疗后NSCLC组织中P-gp、GST-π表达较化疗前明显增加，新辅助化疗可能通过诱导耐药蛋白的表达增加肺癌组织的获得性耐药性；(3)新辅助化疗的采用与否应视不同病人的具体情况而定，Ⅰ-Ⅱ期NSCLC采用新辅助化疗应慎重，以免影响术后化疗效果；(4)检测NSCLC新辅助化疗前、后耐药蛋白的定量表达，对术前及术后个性化化疗方案的选择和实施具有重要的指导意义。
张一帆[4]2016年在《RPS15A在非小细胞肺癌谷氨酰胺代谢途径中的调控作用》文中提出研究背景：在全球范围内肺癌是人类发病率及致死率最高的恶性肿瘤。其中非小细胞肺癌占所有肺癌病例近85%,肺腺癌为最常见的病理类型之一。近年来由于外科技术及新辅助放化疗的普及应用,为肺癌的临床治疗提供了新的策略,但非小细胞肺癌患者的预后仍未得到根本改善,其5年生存率仅为14%-17%。从分子水平上深入认识肿瘤细胞的发生发展依然是胸外科学函待解决的重要课题,有助于为我们发展抗癌新策略和靶点分子提供重要的理论依据。肿瘤的发生发展过程涉及一系列重要分子和信号通路,如BRCAl,Kras蛋白、P53信号途径、PI3K/AKT/mTOR信号通路等。这些分子及其信号通路的异常调控可使肿瘤细胞获得恶性行为能力,如异常增殖能力,抗细胞凋亡机制,肿瘤的侵袭转移能力,在此过程中核糖体功能的异常活跃对肿瘤细胞快速合成增殖及其他恶性表型所需的功能蛋白尤为重要核糖体是蛋白质合成场所,在真核细胞中为80S,包括60S的大亚基和40S的小亚基,均由核糖体RNA (rRNA)和核糖体蛋白(Ribosomal Protein, RP)构成。迄今,人们已发现约80种真核细胞核糖体蛋白,这些核糖体蛋白中大多数通过与rRNA的特定区域以非共价键结合,从而在翻译过程中调控蛋白质合成。近年来有大量研究报道核糖体蛋白的核糖体外功能,如在DNA修复,分化,组织发育,细胞凋亡及转录调控等细胞生理活动中,核糖体蛋白具有重要的调控作用。而某些核糖体蛋白的异常调控被发现与人类恶性肿瘤的发生发展密切相关。例如,核糖体蛋白RPL22过表达与非小细胞肺癌的发生发展密切柑关,而RPSL26与RPLL29的下调可显着抑制胰腺癌细胞的增殖。RPS15A是进化上呈高度保守的基因,在人类基因组中位于16p12.3,负责编码核糖体40S小亚基的核心部件-RPS15A蛋白。在肽链合成起始阶段,RPS15A通过与真核翻译起始因子eIF-4F相互作用,从而促进]mRNA与核糖体的结合形成起始复合物。在植物组织中RPS15A蛋白在分裂活动旺盛的未成熟组织中呈高表达,而在已分化发育成熟的细胞中表达水平明显降低,以上研究结果表明：RPS15A对于细胞增殖具有促进功能。此外,在酵母细胞中,RPS15A的过表达可逆转cdc33基因(在酵母细胞中编码eIF-4F)突变诱导的G1/S期细胞周期阻滞,表明RPS15A可促进细胞周期的过度。最近,在乙型病毒性肝炎的相关研究中发现：RPS15A的过表达促进细胞周期过度,加快肝细胞增殖,介导肝细胞炎癌转变进程。而RNAi介导的RPS15A下调则显着抑制肝癌细胞增殖,表明RPS15A与肝癌发生密切相关。此外,在早期的研究中发现RPS15A为转化生长因子β1 (TGF-β1的下游应答因子之一。这些结果均表明：rpal5a基因的调控异常与肿瘤细胞的发生发展有密切的相关性,但该基因在肺癌中的功能作用及其分子机制,迄今尚未见报道。研究方法：临床相关性研究：为了探讨RPS15A蛋白表达与非小细胞肺癌发生的临床相关性,我们应用了组织芯片,通过免疫组化分析,对微阵列中RPS15A的蛋白表达情况进行统计学分析。我们收集了2005年7月至2011年12月在吉林大学第二医院胸外科接受肺癌根治术的75例肺腺癌患者的组织样本。本研究中所涉及的临床相关性研究工作均得到吉林大学第二医院伦理委员会的许可,并征得患者知情同意书。该研究所用的标本所述患者均无术前放、化疗史。同时,我们收集了癌旁组织作为实验对照组。为了高通量分析组织样本中RPS15A蛋白的表达情况,我们应用了组织芯片技术,对150例组织样本(75例癌组织及75例癌旁正常组织)进行免疫组化检测。收集的组织样本由上海卓立生物技术有限公司制备肿瘤组织芯片。进行免疫组化检测时将组织芯片从冰箱中取出放置于玻片架上复温至室温,然后60℃左右烘烤3小时,将表面的封蜡融掉。组织芯片脱蜡、水化、抗原热修复,免疫组化染色,显微照相系统处理结果。阴性对照组置于无一抗的溶液中。由吉林大学第二医院病理科及中心实验室叁位老师负责对免疫组化结果进行独立分析。体外水平恶性功能表型实验：为了在体外水平检测RPS15A在肺癌细胞的恶性行为能力的功能作用,我们选取不同肺癌细胞系,包括肺腺癌细胞系H1299和A549,肺鳞状细胞癌SK-MES-1细胞系以及小细胞肺癌细胞系H1688。RNA干扰技术,作为功能基因组学强有力的工具,为我们探索肿瘤相关基因提供了新的方法。为了获得RPS15A下调的稳转细胞,在本课题中我们通过分子生物学克隆技术构建含有RPS15A特异性shRNA片段的慢病毒质粒。经测序结果分析后,将含有shRNA慢病毒质粒与其他包装质粒共转染至293T细胞中,48小时后收集病毒悬液,得到含有shRPS15A的慢病毒,命名为Lv-shRPS15A。病毒阴性对照组为Lv-shCon。随后将收集的病毒以10和20的病毒滴度值感染肺腺癌细胞系H1299和A549细胞。为了验证病毒转染效率及RPS15A基因下调水平,我们在荧光显微镜中观察细胞中GFP荧光表达情况,并应用实时定量PCR检测RPS15A基因mRNA水平。RPS15AmRNA表达水平通过与内参GAPDH进行相对计算。随后我们运用western blotting方法检测病毒转染前后的RPS15A蛋白质水平。为了探讨RPS15A的表达水平是否影响肺腺癌增殖能力与克隆形成能力,我们在指数生长的癌细胞中进行了MTT增殖实验及克隆形成实验。为了检测RPS15A下调对细胞凋亡及细胞周期分布情况,我们运用流式细胞术检测凋亡细胞及处于不同细胞周期的肿瘤细胞。功能基因下游机制实验：为了探究RPS15A影响肺腺癌恶性行为能力的分子机制及其下游调控因子,我们应用cDNA表达谱芯片检测RPS15A下调引起的基因表达变化。通过对显着变化的基因进行聚类分析,初步了解RPS15A沉默对其他基因的调控作用。随后我们将数据上传到KEGG (Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes)数据库,对基因谱表达变化进行通路聚类分析。为了验证RPS15A诱导的基因表达调控,我们通过Western Blotting方法检测了通路中关键因子的表达水平。研究结果RPS15A在肺腺癌组织中异常高表达：为了检测RPS15A的临床相关性,我们应用组织芯片技术在75例肺腺癌患者样本中进行免疫组化染色。我们发现RPS15A主要表达于细胞浆内。在癌组织与癌旁组织中RPS15A阳性率分别为66.7%(50/75)和42.7%(32/75)。RPS15A在癌组织与癌旁组织中的表达具有统计学差异(P<0.001),表明RPS15A在癌组织中显着高表达。随后我们将肺癌组织样本依据患者的临床特征性指标分组,并与RPS15A表达水平进行相关性分析。我们的数据分析表明RPS15A与患者的年龄,肿瘤病理分级,TNM分期,肿瘤大戏及淋巴结转移发生无显着性差异。为了探讨RPS15A表达水平是否与肺腺癌患者的预后相关,我们绘制了Kaplan-Meier生存曲线。Kaplan-Meier生存曲线显示RPS15A与患者生存期无显着相关性。慢病毒诱导的RPS15A基因表达下调：我们通过实时定量PCR检测了不同肺癌细胞系中RPS15A基因的基础表达水平。我们发现RPS15A的mRNA在癌组织中均有显着的表达,均高于内参GAPDH的表达。如上文所述,我们通过叁质粒包装体系,收集到含有RPS15A特异性shRNA的慢病毒,并转染肺腺癌细胞系。为了检测慢病毒介导的RPS15A下调效率,在转染72小时后我们在荧光显微镜中观察了GFP蛋白表达,发现逾80%的肿瘤细胞。随后,我们应用实时定量PCR方法和western blotting实验检测该基因在mRNA及蛋白水平的下调情况。结果发现被Lv-shRPS15A转染的A549和H1299细胞中RPS15A被显着下调。这些实验结果均表明慢病毒转染Lv-shRPS15A诱导肿瘤细胞中RPS15A沉默。RPS15A敲减抑制肺癌细胞恶性增殖能力及克隆形成能力：在MTT实验中我们发现从病毒转染48h,72h,96h以及120 h后,肺腺癌细胞H1299及A549细胞的增殖能力与对照组相比显着降低,表明RPS15A下调抑制肿瘤细胞的增殖能力。同样,在克隆形成实验中被Lv-shRPS15A转染的细胞与对照组相比起克隆形成能力显着降低,表现为克隆形成数量与克隆大小等,表明RPS15A沉默削弱肿瘤细胞克隆形成能力。RPS15A沉默触发肿瘤细胞发生凋亡及细胞周期阻滞：为了初步了解RPS15A对肺腺癌细胞H1299及A549细胞凋亡的影响,我们应用流式细胞分析仪,检测被Annexin V-APC染色的细胞。流式细胞分析结果显示RPS15A下调触发细胞发生凋亡。同时我们检测了RPS15A敲减后肿瘤细胞在不同细胞周期中的分布情况。我们发现RPS15A引起细胞周期阻滞,表现为G0/G1期和S期细胞百分比显着升高。由此我们提出RPS15A沉默可以诱导细胞发生凋亡及细胞周期阻滞,藉此抑制肿瘤细胞的恶性增殖及克隆形成能力。RPS15A下调激活肿瘤细胞P53信号通路,并改变细胞谷氨酰胺代谢途径中调控因子的表达水平：如上文所述,为了研究RPS15A沉默抑制肺癌细胞的分子机制,我们应用基因表达谱芯片,对受RPS15A调控的下游基因进行检测分析。我们的结果表明RPS15A在肿瘤细胞中的沉默导致了885种基因的表达上调和566种基因的下调。随后我们进行GO基因功能分子聚类分析发现受RPS15A基因调控的基因多属于在细胞中参与蛋白合成及生物聚合体、大分子代谢产物的基因。功能上这些基因主要参与DNA结合,阳离子结合及酶蛋白的活性调控的细胞生理活动。KEGG信号通路富集分析结果显示RPS15A沉默可诱导P53信号通路的激活。为了验证表达谱芯片中受到RPS15A调控基因的变化,我们进行了western blotting实验检测了P53信号通路中的关键因子。Western blotting实验结果表明RPS15A沉默显着抑制了SESN2的表达,同时上调了P21和TP5313的表达水平。这些数据与基因表达谱芯片结果一致。此外,基因表达谱芯片结果显示,RPS15A调控ATF4下游蛋白及谷氨酰胺调控途径中关键因子的表达。研究总结深入了解肿瘤发生发展的分子机制,无疑对我们寻找最佳治疗方法具有重要意义。此外,目前有大量证据表明,对其分子机制深入研究可以促进开发出特异性杀伤恶性细胞的靶向治疗药物。这种新的治疗技术旨在肿瘤分子生物学的理论基础上,与肿瘤相关的特异性分子作为靶点,对其进行治疗,相对于肿瘤的传统治疗手段具有其独特的优势。因此在分子水平上深入认识肺癌发生发展的分子机制是现阶段针对非小细胞肺癌的靶向治疗函待解决的重要问题。早期在斑马鱼模型的研究中人们发现很多核糖体蛋白与肿瘤发生密切相关。核糖体蛋白广泛表达于机体绝大部分组织细胞内,在进化过程中高度保守。在蛋白质翻译早期阶段核糖体蛋白与核糖体RNA相互作用,组成核糖体,为蛋白质合成提供重要场所。值得注意的是,近年来有大量研究报道核糖体蛋白的核糖体外功能,如在DNA修复,分化,组织发育,细胞凋亡及转录调控等细胞生理活动中核糖体蛋白具有重要的调控作用。而某些核糖体蛋白的异常调控被发现与人类恶性肿瘤的发生发展密切相关。例如,核糖体蛋白RPL22过表达与非小细胞肺癌的发生发展密切相关,而RPSL26与RPLL29的下调可显着抑制胰腺癌细胞的增殖。作为核糖体20S亚基的组成元件,RPS15A在翻译起始阶段可以与核糖体RNA相互作用共同催化翻译起始复合物的形成。最近有研究表明在肝细胞中敲减RPS15A的mRNA表达水平可以显着抑制肝癌细胞生长能力,表明RPS15A在肝癌发展进程中扮演着重要的角色。然而迄今尚未报道RPS15A在肺癌中的调控作用及其分子机制。为了检测RPS15A在肺腺癌组织中的表达水平,我们收集了75例癌组织与癌旁组织制备组织芯片,我们的为了检测RPS15A的临床相关性,我们应用组织芯片技术在75例肺腺癌患者样本中进行免疫组化染色。在癌组织与癌旁组织中RPS15A阳性率分别为66.7%(50/75)和42.7%(32/75)。RPS15A在癌组织与癌旁组织中的表达具有统计学差异(P<0.001),表明RPS15A在癌组织中显着高表达。随后我们通过叁质粒包装体系,收集到含有RPS15A特异性shRNA的慢病毒,并转染肺腺癌细胞系。通过MTT实验,我们发现RPS15A下调抑制肿瘤细胞的增殖能力。同样,在克隆形成实验中被Lv-shRPS15A转染的细胞与对照组相比起克隆形成能力显着降低,表现为克隆形成数量与克隆大小等,提示RPS15A沉默削弱肿瘤细胞克隆形成能力。此外,流式细胞分析结果显示RPS15A下调触发细胞发生凋亡。同时我们检测了RPS15A敲减后肿瘤细胞在不同细胞周期中的分布情况,发现RPS15A引起细胞周期阻滞,表现为G0/G1期和S期细胞百分比显着升高。为了研究RPS15A沉默抑制肺癌细胞的分子机制,我们应用基因表达谱芯片,检测受RPS15A调控的下游基因。KEGG信号通路富集分析结果显示RPS15A沉默可诱导P53信号通路的激活。为了验证表达谱芯片中受到RPS15A调控基因的变化,我们进行了western blotting实验检测了P53信号通路中的关键因子。Western blotting实验结果表明RPS15A沉默显着抑制了SESN2的表达,同时上调了P21和TP5313的表达水平。这些数据与基因表达谱芯片结果一致。此外,同时,我们还发现RPS15A沉默引起蛋白质翻译功能相关基因的下调,并抑制ATF4下游靶基因及谷氨酰胺代谢过程中起着重要调控作用的tRNA合成酶及氨基酸运载体的表达水平。ATF4,又名CREB2 (cAMP反应元件结合蛋白2),是ATF/CREB蛋白家族中的重要成员。ATF4基因的mRNA广泛存在于机体内,当细胞处于氧化应激和氨基酸缺失及内质网应激等应激状态时,ATF4蛋白表达上调,并通过激活自身转录活性,诱导参与氨基酸代谢和氧化还原反应的靶基因表达上调。其下游靶基因包括谷氨酰胺代谢途径重要酶类蛋白调控因子ASNS, PCK2, GPT2, PHGDH, PSPH蛋白和tRNA合成酶CARS, GARS, MARS及氨基酸运载体SLC1A3, SLC1A4, SLC1A5等,均在细胞谷氨酰胺代谢途径中起着重要的调控作用。其中ASNS作为ATF4直接下游靶点,反应ATF4的转录活性34。如上文所述,在前期工作中我们发现RPS15A抑制ATF4下游靶基因的表达,并上调P53信号通路中关键调控因子的转录水平。基于以上研究结果分析,我们提出：RPS15A在肿瘤细胞氨基酸代谢过程中扮演着重要角色,在肿瘤细胞中往往过表达,并参与调控肿瘤细胞异常的谷氨酰胺代谢途径；通过开关效应,即RPS15A基因的下调抑制ATF4的表达或削弱其转录活性,从而阻断肿瘤细胞异常的谷氨酰胺代谢旁路激活,而同时特异性激活P53信号途径,藉此达到抑制肿瘤细胞的增殖及其他恶性行为能力。
李赟[5]2010年在《ERCC1、BRCA1、Ki67在肺癌组织芯片中的表达和生物学意义》文中研究指明目的：应用组织芯片技术和免疫组织化学方法检测ERCC1、BRCA1和Ki67在不同进展阶段肺癌中的表达,探讨它们在肺癌发生、发展、预后中所起的作用和相关的分子机制,为临床病理诊断、预后估计和治疗提供一定的理论依据。方法：组织芯片共计270点,包括实验组原发性肺癌89例,淋巴结转移性肺癌12例,肺癌癌前病变12例,对照组正常肺组织10例。应用免疫组织化学Envision法检测组织芯片中ERCC1、BRCA1和Ki67的表达,分析其与临床病理学参数的关系及彼此之间的关系。所有数据用SPSS11.5统计软件包处理。结果：1. ERCC1在原发性肺癌组和癌前病变组的阳性率均显着高于正常组(P<0.05)。ERCC1在周围型肺癌中表达阳性率高于中央型(P<0.05),高+中分化组高于低+未分化组(P<0.05),Ⅰ+Ⅱ期表达高于Ⅲ+Ⅳ期(P<0.05),差异均有统计学意义(P<0.05)。2.BRCA1在原发性肺癌组和癌前病变组的阳性率均高于正常组,差别有统计学意义(P<0.05)。BRCA1在NSCLC中的表达阳性率明显高于SCLC中的表达(P<0.05),高+中分化组表达阳性率高于低+未分化组(P<0.05),Ⅰ+Ⅱ组表达高于Ⅲ+Ⅳ组(P<0.05),差异均有统计学意义(P<0.05)。3.Ki67在原发性肺癌组的阳性率高于正常组和癌前病变组,差别有统计学意义(P<0.05)。Ki67在低+未分化组阳性率高于高+中分化组(P<0.05),淋巴结转移组阳性率高于无淋巴结转移组(P<0.05),差别均有统计学意义(P<0.05)。4.ERCC1在肺癌中的表达与BRCA1呈正相关(P<0.05),而BRCA1与Ki67的表达呈负相关(P<0.05)。结论：1.ERCC1在肿瘤不同阶段作用不同。ERCC1在原发性肺癌组和癌前病变组的阳性率均显着高于正常组,提示ERCC1的高表达促进了肺癌的发生和发展,在肺癌发生的早期阶段存在DNA修复基因的表达增加。ERCC1的表达与肺癌的肉眼类型、分化程度和临床分期有关,分化程度越差,TNM分期越高,ERCC1表达阳性率越低,提示ERCC1低表达患者肿瘤有较高的侵袭性及预后不良,可作为估计预后的参考指标。2.原发性肺癌组和癌前病变组BRCA1的阳性率均高于正常组,提示BRCA1的表达与肺癌的发生、发展密切相关,肺癌组织中BRCA1的异位表达降低了其对DNA损伤的修复作用。BRCA1在SCLC中的表达明显低于其在NSCLC中的表达,提示BRCA1可以作为鉴别SCLC和NSCLC的指标,同时提示SCLC和NSCLC的发生、发展机制不同。随着肺癌分化程度降低,临床分期增高,BRCA1蛋白阳性表达率降低,提示BRCA1蛋白表达下降可能与肺癌的恶性程度相关,BRCA1可能有抑制肿瘤细胞增殖的作用。3.Ki67在原发性肺癌组的阳性率高于正常组和癌前病变组,提示Ki67表达升高在肺癌的发生和发展中起到重要作用。Ki67的表达与肺癌的分化程度、有无淋巴结转移有关,提示Ki67表达升高能促进肿瘤细胞的恶性转化和肿瘤的浸润、转移,可以作为估计预后的参考指标。4.ERCCl和BRCAl的表达呈显着正相关,提示ERCC1和BRCA1可能共同参与DNA损伤修复过程,影响肿瘤的发生和发展,同时对估计预后和指导术后辅助治疗有重要作用。BRCA1和Ki67表达呈负相关,提示Ki67的异常表达引起BRCA1的丢失,从而引起肺癌的发生及发展。叁者相关性研究为进一步揭示肿瘤发生、发展的有关机制及治疗提供理论依据。5.组织芯片具有高通量、高效率、节省试剂和时间等优点,并且使各组织的实验条件相同,减少了实验误差,在大样本试验中具有明显优势。
潘泓[6]2007年在《非小细胞肺癌术后化疗相关基因的临床与基础研究》文中提出研究背景恶性肿瘤是目前危害人类健康最严重疾病之一。近二十年全国性死亡原因调查显示,死亡率上升幅度最大的是肺癌。目前肺癌的治疗一般采用手术、化疗、放疗、免疫治疗等综合措施,其中化疗作为全身性治疗手段,在恶性肿瘤的治疗中具有手术和放疗不能替代的地位。经过长期的临床经验总结和一些大规模临床随机对照研究,已经达成共识,对完全性切除术后的晚期非小细胞肺癌给予以铂为主的术后辅助化疗能够提高患者的生存率,但对于早期的非小细胞肺癌是否给予术后辅助化疗尚存在争议。一些研究认为对于早期的非小细胞肺癌给予术后辅助化疗可以使3年生存率提高3%,使5年生存率提高5%,建议对完全性切除术后的早期非小细胞肺癌给予以铂为主的术后辅助化疗。而另外一些研究发现对完全性切除术后的早期非小细胞肺癌给予术后辅助化疗,不能提高患者的生存率,反而增加了毒性反应和经济负担。我们认为影响非小细胞肺癌术后辅助化疗效果的原因是患者本身的分子机制不同所致。本研究重心是寻找影响非小细胞肺癌术后辅助化疗效果的分子标志物,建立一个判断非小细胞肺癌术后辅助化疗效果的分子模型以指导早期非小细胞肺癌的术后治疗。并且针对一个有意义的分子指标进行深入研究,探索其作为非小细胞肺癌靶向治疗的潜能。本研究许多内容在国内尚未有相关报道,为探索性实验,本研究主要由5部分组成。研究内容第一部分非小细胞肺癌术后辅助化疗的疗效观察目的:通过本院近10年的临床资料,分析术后辅助化疗在完全性切除术后的非小细胞肺癌中的意义,并用循证医学方法了解术后辅助化疗在完全性切除术后的早期非小细胞肺癌中的意义。方法:回顾性分析近10年在本院行根治性切除的542例非小细胞肺癌的临床资料,其中268例是Ⅲ期NSCLC,274例是Ⅰ、Ⅱ期NSCLC。通过Medline、CNKI、VIP数据库查找关于早期NSCLC行术后辅助化疗临床随机对照研究,用Review Manager4.2软件进行统计学分析。结果:从本院资料分析显示:对切除术后Ⅲ期NSCLC患者进行3～4周期,以顺铂为基础的化疗方案的辅助化疗,可以提高长期生存率;对根治切除术后Ⅰ、Ⅱ期NSCLC患者不需常规进行辅助化疗。Meta分析显示:共16项研究纳入分析,早期NSCLC完全切除术后加用含铂的辅助化疗方案,不能显着提高患者的生存率。结论:寻找分子标志物以指导早期非小细胞肺癌的术后治疗是一个有意义且亟待解决的研究课题。第二部分多基因蛋白表达判断早期非小细胞肺癌术后化疗疗效的探讨目的:目前研究认为与癌症化疗相关的基因有以下六类:(1)药物动力学相关基因;(2)各种生物酶相关基因;(3)DNA损伤与修复相关基因;(4)凋亡相关基因;(5)致癌、抑癌基因;(6)细胞增殖、转移相关基因等,本部分是分析其中的30个基因在早期NSCLC中表达情况,寻找与早期NSCLC术后化疗效果密切相关的基因,通过Logistic回归分析获得一组分子指标以指导早期非小细胞肺癌的术后治疗。方法:利用组织芯片(tissue microarray,TMA)技术和免疫组织化学二步法,对86例行术后辅助化疗的早期非小细胞肺癌标本进行Caspase-3、Fas、Bax、Bcl-2、Survivin、PCNA、Ki67、MGMT、P53、P63、P73、P16、P27、VEGF、nm23、P-gp、MRP、LRP、GST-π、TopoⅡ、C-myc、Cyclin-D1、Her-2、Cox-2、Ku70、Ku80、DNA-PKcs、ERCC1、MSH2、BCRP30种化疗相关蛋白检测。结果:30种化疗相关蛋白在肺癌组织中表达的阳性率为27.9%至91.9%不等。经过单因素分析,与早期NSCLC术后化疗效果密切相关的基因有8个,Survivin、P-gp、LRP、Ki67、P53、ERCC1高表达,NSCLC术后化疗效果差;Bax、VEGF低表达,NSCLC术后化疗效果差。通过Logistic回归分析ERCC1、Survivin、Bax、VEGF4个因子进入方程,方程分类能力达69.8%;方程有效性经卡方检验X~2=29.15,P=0.000。结论:在单因素分析中ERCC1是判断非小细胞肺癌术后辅助化疗效果最敏感的指标,可以进一步深入研究。通过多因素分析ERCC1、Survivin、Bax and VEGF是一组判断非小细胞肺癌术后辅助化疗效果,指导早期非小细胞肺癌的术后治疗的分子指标。对于其可靠性有待于扩大病例进一步研究。第叁部分ERCC1基因在肺癌组织及肺癌细胞系中表达分析目的:ERCC1是判断非小细胞肺癌术后辅助化疗效果最敏感的指标,本部分首先观察ERCC1基因在肺癌细胞系、肺癌组织与癌旁正常肺组织中表达情况,对ERCC1基因的表达特性有一定了解。然后通过耐药细胞系与亲本细胞系中ERCC1mRNA差别及分析单独行化疗的肺癌中ERCC1基因表达情况,进一步证实ERCC1基因表达与肺癌化疗的关系。方法:首先应用半定量RT-PCR方法检测6株肺癌细胞及30例肺癌组织与癌旁正常肺组织中表达情况。第二使用高浓度反复间歇诱导法建立了对多种化疗药物耐药的细胞系A549/DDP,并用RT-PCR方法检测耐药的细胞系和亲本细胞系中ERCC1表达差别。最后利用免疫组织化学法检测65例单独行化疗的NSCLC中ERCC1表达。结果:与癌旁正常肺组织相比ERCC1在肺癌组织表达明显降低。成功建立了肺癌耐药的细胞系A549/DDP,与亲本细胞A549相比其对常规化疗药物的耐药指数增加了4-5倍,ERCC1在A549/DDP表达明显高于A549细胞。在单独行化疗的NSCLC中,ERCC1表达阳性患者的化疗效果明显差于ERCC1表达阴性患者。结论:ERCC1表达降低可能与肺癌的发生有一定联系,体外细胞实验和体内临床病理分析证实ERCC1基因表达与肺癌化疗密切相关,ERCC1基因表达增高,化疗效果不佳。第四部分ERCC1基因的初步功能分析目的:ERCC1是与肺癌化疗密切相关的基因,本部分主要通过基因克隆,细胞转染的技术进一步了解ERCC1基因的生物学功能并初步探讨其引起癌细胞化疗耐受的机制。方法:首先采用基因克隆的方法构建ERCC1基因真核表达载体,用脂质体将载体转染致肺癌细胞H1299中,用G418筛选稳定转染细胞克隆,采用RT-PCR和Western-Blot技术证实ERCC1基因转染成功。第二采用细胞生长曲线,克隆形成实验,细胞侵袭实验,流式细胞仪分析细胞生长周期等方法了解ERCC1基因转染对以上细胞生物学行为的影响。第叁采用MTT法检测ERCC1基因转染对各种化疗药物毒性反应的影响。最后利用流式细胞术检测细胞膜蛋白P-gp、MRP的表达,利用高效液相色谱仪检测细胞内药物浓度,探讨ERCC1基因转染引起癌细胞化疗耐受的机制。结果:成功构建ERCC1基因真核表达载体PCDNA3.1/ERCC1,通过筛选建立了稳定转染细胞系H1299/ERCC1和H1299/Vecter。生长曲线、克隆形成实验、细胞侵袭实验、流式细胞仪分析细胞生长周期等实验显示:H1299/ERCC1和H1299/Vecter在以上实验中无差别。化疗药物毒性反应实验显示H1299/ERCC1较H1299/Vecter对顺铂的耐药指数增加4.23倍。流式细胞术检测细胞膜蛋白P-gp、MRP的表达及高效液相色谱仪检测细胞内药物浓度结果显示H1299/ERCC1和H1299/Vecter无明显差异。结论:ERCC1表达与细胞增殖、细胞侵袭、细胞周期失调等特性关系不大。ERCC1基因表达增高,细胞可以出现化疗耐药,初步研究显示ERCC1基因导致的化疗耐药并非传统的耐药机制(如膜转运蛋白表达差异)使药物摄入减少及外排增加引起,可能与DNA损伤与修复机制改变有关。第五部分RNA干扰抑制肺癌细胞ERCC1基因表达的初步功能分析目的:ERCC1基因在肺癌细胞的各种生物学行为中并不扮演重要角色,其改变主要是引起细胞对化疗药物的敏感性改变,是功能比较单一的基因,可能是提高非小细胞肺癌化疗疗效的一个有潜质的新靶点。本部分主要通过RNA干扰技术抑制肺癌细胞ERCC1基因表达,进行初步功能实验。方法:首先通过构建ERCC1基因及β-actin基因的克隆载体作为标准品,建立ERCC1基因荧光实时定量PCR检测平台。第二构建针对ERCC1基因的SiRNA真核表达载体,瞬时转染肺癌细胞A549,采用RT-PCR和Western-Blot技术证实转染细胞中ERCC1基因沉默效果良好。最后采用MTT法检测构建真核表达载体转染细胞对顺铂药物毒性反应的影响。结果:荧光实时定量PCR能够准确检测样本中ERCC1基因的mRNA表达水平。成功构建针对ERCC1基因的SiRNA真核表达载体,将其转染肺癌细胞A549,可以抑制细胞中ERCC1基因表达。RNA干扰的A549细胞较亲本细胞对顺铂的耐药指数降低了2.93倍。结论:RNA干扰是一种沉默ERCC1表达的理想方法。沉默ERCC1表达可以提高肺癌细胞的化疗敏感性,它可能是一种有潜质的肺癌辅助治疗新方法。
彭桂林[7]2016年在《Mnk2作为非小细胞肺癌的预后因子及其分子基础》文中指出研究背景和目的：肺癌近年来已跃居成为中国乃至全世界发病率及死亡率最高的恶性肿瘤,尤其是在男性肿瘤患者中所占的比例正逐年增加。肺癌的治疗效果一直不理想,主要的原因在于多数肺癌患者在就诊时已出现了转移,一般状况差,治疗手段少,而即使是能够手术的早,中期患者,术后仍有部分患者需要面临复发和(或)转移的问题。化疗药物的出现,曾经使肺癌患者找到生存的希望,但是越来越多全球性的大样本的综合数据分析发现,在没有经过筛选的肺癌患者中,化疗药物对于患者的5年生存率提高不超过10%。靶向药物治疗是近年来非常热门的治疗模式,自2003年吉非替尼(针对EGFR的酪氨酸激酶抑制剂)上市以来,越来越多的靶向治疗药物应用到临床,包括针对VEGF的贝伐珠单抗,针对ALK和ROS-1的克唑替尼等等,肺癌的治疗开启了个体化治疗的新模式。靶向药物的使用,使肺癌患者的PFS(无疾病进展时间)得到了明显的改善,提高患者的生活质量,而OS(总体生存时间)的数据仍然需要更多的大宗临床报道进行验证和补充。靶向治疗使与肺癌相关的信号通路研究越来越受到重视,而新的信号通路的发现也为靶向药物的研制提供理论基础。丝裂原活化蛋白激酶(mitogen activated protein kinases,MAPK)信号转导通路是近年来信号转导方面最活跃的研究领域之一。研究表明,MAPK信号转导通路通过影响细胞内基因的转录和调控,在细胞增殖、分化、凋亡、血管发生及肿瘤转移中发挥着重要作用,这些研究的进展有可能为肿瘤的治疗提供新的靶点。从某种意义上说,肿瘤的发生反映了肿瘤细胞增殖和死亡之间平衡的失调,肿瘤细胞常表现为抵抗凋亡和促进增殖。生长因子受体介导的MAPK信号转导途径是诸多信号途径中与细胞增殖、分化密切相关的重要信号途径之一。丝裂原活化蛋白激酶(MAPK)是细胞外各种信号从细胞表面转导到细胞核内部的重要传递者。在哺乳动物中,MAPK家族的14个成员被分成了8个亚家族。包括经典的p38 MAPK、细胞外信号调节蛋白激酶(ERK1/2)、c-jun N末端激酶(JNK1/2/3)、大丝裂原活化蛋白激酶-1(ERK5/BMK1)和不经典的ERK3、ERK4、ERK7/8和NLK等八个亚家族。这些亚族组成多条信号通路,其中p38途径、ERK1/2途径和JNK/SAPK途径是研究最为广泛和深入,也是最为重要的MAPK信号通路。Mnk (MAPK signal-integrating kinase,简称Mnk)是p38 MAPK和ERK/MAPK信号途径的共同的下游激酶,最开始被认为是ERK的亚型,分别命名为Mnk 1和Mnk2。 Mnk 1/2通过对eIF4E的磷酸化(p-eIF4E)使肿瘤细胞具有抗凋亡、促进肿瘤相关蛋白质合成等作用。Mnk2是Mnk1的同源结构。研究发现,Mnk2和Mnk1一样与eIF4G结合形成复合物,通过对eIF4E第209号位点丝氨酸的磷酸化,使elF4E更容易与mRNA5’帽子结构结合进而增加mRNA的翻译能力。与Mnkl不同的是,Mnk2通过ERK和p38MAPK a/p途径进行eIF4E的磷酸化,而不是p38MAPK和JNK途径。无论是在体外还是在体内实验,Mnk2均比Mnk1表现出更高的生物活性,而且对上游p38MAPK或ERK信号通路的抑制作用相对不敏感。真核细胞翻译起始因子(eukaryotic translation initiation factor 4E, eIF4E),是真核细胞翻译起始和调控的核心成分,通过与mRNA5'端帽子结构结合,在蛋白质翻译起始过程中发挥重要作用。研究证实,在人类的多种恶性肿瘤中均发现在癌组织以及癌旁组织中存在eiF4E的过度表达,并且与肿瘤的侵袭转移能力呈正相关。非小细胞肺癌包括细支气管肺泡癌(BAC)患者p-eIF4E在癌组织细胞的表达远高于正常组织细胞,而且在NSCLC中过表达患者的5年生存率更低,p-eIF4E可以作为患者独立的预后因素。Rosenwald等的研究发现,eIF4E表达的增加很容易促进支气管肺泡癌的赘生细胞的生长和浸润。而Seki等通过对143例周围型肺腺癌和非典型腺瘤样增生进行eIF4E的免疫组化染色,发现肺腺癌组织eIF4E的表达明显高于正常组织,而且与肿瘤的组织学和浸润程度相关。由于Mnk1/2是MAPK的下游激酶,其通过对elF4E的磷酸化使肿瘤细胞具有抗凋亡,促进细胞增殖的作用,所以Mnk1/2的表达水平能反映出肿瘤细胞抗凋亡,侵袭,增殖等方面的能力。在乳腺癌的研究中,Mnk1/2的表达水平与HER2的过表达呈正相关,是肿瘤治疗的潜在靶点。但是,目前在全球范围内并没有关于Mnk1/2与肺癌方面的相关详细报道,是否与在乳腺癌的研究中一样,Mnk1/2高表达与细胞的增殖,侵袭,抗凋亡的能力相关；Mnk1/2蛋白表达水平与临床病例特征的关系如何,能否成为肺癌的一个独立预后因素,这些都需要进行更深入的研究。由于Mnk2(主要是Mnk2A)较Mnk1有更高的生物活性,且在我们前期的实验中发现,在肿瘤标本及肺癌细胞株中Mnk2有更高的表达水平,所以是近年来的研究热点也是我们的研究重点。我们拟通过对石蜡切片,非小细胞肺癌细胞株以及移植瘤动物模型叁个方面对Mnk2进行检测,了解Mnk2在非小细胞肺癌中对预后的提示意义及其分子基础。第一章Mnk2蛋白表达水平与患者术后生存率及临床病理特征的关系研究方法：收集2006年10月至2009年6月经广州医科大学附属第一医院诊断的367例非小细胞肺癌病例的组织标本及其中117例癌旁正常肺组织。所有标本经常规HE染色,选取合适区域制作组织芯片蜡块,经免疫组化二步法检测MNK2蛋白的表达水平,按细胞着色范围及强度,根据中位数将MNK2表达水平分为低表达组及高表达组。研究结果：1.Mnk2蛋白表达定位于肿瘤细胞及支气管上皮细胞的胞浆,相对于癌旁组织,肺癌组织中Mnk2的蛋白表达水平明显升高,差异具有统计学意义(log-rank test, t=-11.397, P<0.001)。2.在367例非小细胞肺癌组织中,Mnk2蛋白高表达的有220例,高表达率为59.5%(220/367)。患者的5年总生存(OS)比率为45.74%,5年无病生存率(DFS)为43.83%。3.Mnk2低表达组(n=147)和高表达组(n=220)的OS比率分别为60.39%和36.01%,两组有显着性差异(log-rank test, X2=16.382, P<0.001); DFS比率分别为57.26%和35.04%,两组有显着性差异(log-rank test, X2= 16.982, P<0.001)。4.在早中期病例中(Ⅰ+Ⅱ期),Mnk2表达水平与病人预后有显着相关性,Mnk2低表达组(n=102)和高表达组(n=131)的5年生存率分别为67.43%和51.54%,两组有显着性差异(log-rank test, X2=5.123, P=0.024);5年无病生存率分别为66.30%和50.42%,两组有显着性差异(log-rank test, X2=5.058, P=0.025, P=0.025)。5.在晚期病例中(Ⅲ+Ⅳ期),Mnk2低表达组(n=45)和高表达组(n=89)的5年生存率分别为44.44%和13.18%,两组有显着性差异(log-rank test, X2=9.192, P=0.002);5年无病生存率分别为36.02%和12.56%,两组有显着性差异(log-rank test, X2=11.083, P=0.001)。6.在肺腺癌中,Mnk2低表达组(n=88)和高表达组(n=154)的5年生存率分别为61.22%和34.00%,两组有显着性差异(log-rank test, X2-12.255, P<0.001);5年无病生存率分别为57.79%和33.09%,两组有显着性差异(log-rank test, X2=12.041, P=0.001);而在肺鳞状细胞癌及大细胞癌中,Mnk2表达水平与患者术后生存率及无病生存率均没有相关性(P>0.05)。7.对367例病例行COX单因素回归分析表明,MNK2 (P<0.001, log-rank test)、年龄(P=0.017, log-rank test)、T分期(P=0.003, log-rank test)、N分期(P<0.001,log-rank test)及临床分期(P<0.001, log-rank test)均是非小细胞肺癌预后不良的指标。8.COX多重回归分析表明,Mnk2高表达(Hazard ratio= 1.832,95% confidence interval:1.358-2.472, P=0.003)、N分期(Hazard ratio=3.275,95% confidenceinterval:2.437-4.401, P<0.001)分别是非小细胞肺癌预后不良的独立指标之一。9.在367例病例中,应用X2检验分析显示,Mnk2的表达水平与N分期有显着相关性(P=0.008),而与年龄、性别、临床分期、组织类型、吸烟及T分期没有相关性(P>0.05)。10.检测174例非小细胞肺癌组织芯片的MNk2、eIF4E及P-eIF4E的蛋白表达,应用相关性Pearson correlation统计学分析,结果显示Mnk2与eIF4E(r=0.216, P=0.006)、P-eIF4E (r=0.241, P=0.002)的蛋白表达具有正性相关,MNK高表达伴随着eIF4E及P-eIF4E的高表达,MNK2低表达伴随着eIF4E及P-eIF4E的低表达。研究结论：1.Mnk2在非小细胞肺癌细胞组织中高表达,Mnk2蛋白定位于肿瘤细胞及支气管上皮细胞的胞浆。2.367例非小细胞肺癌患者Mnk2高表达组的生存率明显低于低表达组：3.临床分期Ⅰ-Ⅱ期(早,中期)及Ⅲ-Ⅳ期(中,晚期)非小细胞肺癌中Mnk2的表达水平与患者预后显着相关；4.肺腺癌中Mnk2的表达水平与患者预后显着相关；5.Mnk2高表达和N分期分别是非小细胞肺癌预后不良的独立指标之一;6.Mnk2的表达水平与N分期有显着相关性,而与年龄、性别、临床分期、组织类型、吸烟及T分期没有相关性。7.MNK2与eIF4E、P-eIF4E的蛋白表达具有正性相关。提示MNK2在MAPK通路中可能通过eIF4E及磷酸化eIF4E起作用。第二章MNK2在非小细胞肺癌细胞系中的表达及沉默后体外细胞功能实验研究方法：1.选择对数生长期的人非小细胞肺癌细胞株(A549、NCI-H460、NCI-H1975、 NCI-H520、NCI-H1650、SPC-A-1)以及正常支气管上皮细胞株16HBE,采用荧光定量PCR方法检测各细胞株中Mnk2的表达水平；2.Mnk2基因沉默采用化学合成的siRNA序列,序列为：sense 5'UCGUCAAGAUCAUUGAGAATT--3'及 anti-sense5'-UUCUCAAUGAUCUUGACGGTT-3',转染A549, NCI-H460及NCI-H1975细胞株;3.使用Mnk2-siRNA和Negative control进行细胞体外功能实验,包括：CCK细胞增殖实验,平板克隆形成实验以及Transwell小室体外迁移实验；研究结果：1.在非小细胞肺癌细胞株(A549、NCI-H460、NCI-H1975、NCI-H520、SPC-A-1、 NCI-H1650)及正常支气管上皮细胞株(16HBE)中,NCI-H1975的Mnk2表达水平最高。应用两独立样本t检验表明与16HBE相比,Mnk2-mRNA在非小细胞肺癌细胞株NCI-H460、NCI-H1975、NCI-H520、A549及SPC-A-1中高表达(P<0.05, Independent-Samples t test)。单因素方差分析方差齐性检(LSD)显示MNK2在非小细胞肺癌细胞株及正常支气管上皮细胞株中的表达有显着差异(P*<0.001,F*值=43.494,)。2.免疫荧光检测非小细胞肺癌细胞株(A549、H1975、H460、SPC-A-1、H1650)及正常支气管上皮细胞株(16HBE)中Mnk2的蛋白表达水平,结果显示Mnk2在H1975、H460、A549叁个细胞株中表达上调。而相对于16HBE,在SPC-A-1、H1650细胞中的表达降低。3.免疫印迹检测非小细胞肺癌细胞株H1975、H460、SPC-A-1、H1299、H1650)及正常支气管上皮细胞株(16HBE)中Mnk2的蛋白表达水平,结果显示Mnk2在H1975、H460、A549、H1299四个细胞株中表达上调。而相对于16HBE,在SPC-A-1、H1650细胞中的表达下调。4.采用荧光定量RT-PCR检测A549细胞中Mnk2-siRNA组及Negative control组中Mnk2的表达水平显示：Mnk2在Mnk2-siRNA组中的表达水平明显低于Negative control组,差异具有统计学意义(t=-13.742,P<0.001,Independent-Samples t test);5.采用荧光定量RT-PCR检测NC-H460细胞中Mnk2-siRNA组及Negative control组中Mnk2的表达水平显示：Mnk2在Mnk2-siRNA组中的表达水平明显低于Negative control组,差异具有统计学意义(t=-15.179,P<0.001)；6.采用荧光定量RT-PCR检测NCI-H1975细胞中Mnk2-siRNA组及Negative control组中Mnk2的表达水平显示：Mnk2在Mnk2-siRNA组中的表达水平明显低于Negative control组,差异具有统计学意义(t=--44.946,P<0.001)；7.采用CCK8法检测Mnk2在A549细胞的体外增殖能力。与Negative control组相比,Mnk2-siRNA组在第1、2、3、4天两组间的细胞生长速度明显下降,差异具有统计学意义(P<0.05, Independent-Samples t test);8.采用CCK8法检测Mnk2在NCI-H460细胞的体外增殖能力。与Negative control组相比,Mnk2-siRNA组在第2、3、4、5天两组间的细胞生长速度明显下降,差异具有统计学意义(P<0.05, Independent-Samples t test);9.采用CCK8检测Mnk2在NCI-H1975细胞的体外增殖能力。与Negative control组相比,Mnk2-siRNA组在第1、2、3、4、5天两组间的细胞生长速度明显下降,差异具有统计学意义(P<0.05, Independent-Samples t test);10.利用平板克隆形成实验检测A549/Mnk2-siRNA细胞组及A549/Negative control细胞组体外增殖能力的变化,A549/Mnk2-siRNA细胞组的克隆形成数为24±4.041, A549/Negative control细胞组克隆形成数为164±5.132,两组细胞间克隆形成能力的差异有显着差异(t-=36.946,P<0.001,Independent-Samples t test);11.利用平板克隆形成实验检测NCI-H460/Mnk2-siRNA细胞组及NCI-H460/Negative control细胞组体外增殖能力的变化,NCI-H460/Mnk2-siRNA细胞组的克隆形成数为55±7.00, NCI-H460/Negative control细胞组克隆形成数为147±6.557,两组细胞间克隆形成能力的差异有显着差异(t=-16.613, P<0.001, Independent-Samples t test);12.利用平板克隆形成实验检测NCI-H1975/Mnk2-siRNA细胞组及NCI-H1975/Negative control细胞组体外增殖能力的变化NCI-H1975/Mnk2-siRNA细胞组的克隆形成数为31±4.583,NCI-H 1975/Negative control细胞组克隆形成数为118±6.000,两组细胞间克隆形成能力的差异有显着差异(t=-19.959, P<0.001, Independent-Samples t test);13.采用Transwell小室的方法检测转染Mnk2-siRNA或negative control后,A549细胞体外迁移能力的变化。与negative control组相比,Mnk2-siRNA组穿膜细胞数少于negative control组,差异具有统计学意义(t=-6.360,P=0.003,Independent-Samples t test);14.采用Transwell小室的方法检测转染Mnk2-siRNA或negative control后,NCI-H460细胞体外迁移能力的变化。与negative control组相比,Mnk2-siRNA组穿膜细胞数少于negative control组,差异具有统计学意义(t=-12.932, P<0.001, Independent-Samples t test);15.采用Transwell小室的方法检测转染Mnk2-siRNA或negative control后,NCI-H1975细胞体外迁移能力的变化。与negative control组相比,Mnk2-siRNA组穿膜细胞数明显少于negative control组,差异具有统计学意义(t=-5.480, P=0.005, Independent-Samples t test).研究结论：1.在肺癌细胞株中,Mnk2的表达水平明显高于正常支气管上皮细胞,提示Mnk2是肺癌信号通路中被激活的一类蛋白；2.在转染了Mnk2-siRNA的肺癌细胞株中,细胞增殖,细胞克隆能力及体外迁移能力受到抑制,提示Mnk2是恶性肿瘤发生,发展,侵袭和转移的重要因素之一。第叁章Mnk2沉默后的动物实验研究方法：1.通过慢病毒转染A549及NCI-H460细胞的方法构建Mnk2-shRNA-A549及Mnk2-shRNA-H460;2.选用处于对数生长期的A549和NCI-H460细胞,转染慢病毒Mnk2-shRNA或negative control后使用DMEM培养基稀释到浓度为2×106/ml及3×106/ml;3.将细胞分别注射于裸鼠胁腹侧,4天后开始观察肿瘤大小,每3天记录一次,在适当时候处死裸鼠,剔出瘤体并称重,行石蜡包埋切片并行HE染色,显微镜下观察。4.将细胞经尾静脉注入裸鼠体内,接种3天后观察裸鼠状态,30天时处死裸鼠,取肝脏组织观察其表面成瘤数目。研究结果：1.在注射的A549细胞株的各7只裸鼠中,NC组的所有裸鼠均成瘤,Mnk2-shRNA组只有6只(85.7%)裸鼠成瘤,成瘤时间在第10天后。两组成瘤速度统计学有显着差异P<0.05,Independent-Samples t test)。处死裸鼠后,A549细胞株Mnk2-shRNA组瘤重0.05±0.049g,小于NC组瘤重(0.149±0.722g)(t=-2.976, P=0.012, two-independent t test);2.在注射的NCI-H460细胞株的各7只裸鼠中,NC组的所有裸鼠均成瘤,Mnk2-shRNA组只有6只(85.7%)裸鼠成瘤,成瘤时间在第7天后。Mnk2-shRNA组的成瘤速度比NC组成瘤速度慢,但两组的成瘤速度之间除了第7天统计学有显着差异(P=0.031, Independent-Samples t test)之外,之后的肿瘤体积无统计学意义(P>0.05, Independent-Samples t test)。处死裸鼠后,NCI-H460细胞株Mnk2-shRNA组瘤重0.217±0.152g,小于NC组瘤重(0.343±0.078g),但统计学没意义(t=-1.947, P=0.075, Independent-Samples t test);3.在注射A549细胞株的各5只裸鼠中,Mnk2-shRNA组的所有裸鼠肝脏转移瘤数(3±1个)比NC组的肝脏转移瘤数(10±3个)明显减少,两组成瘤速度统计学有显着差异(t=-5.259, P=0.001, Independent-Samples t test);4.在注射的NCI-H460细胞株的各6只裸鼠中,Mnk2-shRNA组的所有裸鼠肝脏转移瘤数(4±1个)比NC组的肝脏转移瘤数(19±11个)明显减少。两组成瘤速度统计学有显着差异(t=-3.415, P=0.018, Independent-Samples t test)。研究结论：1.在皮下注射转染了Mnk2-shRNA的A549细胞株后能显着抑制裸鼠皮下成瘤的速度,提示针对Mnk2的基因沉默能抑制肿瘤的生长,但是在NCI-H460细胞中没有得到预期的结果,需要更多的实验数据去进一步说明；2.在尾静脉注射转染Mnk2-shRNA的A549和NCI-H460细胞株能够抑制肿瘤的转移能力,提示针对Mnk2的基因沉默能抑制肿瘤的转移；
郭振峰[8]2011年在《应用眼眶淋巴瘤组织芯片检测P-gp、GST-π及LRP的表达及其临床意义》文中研究表明研究目的制作眼眶淋巴瘤组织芯片；利用免疫组织化学检测叁种耐药蛋白在眼眶淋巴瘤中的表达情况,初步探索该病的复发及预后不良机制研究方法1收集2003年至2008年期间诊断为眼眶淋巴瘤及反应性淋巴增生患者的临床病理资料,并对病人进行随访。2制作眼眶淋巴瘤组织芯片。3应用免疫组织化学检测P-gp、GST-π、LRP在眼眶淋巴瘤中的表达。4应用SPSS13.0统计学软件对数据进行分析,以α=0.05为检验水准,P<0.05认为有统计学意义。研究结果1 50例眼眶淋巴瘤和17例眼眶反应性淋巴增生组织芯片经HE染色后,病理诊断结果与原取材的大组织诊断完全一致；有4例眼眶淋巴瘤在免疫组织化学的染色过程中一脱片,因此末对这4例标本的染色结果进行统计。2叁种耐药蛋白,P-gp和GST-π在眼眶淋巴瘤和反应性淋巴增生组织芯片中有不同程度表达,LRP在两种组织中均为阴性表达。P-gp蛋白主要表达于细胞膜,在两种病变的阳性表达率为87.0%和35.3%,其差异有统计学意义；GST-π表达于细胞浆,在两种病变的阳性表达率为76.1%和41.2%,其差异有统计学意义。3 46例淋巴瘤：P-gp和GST-π这两种蛋白的阳性表达率在≥60岁和<60岁年龄组间、男女性别组间、≥2.5cm和<2.5cm肿瘤组间及≥1年和<1年发病时间组间均无统计学意义。4将有随访结果的35例眼眶淋巴瘤分为两组,即预后不良组和预后良好组；P-gp在两组间的表达率分别为85.7%和42.9%,其差异有统计学意义；GST-π在两组间的表达率分别为78.7%和38.1%,其差异有统计学意义。5 P-gp和GST-π在眼眶淋巴瘤中的表达呈正相关(P<0.05)。结论1眼眶淋巴瘤组织芯片省时快速,结果可靠,高效经济地研究了该肿瘤的多药耐药基因表达状况。2 P-gp在眼眶淋巴瘤和反应性淋巴增生组间阳性比率表达差异有统计学意义,说明P-gp对判断眼眶淋巴细胞性疾病的病变性质有一定价值；同时P-gp在眼眶淋巴瘤预后不良组和预后良好组间阳性率表达差异有统计学意义,说明P-gp可以预测眼眶淋巴瘤的预后。3 GST-π在眼眶淋巴瘤和反应性淋巴增生组间阳性率表达差异有统计学意义,说明P-gp对判断眼眶淋巴细胞性疾病的病理性质有一定意义；同时GST-π在眼眶淋巴瘤预后不良组和预后良好组间阳性率表达差异有统计学意义,说明GST-π可以预测眼眶淋巴瘤的预后4 LRP在眼眶淋巴瘤和反应性淋巴增生组均呈阴性表达,提示LRP与眼眶淋巴细胞性疾病的发生发展无明确相关性。5 P-gp和GST-π蛋白在眼眶淋巴瘤中的表达呈正相关,联合检测这两种指标可能对预测眼眶淋巴瘤预后有更大价值。
唐春兰[9]2013年在《SHP2在顺铂诱导的肺癌多药耐药中的作用及其分子机制的初步研究》文中研究指明背景与目的肺癌是世界上发病率最高的恶性肿瘤，化疗是治疗肺癌的主要手段之一，尽管对肺癌的化疗取得了一定进展，但过去25年其5年生存率仍未见显着提高，约为15%，而多药耐药(MDR)是肺癌化疗失败的主要原因之一。在肺癌化疗中，顺铂(CDDP)是有效并广泛应用的一线药物，但由于耐药问题的存在使其疗效不尽如人意。顺铂是一种细胞周期非特异性的细胞毒药物，目前认为抗癌细胞凋亡、损伤修复过程中DNA剪切物的增加、与调控信号通路相关的调节蛋白表达的改变、药物摄取减少导致细胞内CDDP浓度降低等均可能与顺铂的耐药有关，然而肺癌细胞对其耐药的机制尚未完全阐明。因此，进一步研究顺铂的耐药机制和寻找新的逆转耐药靶点对于改善肺癌化疗效果提高5年生存率具有重要意义。抗细胞凋亡是顺铂耐药的主要机制之一，而PI3K/AKT通路是最主要的抗凋亡通路。我们前期研究发现AKT1的过表达和基因扩增与肺癌细胞对顺铂耐药密切相关，抑制AKT1的表达可以逆转A549/CDDP对顺铂的耐药，反之，激活AKT1则可增强肺癌细胞对CDDP的耐受；采用PI3K的抑制剂LY294002能显着抑制AKT1的表达并增强耐药细胞A549/CDDP对顺铂的敏感性。Ras基因位于PI3K/AKT通路的上游，既往研究表明调控Ras有关的上游调控分子如EGFR、HER2、Grb2、鸟苷酸交换因子(GEF，如SOS1)等均为SHP2作用的底物，一方面，SHP2通过与上述底物结合激活Ras；另一方面，SHP2通过与RasGAP结合阻止GTP酶对Ras-GTP的水解延长RAS-GTP的半衰期，从而使下游信号通路包括PI3K/AKT通路处于持续激活状态。同时，我们前期在乳腺癌的研究中发现，抑制SHP2表达的同时也可以抑制AKT的表达，最近的研究又表明顺铂可以选择性的活化SHP2，因此我们推测SHP2可能是一新的肺癌顺铂耐药相关蛋白，其机制是通过Ras调控PI3K/AKT信号通路实现的。SHP2是一种含有两个Src同源结构域(Src homology-2，SH2)的蛋白酪氨酸磷酸酶(PTP)，是PTP超家族中第一个原癌基因PTPN11编码的蛋白产物。蛋白酪氨酸磷酸化在细胞信号转导过程中具有重要作用，酪氨酸磷酸化水平受控于蛋白酪氨酸激酶(PTK)及PTP，二者的失衡会导致异常的酪氨酸磷酸化，而异常的酪氨酸磷酸化与人类多种疾病包括癌症密切相关。研究表明，SHP2的活化突变或持续激活是青少年粒-单核细胞性白血病、髓细胞性白血病、慢性粒-单核细胞性白血病的病因，它也参与了幽门螺旋杆菌相关胃癌的发生，在胃癌、乳腺癌中也有SHP2的高表达，但目前SHP2与癌症关系的研究主要集中在癌症发生及癌细胞生长、侵袭、迁移、转化方面，尚未发现SHP2与肺癌顺铂耐药的相关研究报道。本课题拟通过组织芯片和免疫组织/细胞化学技术，首先检测SHP2在人肺癌中的表达情况；然后以顺铂诱导的小细胞肺癌MDR细胞H446/CDDP及其亲代细胞H446为研究对象，利用基因克隆及RNA干扰技术，构建SHP2慢病毒表达或干扰载体，在增强H446细胞中SHP2的表达或下调H446/CDDP细胞中SHP2的表达的情况下，分别观察在加入顺铂前后细胞生物学行为及对顺铂耐药的变化，了解SHP2是否与肺癌顺铂耐药有关；最后，在初步证实SHP2是一新的肺癌顺铂耐药相关蛋白的前提下，检测Ras干扰前后各组细胞SHP2、Ras、AKT1、pAKT1及survivin蛋白表达情况，初步阐明SHP2影响肺癌顺铂耐药的分子机制。方法1、应用组织芯片及免疫组织/细胞化学技术，检测SHP2在人肺癌组织、小细胞肺癌细胞H446及肺腺癌细胞SPC-A-1的亲代及顺铂诱导的MDR细胞中的表达；2、应用基因克隆及RNA干扰技术，构建SHP2慢病毒表达载体及干扰载体，293FT细胞慢病毒包装，收集病毒后用于感染H446及H446/CDDP细胞，采用嘌呤霉素浓度筛选获取稳定高表达SHP2的H446细胞(H446-SHP2-WT)及持续抑制SHP2表达的H446/CDDP细胞(H446/CDDP-SHP2-shRNA)，并用RT-PCR及Western blot进行鉴定；3、应用CCK-8法检测筛选细胞对顺铂的敏感性，并在加入顺铂前后观察各组细胞生长曲线的变化；4、应用流式细胞仪检测各组细胞在加入顺铂前后细胞周期及凋亡的改变；5、应用Western blot及RNA干扰技术，观察Ras RNA干扰前后各组细胞SHP2、Ras、AKT1、pAKT1、survivin的表达情况。结果1、SHP2在80例NSCLC组织中有较高阳性表达率[70.00%(56/80)]，SHP2在小细胞肺癌细胞H446及肺腺癌细胞SPC-A-1的亲代及顺铂诱导的MDR细胞中均呈阳性表达；2、成功构建了SHP2慢病毒表达载体及干扰载体，筛选出了稳定高表达SHP2的H446细胞(H446-SHP2-WT)及持续抑制SHP2表达的H446/CDDP细胞(H446/CDDP-SHP2-shRNA)；3、H446-SHP2-WT-空载、H446-SHP2-WT对顺铂IC50值分别为1.01μg/ml、1.218μg/ml，耐药指数为1.206， H446-SHP2-WT对顺铂的耐受性增强20.6%；H446/CDDP-SHP2-shRNA、H446/CDDP-SHP2-shRNA-空载对顺铂的IC50值分别为4.382μg/ml、11.92μg/ml，耐药指数为2.72，H446/CDDP-SHP2-shRNA对顺铂的耐药逆转率为63.2%，表明增加SHP2的表达可降低H446细胞对顺铂的敏感性，而抑制SHP2的表达可逆转H446/CDDP细胞对顺铂的耐受，初步证实SHP2是一新的肺癌顺铂耐药相关蛋白；4、 H446-SHP2-WT细胞在加入顺铂后细胞生长受抑制程度弱于H446及H446-SHP2-WT-空载组，第2天及第3天明显(p＜0.05)，而H446/CDDP-SHP2-shRNA细胞在加入顺铂后细胞生长受抑制程度强于H446/CDDP及H446/CDDP-SHP2-shRNA-空载组，第3天以后明显(p＜0.05)；流式细胞仪检测发现加入顺铂后可使各组细胞停留在S期的细胞比例显着增加，H446-SHP2-WT细胞在顺铂作用条件下凋亡细胞比例减少(34.56%vs49.43%)，而H446/CDDP-SHP2-shRNA细胞在顺铂作用条件下凋亡细胞比例明显增加(16.75%vs6.60%)。上述结果进一步证实SHP2为一新的肺癌顺铂耐药相关蛋白，其对顺铂耐药的影响可能与其调控肺癌细胞的凋亡有关；5、亲代细胞H446及顺铂诱导的MDR细胞H446/CDDP的SHP2蛋白表达无明显差异，但MDR细胞H446/CDDP的SHP2活性明显高于亲代细胞H446(OD值分别为0.488±0.015和0.249±0.011，p＜0.05)，表明H446/CDDP细胞对顺铂的耐药性还与SHP2的活性增加有关；6、H446/CDDP、H446/CDDP-SHP2-shRNA-空载的Ras、AKT1、pAKT1、survivin的表达高于亲代细胞H446； H446/CDDP、 H446/CDDP-SHP2-shRNA-空载、H446/CDDP-SHP2-shRNA细胞Ras、AKT1、pAKT1、survivin表达变化情况与SHP2变化情况一致，抑制SHP2的表达可下调Ras、AKT1、pAKT1、survivin的表达，提示SHP2可能是Ras、AKT1、survivin的上游调控因子，并在PI3K/AKT1通路中具有正向调节作用；SHP2表达未抑制的H446、H446/CDDP、H446/CDDP-SHP2-shRNA-空载细胞加入顺铂后pAKT1、survivin的表达增加，而SHP2表达抑制的H446/CDDP-SHP2-shRNA细胞加入顺铂前后pAKT1、survivin表达无明显变化，提示顺铂可能活化SHP2并通过SHP2/Ras/PI3K/AKT1/survivin抑制细胞的凋亡而参与耐药；7、在顺铂作用条件下，H446、H446-SHP2-WT、H446/CDDP Ras RNA干扰组Ras表达下降，而SHP2表达无明显变化，提示SHP2位于Ras的上游；同时发现AKT1及pAKT1在H446-SHP2-WT及H446/CDDP Ras RNA干扰组的表达增高，提示活化的SHP2不仅仅通过Ras调控PI3K/AKT1通路影响细胞的凋亡参与肺癌的耐药，可能还存在其他的补偿途径增加AKT1及pAKT1的表达。结论1、SHP2在人肺癌中具有高表达率；2、SHP2是一新的肺癌顺铂耐药相关蛋白，其对肺癌顺铂耐药的影响既与其表达水平有关，也与其活性有关；3、SHP2对肺癌顺铂耐药的影响与其调控肺癌细胞的凋亡有关，其机制之一是SHP2作为Ras的上游调控分子通过SHP2/Ras/PI3K/AKT1/survivin信号通路抑制细胞凋亡实现的，并且SHP2在此通路中具有正向调节作用。
谢优[10]2016年在《miR-542-5p在非小细胞肺癌中的临床意义及初步机制研究》文中认为作为新一类的分子靶向标志物,微小RNA (microRNA, miRNA)在非小细胞肺癌(non-small cell lung cancer, NSCLC)的诊断和生物治疗上的应用前景非常广阔。目前已发现若干直接或间接与NSCLC的发生和发展、诊断、分期、进展和预后等相关的miRNAs,但许多miRNA与NSCLC的相互关系及分子机制仍不明确,故探求miRNA在NSCLC中的作用机制已成为当前研究的热点和重点。miR-542-5p与肿瘤的关系研究不多,已有研究发现miR-542-5p在神经母细胞瘤中呈低表达,与患者的不良预后密切相关,体外实验结果显示,过表达miR-542-5p可抑制神经母细胞瘤细胞的增殖,侵袭和转移,推测miR-542-5p可能在神经母细胞瘤中行使“抑癌”miRNA的功能。但到目前为止,miR-452-5p在NSCLC人群中的研究未见报道。因此,本课题将探讨miR-542-5p在NSCLC中的表达及其与临床病理参数的意义,预测miR-542-5p靶基因网络,继而构建鸡胚绒毛尿囊膜移植瘤(Chick Chorioallantoic membrane, CAM)动物模型,探索miR-542-5p在NSCLC细胞生长,血管生成的作用及初步分子机制,为进一步开展NSCLC的肿瘤生物学相关研究提供了良好的技术平台。目的1检测miR-542-5p在NSCLC细胞及组织中的表达及临床意义。2利用生物信息学预测并分析miR-542-5p的靶基因网络并行信号通路等分析。3使用体内实验(CAM),探讨miR-542-5p在NSCLC肿瘤细胞生长及血管生成中的作用及潜在机制。方法1.miR-542-5p在NSCLC中的表达收集125例NSCLC及癌旁非癌肺组织样本,其中101例肺腺癌(lung adenocarcinoma, LUAD),23例肺鳞癌(Lung squamous cell carcinoma, LUSC),采用实时荧光定量PCR技术检测miR-542-5p的表达水平,分析miR-542-5p的表达与NSCLC的临床病理学特征的关系,初步探讨miR-542-5p在NSCLC中的临床意义。2.miR-542-5p潜在靶基因信号通路及网络分析2.1通过miRNA预测软件(miRWalk, miRanda, Microt4, miRDB, mirbridge, miRMap, RNAhybrid, miRNAMap, PITA, Pictar2, RNA22, TargetScan)预测miR-542-5p的靶向作用基因,利用DAVID分别进行GO富集分析、KGEE通路分析、PANTHER通路分析。2.2用软件Cytoscape_v3.3.0绘制GO分析网络图, 在http://string-db.org/网站上绘制靶蛋白网络图,并提取hub gene。2.3通过GSEA软件构建的分子标签数据库(Molecular Signatures Database, MSigDB)对452个靶基因进行富集分析。通过来源于National Cancer Institute的NCI-60 cell lines的数据,以基因表达图谱的形式进行靶基因注释,在定义的功能分组中显示相互的表达趋势。3. miR-542-5p在NSCLC CAM中的作用及初步机制研究3.1实时荧光定量PCR方法检测四株肺癌细胞系(A549、PC9、H1299、 H460)中筛选出miR-542-5p表达量最低的肺癌细胞株进行转染。3.2构建LV-hsa-miR-542的慢病毒载体,转染至肺癌细胞株H460,构建miR-542-5p的过表达细胞模型。3.3通过构建NSCLC CAM模型从动物模型角度模拟人体NSCLC的生长发展,测量瘤块大小,并利用Image-Pro Plus软件测量不规则血管面积及开窗面积,计算比值,包埋瘤块制成石蜡组织后,组织切片常规HE染色和免疫组化表皮生长因子受体(Epidermal Growth Factor Receptor, EGFR)、血管内皮生长因子(Vascular Endothelial Growth Factor, VEGF)、 D2-40染色,以研究miR-542-5p对NSCLC肿瘤形成和血管生成的影响,进一步初步探讨其在肿瘤中的作用机制。结果1.miR-542-5p在非小细胞肺癌中的表达1.1 miR-542-5p在125例NSCLC中的癌组织(1.952±1.507)中表达低于癌旁非癌肺组织(4.568±1.993)(t=-11.703,P<0.001)；在101 LUAD中的癌组织中的表达(1.868±1.472)显着低于癌旁非癌组织(4.682±2.056；t=-11.183,P<0.001)；在23例LUSC癌组织中的表达(2.355±1.647)显着低于癌旁非癌组织(4.103±1.851; t=-3.383, P=0.002)。ROC曲线示在NSCLC石蜡组织中miR-542-5p曲线下面积为0.799(95%CI0.721-0.877,P<0.001),其中在LUAD组织中miR-542-5p曲线下面积为0.832(95%CI0.753±0.911,P<0.001)。1.2在125例NSCLC病人中,miR-542-5p在TNM分期Ⅲ-Ⅳ中的表达水平(1.292±1.101)低于TNM分期Ⅰ-Ⅱ(2.822±1.536；t=6.488,P<0.001),在有血管浸润阳性者(1.475±1.305)的表达低于血管浸润阴性组(2.138±1.545；t=2.247,P<0.001)的病人,在淋巴结转移阳性组(1.504±1.266)中的表达低于淋巴结转移阳性组(2.506±1.604；t=3.905, P<0.001)。Spearman相关性分析表明,miR-542-5p的表达水平与TNM分期(r=-0.505,P<0.001)、淋巴结转移(r=-0.332,P<0.001)及血管浸润(r=-0.199,P=0.026)呈负相关。1.3在101例LUAD病人中,miR-542-5p在TNM分期Ⅲ-Ⅳ中的表达水平(1.142±0.935)低于TNM分期Ⅰ-Ⅱ(2.810±1.516；t=6.417, P<0.001)的病人,在有血管浸润(1.375±1.30)中的表达低于无血管浸润(2.087±1.497；t=2.286,P=0.024)的病人,在有淋巴结转移(1.333±1.095)中的表达低于无淋巴结转移(2.085±1.085；t=-2.477,P=0.027)的病人,在有吸烟史的病人(3.065±1.542)中的表达高于无吸烟史的(2.535±1.616；t=4.265, P<0.001)。Spearman指数分析表明,miR-542-5p的表达水平与TNM分期(r=-0.564,P<0.001)、淋巴结转移(r=-0.408,P<0.001)及血管浸润(r=-0.224,P=0.024)呈负相关。1.4在23例LUSC病人中,miR-542-5p的表达水平与临床特征相关性不明显。1.5在NSCLC组织中,miR-542-5p在EGFR阳性组(0.739±0.407)中的表达显着低于EGFR阴性组(3.049±1.194；t=7.753,P<0.001)的病人,Spearman相关分析结果示EGFR蛋白表达与miR-542-5P呈负相关(r=-0.723,P<0.001)。其中在LUAD组织中miR-542-5p在EGFR阳性组(0.836±0.373)中的表达低于EGFR阴性组(3.180±0.952；t=10.098,P<0.001)的病人,Spearman相关分析结果示EGFR蛋白表达与miR-542-5P呈负相关(r=-0.818,P<0.001)；在LUSC组织中miR-542-5p在EGFR阳性组(0.436±0.345)中的表达低于EGFR阴性组(2.888±1.448；t=6.543,P<0.001)的病人,Spearman相关分析结果示EGFR蛋白表达与miR-542-5P呈负相关(r=0.828,P<0.001)。1.6以miR-542-5p在NSCLC组织中的表达量的中位数(3.260±2.197)为分度将其分为高表达组(4.568±1.993)和低表达组(1.953±1.507)。K-M生存曲线分析发现miR-542-5p低表达组的50例NSCLC病人(11.274 ±1.387 months)与高表达组的7例病人(35.714±3.469 months)相比,预后更差(t=-6.219,P<0.001)。2.miR-542-5p潜在靶基因网络生物信息学分析2.1通过12个预测软件预测出57233个miR-542-5p预测靶基因,按至少同时出现在六个软件预测为条件,筛选出452个靶基因。2.2 DAVID软件测出miR-542-5p预测的GO分析结果中,生物过程GO分析(GOTERM BP FAT)中有147条通路信息,其中最显着的前叁条通路如下：RNA聚合酶引物调控的转录通路(regulation of transcription from RNA polymerase II promoter；GO:0006357,P=0.002)；蛋白质定位通路(protein localization；GO:0008104,P=0.002)；Wnt受体信号通路(Wnt receptor signaling pathway；GO:0016055,P=0.002).细胞组成GO分析(GOTERM CC FAT)中有15条,其中排前叁条通路如下：神经元投射通路(neuron projection；GO:0043005,P=0.003)；突触调控通路(synapse； GO:0045202,P<0.001):体元投射(cell projection；GO:0042995,P<0.001).分子功能GO分析(GOTERM MF FAT)中有37条,其中叁条最显着通路如下：蛋白质糖基绑定(protein C-terminus binding；GO:0008022,P= 0.003):转录调节活性(transcription regulator activity:GO:0030528,P= 0.017)；蛋白质自联(protein self-association；GO:0043621,P=0.037).2.3 DAVID软件测出miR-542.5p参与的KEGG通路分析13条通路信息,其中叁条最显着为：卵母细胞成熟分裂调控通路(Oocyte meiosis； hsa04114,P=0.01):扩张性心肌病调控通路(Dilated cardiomyopathy； hsa05414,P=0.012):黑素原生成调控通路(Melanogenesis；hsa04916, P=0.018).2.4 DAVID软件测出miR-542-5p参与的PANTHER通路分析有12条通路信息,其中参与的最显着叁条通路为：GABA.B Ⅱ受体信号(GABA-Breceptor Ⅱ signaling; P05731, P=0.001);谷氨酸受体组第叁途径(Metabotropic glutamate receptor group Ⅲ pathway; P00039, P=0.013);胰岛素／胰岛素样生长因子通路蛋白激酶B信号级联(Insulin/IGF pathway-protein kinase B signaling cascade; P00033, P= 0.024)。2.5452个靶基因在String上分析结果显示：GO分析中miR-542-5p参与的生物过程通路(GOTERM BP FAT)中有121有意义的作用结果(P<0.05),其中参与的前叁条依次为神经系统的发展(nervous system development) (GO:0007399),神经(nervous) (GO:0022008),细胞分化(cell differentiation) (GO:0030154);细胞组成通路(GOTERM CC FAT)中有20条有意义的作用结果(P<0.05),其中参与的前叁条依次为细胞反射(cell projection) (GO:0042995),神经反射(neuron projection) (GO:0043005),神经系统的部分(neuron part) (GO:0097458);分子功能通路(GOTERM MF FAT)中仅参与蛋白绑定(protein blind) (GO:0005515)的作用(P<0.05)。KEGG通路中有7条作用结果,其中参与的前叁条依次为吗啡慢性中毒(Morphine addiction);可卡因成瘾(Cocaine addiction),心肌细胞的肾上腺素信号通路(Adrenergic signaling in cardiomyocytes) (P< 0.05)。并通过网络分析及网站评分信息检测出21个hub gene,分别为RMT8, ADAMTS8, MASP1, HOXC9, ARTN, NPDC1, CASC3, NCDN, ARPC4, PGPEP1, TNNI3K, SLC24A3, EPS8L2, FARSA, PDDC1, PLEKHM1, UNKL, PRDM9, ISYNA, BCL2L1。2.6通过将靶基因注释在NCI-60 cell lines不同癌症细胞系中的表达图谱,显示出多个靶基因在HOP92, HOP62; NCI-H226; NCI-H23; NCI-H322; NCI-460及EKVX肺癌细胞系中高表达,依次为NSD1, ELF4, HOXA9, ABL1, ABL2, NOTCH1, TCF3, SEPT6, NUP214, CRTC1。3.miR-542-5p在NSCLC CAM中的作用及初步机制研究3.1细胞选择：选取miR-542-5p表达量最低的H460细胞进行移植瘤构建。3.2慢病毒转染：选取最佳转染浓度转染LV-hsa-miR-542慢病毒(浓度配比virus 10 μl+ENIS 290μl+ploy 1.25μl+complete 2.2 ml)和空载病毒(浓度配比virus 3 μl+ENIS 300μl+ploy 1.25 μl+complete 2.2 ml)后,实时荧光定量PCR检测H460(空白组),阴性组(空载病毒),LV-hsa-miR-542组中miR-542-5p的表达水平,发现miR-542-5p在转染组中过表达,转染有效(P<0.001)。3.3移植瘤结果统计：于25 ml培养皿中培养空白组,阴性组和转染组细胞株,各取两瓶长势良好且已满的细胞种入鸡胚,监测其瘤块和血管生长情况,第0天各组血管长势良好,第5天,瘤块大小：转染组(4.34±0.07mm3)与空白组(30.13±0.06 mm3)相比,明显受到抑制(t=543.260,P<0.001),阴性组(30.09±0.07 mm3)与空白组相比,无明显差异(t=1.312,P=0.260)。3.4血管生成：转染组(8.33±0.08)与空白组(16.94±0.11)相比,明显受到抑制(t=128.208,P<0.001)；阴性组(16.99±0.20)与空白组(16.94±0.11)相比,无明显差异(t=-0.612,P=0.573)均受到抑制。3.5 HE切片：镜下示转染组相比对照组,局部浸润不明显。通过免疫组化检测空白组和转染组的EGFR(11.220±0.536;6.680±0.536)、 VEGF(7.320±0.370;4.320±0.421)及D2-40(2.020±0.390；1.500±0.255)的表达情况：LV-hsa-miR-542组中EGFR(t=13.399,P<.001)、 VEGF(t=11.971,P<0.001)及D2-40(t=2.496,P=0.037)的表达明显减弱。结论1.miR-542-5p在NSCLC组织中呈低表达,在NSCLC的发生发展中具有一定影响,可能发挥抑癌基因的作用,并对NSCLC可能具有中度诊断价值。2.miR-542-5p的GO富集通路分析发现其分子功能,细胞结构及生物过程及KEGG通路分析和PANTHER通路的相关靶向作用通路信息,其中对KEGG通路及PANTHER通路中的相关基因进行网络分析发现miR-542-5p靶向作用于的VEZT, KIT, CAMK2D, WEE2, PARVA, LTK, CLCN3最有价值,可进行下一步的机制研究。通过String平台对miR-542-5p的452个靶基因分析发现其参与的各通路在神经系统中的作用很显着,并可参与相关如吗啡类药物中毒的生理反应过程。还通过靶基因注释发现了多个靶基因在肺癌细胞系中呈现出不同程度的高表达情况。对miR-542-5p的潜在靶向生物信息学分析为miR-542-5p对疾病发生发展的分子靶向作用机制提供了良好的理论平台。3.在NSCLC鸡胚绒毛膜尿囊膜移植瘤中,过表达miR-542-5p可抑制肿瘤大小及血管生成,进一步说明miR-542-5p在NSCLC的发生发展中可能起到抑癌基因的作用在体内实验发现：miR-542-5p表达与EGFR, VEGF及D2-40的表达呈负相关,推测miR-542-5p可能参与某种通路调节EGFR, VEGF及D2-40的表达,从而影响肿瘤的局部浸润及血管生成。但具体分子机制有待进一步深入研究。
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