小鼠囊胚ICM在蜕膜化中的作用

论文摘要

子宫内膜蜕膜化反应是子宫基质细胞在胚胎着床过程中转变为蜕膜细胞的过程,对于哺乳动物妊娠的建立和维持至关重要。着床期胚胎由内细胞团（Inner Cell Mass,ICM）和滋养外胚层（Trophectoderm,TE）组成,其中ICM主要参与胚体的生成,TE主要参与胚外组织的生成。大量研究表明,TE细胞能够分泌旁信号影响啮齿类动物子宫内膜蜕膜化反应,若机械去除ICM,仅含TE细胞的胚胎同样能够诱导子宫内膜蜕膜化,但关于ICM及其分化组织对蜕膜化反应的作用的研究几乎没有。TE细胞的增殖与分化受邻近ICM的调控,且ICM对滋养细胞的调控作用一直维持到妊娠后期。因此,我们提出ICM在蜕膜化反应过程中具有重要调控作用。本研究以CD-1小鼠为材料,首先建立多种人工诱导蜕膜化反应模型,分别以四倍体胚胎、空气、受精卵、2-细胞胚胎、生发泡期卵母细胞、滋养层细胞、玻璃珠等外源物质诱导假孕3.5d小鼠子宫内膜蜕膜化反应,并在诱导后4 d收集蜕膜组织,通过形态观察、组织切片、高通量转录组测序以及蛋白质双向电泳等技术分析不同蜕膜组织间的差异。结果发现四倍体胚胎诱导蜕膜与正常蜕膜相比,大小一致、结节明显且分布均匀。其余诱导蜕膜大小不一、形态各异、结节不明显、分布不均匀,与正常蜕膜相比差异显著;其次,利用体视显微镜观察剥离的蜕膜组织,发现受精卵和2-细胞胚胎诱导的蜕膜形态各异,大小差异显著且蜕膜组织有间隙存在,而正常蜕膜大小一致,完整无间隙,且子宫系膜侧蜕膜大于子宫系膜对侧的蜕膜。诱导蜕膜与正常蜕膜内部结构差异显著,解剖四倍体胚胎诱导蜕膜发现,蜕膜原羊膜腔内没有完整结构的胚体存在,仅有凋亡的组织碎片,而正常蜕膜内有结构完整的胚体。观察空气、四倍体胚胎和正常胚胎诱导的7.5 d蜕膜的子宫系膜血管,空气诱导蜕膜的子宫系膜血管分布密集杂乱,而四倍体胚胎诱导蜕膜的子宫系膜血管分布较规律,但与正常蜕膜相比,差异显著。最后,利用转录组测序技术,发现四倍体胚胎诱导蜕膜和正常蜕膜间有179个差异基因,其中在正常蜕膜上调的基因有151个,在四倍体胚胎诱导蜕膜上调的基因有28个。通过GO分析可知:差异基因与滋养巨细胞分化最为相关。利用STRING数据可知蜕膜间催乳素家族的关系最为密切。选取Prl8a2、Prl4a1、Apoa1、Apoc2、H19、Ttr 6个基因,利用qPCR进行验证,结果显示,Prl4a1、Apoa1、Apoc2、H19、Ttr 5个基因在正常蜕膜中高表达而在四倍体胚胎诱导蜕膜中低表达,且差异显著,而Prl8a2的表达差异不显著。此外,利用蛋白质双向电泳技术,在四倍体胚胎诱导蜕膜和正常蜕膜间发现了3个蛋白差异点。这些结果表明:ICM缺陷导致蜕膜组织形态、结构和基因表达异常,ICM在蜕膜化反应过程中具有重要调控作用。该研究为探究异常蜕膜导致早期胚胎停育的线索及研究胚胎着床机理提供了新思路。

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摘要

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1 引言

1.1 蜕膜化反应是妊娠过程的关键步骤

1.2 胚胎的顺利着床启动蜕膜化反应

1.3 胚胎影响蜕膜化反应

1.4 四倍体胚胎的研究

1.5 与蜕膜组织表达相关的基因

1.5.1 催乳素家族基因

1.5.2 H19 基因

1.5.3 Apoa1 基因

1.5.4 Apoc2 基因

1.5.5 Ttr基因

1.6 转录组测序技术应用

1.7 研究目的和意义

2 材料与方法

2.1 试验动物与样品采集

2.1.1 结扎公鼠的制备

2.1.2 母鼠发情期的鉴定

2.1.3 真孕母鼠、假孕母鼠的制备

2.1.4 四倍体胚胎的制备

2.1.5 输卵管移植

2.1.6 样品采集

2.2 实验主要溶液的配制

2.3 组织切片处理

2.4 蛋白质双向电泳

2.5 组织样品RNA的提取

2.5.1 RNA的提取

2.5.2 蜕膜组织RNA质量检测

2.5.3 基因组DNA的去除

2.5.4 RNA的反转录

2.6 转录组测序

2.7 差异表达基因的验证

2.7.1 内参的选择

2.7.2 筛选差异基因引物的设计

2.7.3 常规PCR的筛选

2.7.4 标准品的制备

2.7.5 标准曲线的建立

2.7.6 Real-Time PCR及数据的统计分析

2.8 生物信息分析参考的数据库和分析程序

3 结果与分析

3.1 制备四倍体胚胎

3.2 蜕膜组织比较

3.3 血管通透性观察

3.4 子宫系膜侧血管的观察

3.5 蜕膜组织切片观察

3.6 蛋白质双向电泳

3.7 转录组测序结果

3.7.1 蜕膜组织RNA的提取与纯化

3.7.2 差异基因分析

3.8 Real-Time PCR

4 讨论

4.1 胚胎在蜕膜化中的作用

4.2 ICM在蜕膜化中具有重要作用

4.3 四倍体胚胎中滋养细胞的功能

4.4 建立一种新型蜕膜模型

4.5 四倍体胚胎诱导蜕膜化

4.6 输卵管非同步移植

4.7 催乳素家族基因调控

4.8 载脂蛋白

4.9 印迹基因

5 结论

参考文献

个人简历

在校期间发表论文情况

致谢

文章来源

类型: 硕士论文

作者: 李华

导师: 李相运

关键词: 小鼠,内细胞团,滋养外胚层,四倍体胚胎,蜕膜化反应

来源: 河北农业大学

年度: 2019

分类: 基础科学

专业: 生物学

单位: 河北农业大学

分类号: Q954.4

DOI: 10.27109/d.cnki.ghbnu.2019.000319

总页数: 64

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