王兴霞[1]2018年在《基于COI和18S rDNA基因序列的长腹剑水蚤属系统进化分析》文中研究指明浮游动物是海域中分布较为广泛的类群之一,其种类及其数量众多,繁殖能力极强,在海洋生态系统以及食物网中占据重要部位。首先,他们作为次级生产者参与生态系统物质循环与能量流动;此外,浮游动物对污染物很敏感,有积累和转移作用,因此其种类数量,群落变化等也是监测海洋生态毒理、海水环境和水系的重要指标。因此浮游动物的研究在渔业资源和生态环境调查中占据重要地位。目前,浮游动物的研究多偏向于生态学研究,遗传进化方面的研究开展相对缓慢。长腹剑水蚤属(Oithona)作为海洋中小型桡足类最为丰富的类群之一,在海洋生态系统中同样具有重要的研究意义。目前对长腹剑水蚤的分类鉴定主要依据形态学数据为主,由于个体小且形态差异微小,通过传统的形态学分类法对其进行准确鉴定难度较大,并且形态学的鉴定会存在主观的偏差性,会造成鉴定的误差。另外,由于长腹剑水蚤不能做远距离游动,因此不同海域的种类间存在地理隔离,产生生殖隔离,这使得长腹剑水蚤属内存在隐种的分化,更加增大了形态鉴定增加的难度。目前,长腹剑水蚤的系统进化关系尚未明确,严重影响了长腹剑水蚤的深入研究。本研究通过对长腹剑水蚤进行系统进化研究,揭示长腹剑水蚤属的进化关系,并且为种类鉴定提供分子数据。我们将本实验所得数据与GenBank中长腹剑水蚤属其他地区种类的基因序列进行比较分析,使用ABGD(Automatic Barcode Gap Discovery)和GMYC(Generalized Mixed Yule Coalescent)模型进行物种界定,并构建贝叶斯和最大似然法系统进化树。本研究的结论主要是以下几个方面:1.基于mtCOI基因序列,利用ABGD和GMYC模型对长腹剑水蚤进行物种界定,界定结果与形态学分类一致。说明了mtCOI基因可作为标记基因对长腹剑水蚤进行种类鉴定,这为以后种类鉴定提供了分子数据。2.mtCOI基因的均转换/颠换(si/sv)数为1.44,转换数略高于颠换数,且主要发生在第叁位点。18S rDNA基因序列的平均转换/颠换(si/sv)值为2.96,要比mtCOI基因序列的要高,这与其基因的保守性有关。3.两种基因的碱基组成有各自的特点。COI基因序列中A:24.5%,G:18.4%,C:19.4%,T:37.6%,其中A+T(62.1%)含量明显高于G+C(37.8%)含量。而18S rDNA基因序列的各碱基组成基本相同,不存在碱基偏异性,碱基组成分别为A:26.0%,T:25.5%,C:21.5%,G:27.1%。18S rDNA相对于mtCOI基因序列具有较高的保守位点和较低的变异位点和简约信息位,表现出较低的进化速度,具有较高的保守性。4.mtCOI基因序列的种间遗传距离为17.7%-44.5%,表明长腹剑水蚤种间遗传差异已经达到属间的分化范围。结合形态学数据将长腹剑水蚤属拆分为两个属。但基于18S rDNA基因序列的遗传距离范围为1.1%-5.1%,各种间显示出较近的的亲缘关系。这说明长腹剑水蚤属内各种间的18S rDNA序列差异很小,呈现出18S rDNA的保守性。5.mtCOI基因的贝叶斯和最大似然法系统进化树结果显示,长腹剑水蚤存在隐种的分化,分别出现于不同海域的拟长腹剑水蚤(O.similis)与羽长腹剑水蚤(O.plumifera)内。在18S rDNA系统进化树中,羽长腹剑水蚤(O.plumifera)与刺长腹剑水蚤(O.setigera)归为一支,介于羽长腹剑水蚤和刺长腹剑水蚤在体型上相似,两者可能具有较近的亲缘关系。同时也说明18S rDNA更适用于较高的分类阶元。
贾洋洋[2]2012年在《利用宏基因组方法分析堆肥生境中微生物区系的变化》文中进行了进一步梳理秸秆工厂化快速堆肥是木质纤维素高效利用转化的重要方式,是一种非常具有前景的产业,不仅可以完成大规模农业秸秆综合利用,还可以满足大棚等集约农业对育苗基质的要求,解决现代化农业的一系列问题。然而,堆肥过程是一个微生物生态学过程,发酵时间长,控制复杂,生产成本高,限制了其大规模的推广应用。本文针对以上问题,利用宏基因组学技术对秸秆堆肥发酵过程中主要降解微生物区系的变化进行了分析,取得了初步成果,为秸秆的高效转化研究奠定了理论基础。秸秆堆肥发酵过程较为粗放,原料成分复杂,发酵过程条件变化多样,为了研究微生物区系的代表,在本项研究中通过大量重复实验发现菌丝形态生长相似的生境中有着相同的优势微生物菌群,说明微生物群落形态可以作为取样时的标志。在研究中建立了典型生境下基于天然生境中优势微生物群落形态的取样方法。研究发现在堆肥生境中,微生物菌丝生长旺盛的区位有着更高的胞外纤维素酶活性,以及更高的纤维素降解率。基于生长旺盛的白色菌丝样品进行取样,利用PCR-RFLP和Roche454高通量测序两种方法研究了该堆肥生境中微生物的多样性。结果显示,两种方法都可以检测堆肥生境中的优势微生物种类。Roche454高通量测序的方法测序通量大,对生境中的微生物种类覆盖度大,可以检测到生境中相对低丰度的微生物种群。利用高通量测序方法分析了玉米秸秆大堆固态发酵的过程,发现不同发酵堆区位由于水分、氧气、温度等各种条件的不同,可导致其优势微生物区系明显不同,微生物对秸秆的降解程度也明显不同。研究发现秸秆的降解主要发生在氧气充足的D1层,真菌中的嗜热丝孢菌属是该生境中的优势微生物,其中嗜热丝孢菌属约占真菌总量的66%；细菌中喜热裂孢菌属、嗜热多孢菌属、各种高温芽孢杆菌是优势微生物。最外层(DO)的秸秆由于水分不充足,基本没有降解；氧气不充足的D2层中,以各种好氧或兼性厌氧细菌为主；堆垛中最内部(D3层)几乎完全缺氧,主要生长着各种酵母科真菌及乳杆菌属,与秸秆青贮环境中微生物种群类似,秸秆基本无降解。因此秸秆堆肥好氧生产育苗基质的发酵过程中应注意翻堆通风,保证好氧微生物快速生长,从而加速秸秆的好氧快速降解。在小麦秸秆翻堆发酵的整个发酵周期中,秸秆的降解主要发生在发酵过程的前中期。发酵过程由于翻堆与天气等其他因素的影响,反应堆温度低于玉米秸秆发酵时的温度,此环境过程中变形菌门、拟杆菌门、放线菌门细菌和子囊菌门的真菌为优势菌群,其中子囊菌门中,同样以嗜热丝孢菌属最多。发酵的高温过程可以杀死假黄单胞菌属和黄杆菌属等植物致病菌,减少农作物灾害。秸秆堆肥生境中,有着较为丰富的微生物多样性,但在这些微生物中,能够产生纤维素酶或半纤维素酶的微生物有着绝对的优势,如无论是以玉米秸秆还是小麦秸秆为原料,都能够检测到非常大量的喜热裂孢菌属和嗜热丝孢菌属。在后续的实验中,可以尝试将喜热裂孢菌及嗜热丝孢菌等该生境中的优势微生物直接接种到固态发酵堆中,以提高固态发酵效率,缩短发酵周期。
朱海生, 陈敏氡, 温庆放, 蓝新隆, 李永平[3]2016年在《丝瓜18S rRNA基因克隆及其作为内参基因的应用》文中研究指明选择合适的内参基因是提高实时荧光定量PCR分析(q RT-PCR)准确性的重要条件。18S r RNA基因表达范围广、表达量恒定,常作为内参基因应用于实时荧光定量PCR中。为了获得丝瓜18S r RNA基因,并设计合适的荧光定量PCR内参引物,解决丝瓜实时荧光定量PCR检测中无内参基因的现状,通过PCR和序列测定,首次克隆到了丝瓜的18S r RNA基因序列,其长度为1 862 bp,Gen Bank登录号为KM656452。在此基础上设计1对荧光定量PCR引物,该引物特异性强,扩增效率高,在丝瓜各生长发育阶段及各种非生物胁迫条件下均能稳定表达,适合在丝瓜基因表达研究中作为内参基因。该研究结果可为开展丝瓜重要功能基因的表达模式和调控机制的研究奠定基础。
宿欣[4]2017年在《五种吸虫核糖体全序列的扩增与特征分析》文中研究表明吸虫是一种呈世界性分布的,主要寄生于宿主肝胆管及小肠等部位的寄生虫,造成畜牧业巨大经济损失的同时,人兽共患寄生虫还对人类的健康造成严重的威胁,甚至危及生命。核糖体在细胞中广泛存在,在生命活动中起着重要的作用,也是蛋白质合成的重要场所,核糖体DNA为编码核糖体RNA的基因,由可转录的核糖体RNA和不可转录的间隔区组成,通过对核糖体序列的测定可以对物种进行鉴定,确定物种的分类地位,明确物种的多样性等。因此,本研究采用PCR等方法对人畜危害严重的土耳其斯坦裂体吸虫雌虫和雄虫、东方次睾吸虫、华支睾吸虫、曲领棘缘吸虫和圆圃棘口吸虫的核糖体全序列进行扩增,对5种吸虫核糖体全序列的结构特征及同源性进行分析,并以不同的标记基因构建吸虫的系统发生树。结果表明,5种吸虫核糖体全序列长度为8209~8917 bp,每种吸虫核糖体全序列的6段基因在长度上几乎无变化,仅有土耳其斯坦裂体吸虫雌虫、雄虫的IGS长度有轻微变化。通过比较发现5种虫体间5.8S同源性高达92.4~100%,进化速率较慢的18S和28S的同源性也分别高达89.7~99.8%和80.3~96.8%,而ITS1、ITS2和IGS同源性分别为56.4~94.8%、49.5~96.2%和34.2~94.1%。由此可见,在各段核糖体序列中,种内差异小,种间差异大。同时,我们还能得到6段核糖体序列的保守性排序为:5.8S>18S>28S>ITS1>ITS2>IGS。以不同标记基因构建的进化树,每个进化树并非完全与传统分类学相符,基于18S、28S构建的进化树,在科、目之间的进化关系与传统分类学不符;基于ITS1、IGS构建的进化树,在属之间的进化关系与传统分类学不符;基于ITS2构建的进化树,与传统分类学相符。可见18S、ITS1、ITS2、28S、IGS分别适合用于目及以上、科间、属间、目及以上、科之间的进化关系。同时,根据现有较少的IGS序列,我们能够推断IGS能够作为基因标记,对吸虫的进化关系进行探讨。本研究首次获得了5种吸虫30条虫体的核糖体全序列,并对其结构特征、同源性进行了分析,丰富了复殖吸虫的核糖体全序列的数据,确定了各段基因的保守性排序,采取不同核糖体基因构建吸虫的系统进化树结果表明,不同标记基因适合于不同的分类阶元。
魏国清, 代君君, 刘朝良, 张和禹[5]2006年在《家蚕核糖体18S RNA基因的序列分析及分子系统学研究》文中研究表明为研究家蚕18S DNA基因的特点及分子进化,以家蚕丝腺为材料提取家蚕基因组DNA,通过PCR扩增、测序鳞翅目家蚕(Bombyx mori)核糖体小亚基18S RNA基因(18S rDNA)的全序列,将该序列与等翅目、直翅目、衤责翅目、鞘翅目、膜翅目、双翅目、捻翅目、弹尾目、蜉蝣目各一种昆虫的18S rDNA进行了比较。用DNAstav软件分析并进行序列比对,结果表明,昆虫18S rDNA有4段序列较为保守,以18S rDNA比对的第2保守区段构建的分子系统发育树表明鳞翅目和双翅目、膜翅目、鞘翅目进化关系最近,等翅目、直翅目、衤责翅目进化上较为接近,捻翅目昆虫与弹尾目昆虫的亲缘关系较为接近,捻翅目在分类上应是一种古老的昆虫。
李晓贤, 周浙昆[6]2007年在《单子叶植物高级分类阶元系统演化:matK、rbcL和18S rDNA序列的证据》文中指出基于两个叶绿体基因(matK和rbcL)和一个核糖体基因(18S rDNA)的序列分析,对代表了基部被子植物和单子叶植物主要谱系分支的86科126属151种被子植物(单子叶植物58科86属101种)进行了系统演化关系分析。研究结果表明由胡椒目Piperales、樟目Laurales、木兰目Magnoliales和林仙目Canellales构成的真木兰类复合群是单子叶植物的姐妹群。单子叶植物的单系性在3个序列联合分析中得到98%的强烈自展支持。联合分析鉴定出9个单子叶植物主要谱系(广义泽泻目Alismatales、薯蓣目Dioscoreales、露兜树目Pandanales、天门冬目Asparagales、百合目Liliales、棕榈目Arecales、禾本目Poales、姜目Zingiberales、鸭跖草目Commelinales)和6个其他被子植物主要谱系(睡莲目Nymphaeales、真双子叶植物、木兰目、樟目、胡椒目、林仙目)。在单子叶植物内,菖蒲目Acorales(菖蒲属Acorus)是单子叶植物最早分化的一个谱系,广义泽泻目(包括天南星科Araceae和岩菖蒲科Tofieldiaceae)紧随其后分化出来,二者依次和其余单子叶植物类群构成姐妹群关系。无叶莲科Petrosaviaceae紧随广义的泽泻目之后分化出来,无叶莲科和剩余的单子叶植物类群形成姐妹群关系,并得到了较高的支持率。继无叶莲科之后分化的类群形成两个大的分支:一支是由露兜树目和薯蓣目构成,二者形成姐妹群关系;另一支是由天门冬目、百合目和鸭跖草类复合群组成,叁者之间的关系在单个序列分析和联合分析中不稳定,需要进一步扩大取样范围来确定。在鸭跖草类复合群分支内,鸭跖草目和姜目的姐妹群关系在3个序列联合分析和2个序列联合分析的严格一致树中均得到强烈的自展支持,获得的支持率均是100%。但是,对于棕榈目和禾本目在鸭跖草类中的系统位置以及它们和鸭跖草目-姜目之间的关系,有待进一步解决。值得注意的是,无叶莲科与其他单子叶植物类群(除菖蒲目和泽泻目外)的系统关系在本文中获得较高的自展支持率,薯蓣目和天门冬目的单系性在序列联合分析中都得到了较好的自展支持,而这些在以往的研究中通常支持率较低。鉴于菖蒲科和无叶莲科独特的系统演化位置,本文支持将其分别独立成菖蒲目和无叶莲目Petrosaviales的分类学界定。
刘娣[7]2008年在《秸秆纤维素高效降解真菌的筛选、鉴定及其纤维素酶基因克隆》文中研究指明我国每年的作物秸秆产出量约6.5亿吨,折合纤维素含量约2亿多吨,是自然界藴藏最丰富的可再生资源。但是作物秸秆由于组成成分结构的复杂性,不易降解已经成为生产中的障碍,特别在以种植业为主的地区,秸秆在短期内的不易腐解,加上直接还田影响墒情和耕作,导致废弃和焚烧秸秆遍及广大农村,由此引起环境污染和严重的资源浪费,获取高效降秸秆纤维素的微生物菌株及其制剂的应用是解决我国严峻秸秆问题技术的关键。本文进行了秸秆降解微生物的研究,取得了以下主要结果:利用稀释涂平板法从300个来自吉林,浙江,四川,河北,北京等地的土壤样品中初筛到360株秸秆纤维素降解菌,依据降解菌在平板上降解圈的大小,得到5株降解能力较强的真菌,分别命名为T1,HD5,HD6,HD7和HD24。这5株真菌均能以秸秆纤维素为唯一碳源良好生长。通过形态观察、18S rDNA序列分析和ITS序列分析鉴定这5株菌分别属于肉座菌属的Hypocrea lixii(Trichoderma harzianum)、曲霉属的黄曲霉(Aspergillus flavus)、曲霉属的烟曲霉(Aspergillus fumigatus)、木霉属的Trichoderma koningiopsis和青霉属的草酸青霉(Penicillium oxalicum)。纤维素降解菌株Hypocrea lixiiT1,Aspergillus flavus HD5,Aspergillus fumigatus HD6,Trichoderma koningiopsisHD7和Penicillium oxalicum HD24在固体平板上和液体培养基中都有很好的降解效果。在固体平板上,秸秆纤维素的添加量为1%时,Hypocrea lixiiT1,Aspergillus flavus HD5,Aspergillus fumigatus HD6,Trichoderma koningiopsisHD7和Penicillium oxalicum HD24 30℃培养7d,固体平板中央出现明显的降解透明圈,为20-25mm不等。在液体培养基中,Hypocrea lixii T1,Aspergillus flavus HD5,Aspergillus fumigatus HD6,Trichoderma koningiopsis HD7和Penicillium oxalicum HD24在第3d全酶活(FPA)均达到最大,其FPA的最大酶活力分别为25.4U,34.36U,28.85U,31.19U,32.05U,比标准菌株Trichoderma viride(AS3.3711)的酶活力分别高出21.88%,64.87%,38.43%,49.66%,53.79%。它们的最适反应温度均为50℃,但是菌株间产酶的pH值存在差异,菌株T1,HD5,HD6的最适pH值为5,菌株HD7的最适pH值为5.5,而菌株HD24的最适pH值为6。不同的氮源及其用量影响菌株降解纤维素的FPA活性,确定了菌株最佳的氮源种类及其用量:Hypocrea lixiiT1的最佳氮源为NaNO_3,添加量为1.5%;Aspergillus flavus HD5的最佳氮源为(NH_4)_2SO_4,添加量为2%;Aspergillus fumigatus HD6的最佳氮源为(NH_4)_2SO_4,添加量为0.5%;Trichoderma koningiopsisHD7的最佳氮源为(NH_4)_2SO_4,添加量为1.5%;Penicillium oxalicumHD24的最佳氮源为(NH_2)_2CO添加量为1%。添加0.1%蔗糖对菌株降解纤维素的FPA活性均呈现抑制作用,而添加0.1%的纤维二糖只对Hypocrea lixiiT1,Aspergillus flavus HD5,Aspergillus fumigatus HD6,Trichoderma koningiopsisHD7的FPA活性表现了一定的抑制效应,明显提高Penicillium oxalicumHD24的FPA活性;添加0.1%的Tween 20对Hypocrea lixiiT1, Aspergillus fumigatus HD6和Trichoderma koningiopsisHD7的FPA活性促进作用不明显,但显着提高了Aspergillus flavus HD5和Penicillium oxalicumHD24的FPA活性。利用SMART cDNA library Construction技术,构建了Hypocrea lixii T1,Aspergillus fumigatus HD6和Trichoderma koningiopsis HD7的cDNA文库:通过抽提总RNA,经反转录合成cDNA第一链,PCR合成第二链,制备了cDNA的全长片段,收集500bp以上的片段,与λTriplE载体重组,其库容量均达到10~9pfu/mL,重组载体经体外包装、转染E. coli LE392,在Amp+的抗性培养基上获得10万多个λ噬菌斑。利用纤维素底物诱导,筛选到了携带纤维素外切酶和内切酶基因的目的克隆子320个,挑选其中45个阳性克隆子,经PCR扩增测序和比对,获得3个新的纤维素酶基因。采用双向凝胶电泳(2DE)技术,研究了在相同培养条件下Trichoderma viride AS3.3711,Aspergillus fumigatus HD6,Trichoderma koningiopsisHD7和Penicillium oxalicum HD24的蛋白组学,结果表明纤维素酶的活性与其蛋白质的表达密切相关,这些菌株的2DE图谱之间也存在明显的差异,推测这些差异表达的蛋白质点可能与纤维素酶的种类、活性有关。
高凌云[8]2007年在《基于双壳纲18S rDNA序列的系统发生分析及核DNA含量与其进化地位关系的初步探讨》文中指出本研究以16种双壳类核糖体小亚基18S rDNA为目的片段,构建进化树进行系统发生学分析;以双壳纲38种贝类为实验材料,测定不同种类的DNA含量,在种间和种内两个层次上比较其差异;综合两方面结果,初步探讨双壳类DNA含量的差异与其进化过程的联系。1、系统发生分析本研究检测了双壳纲4目10科16个种的18S rDNA序列,与GenBank中的20种双壳类共同组成内群,以6种腹足类、4种多板类为外群,运用最大简约法、最大似然法和贝叶斯推演叁种方法分析了双壳纲的系统发生。结果显示:所有双壳纲的种类构成了单系发生的进化枝,与其姐妹群腹足纲聚在一起;双壳纲可以分为异齿亚纲和翼形亚纲两大类群,异齿亚纲是单系发生,翼形亚纲的系统发生关系则随方法的不同有所区别,牡蛎科的位置是造成此差异的主要因素。异齿亚纲内,海螂目单系发生,而帘蛤目是并系发生的。与其他分子研究的结论不同,本研究分析结果支持现有的分类系统,即异齿亚纲可以向下划分为两个目:帘蛤目和海螂目。竹蛏科位于进化树的基部,与异齿亚纲的其他种类构成单系群,显示了该科在异齿亚纲内较为原始的进化地位。双壳纲各科都构成了单系群,樱蛤科和截蛏科除外,前者并系发生,后者则多系发生,二者可能具有较近的亲缘关系。2、核DNA定量分析以鸡(Callus domesticus)血红细胞和贻贝(Mytilus edulis)鳃丝细胞为内标,运用流式细胞仪测定了38种贝类的核DNA含量。结果显示, DNA含量最少的是太平洋牡蛎(Crassostrea gigas)(2.06±0.03pg),最多的是硬壳蛤(Mercenaria mercenaria)(5.42±0.18pg)。双因素方差分析结果显示,同种贝类个体间差异不显着(p>0.05),而种间差异极为显着(p<0.01),前者仅占总差异的0.09%,而后者所占比例高达97.34%,可见种间差异显着大于种内差异。相关分析结果显示,实验贝类的DNA含量与染色体总数目、双臂染色体数目及染色体总臂数均呈不显着正相关关系;与单臂染色体数目呈不显着负相关关系。3、核DNA含量与进化地位的关系运用SPSS统计软件,在亚纲、目、科以及种4个分类等级上对双壳贝类的核DNA含量进行了统计分析。T检验结果显示,两亚纲核DNA含量的平均值有明显差异,异齿亚纲的核DNA含量平均值(3.77pg)显着大于翼形亚纲(3.14pg),该结果表明,核DNA含量在较高的分类等级,即亚纲上表现出随着进化地位的升高显着增大的趋势。方差分析结果显示,在较低的分类等级,即目、科以及种,核DNA含量与进化地位未发现显着的相关性。
宋悦, 赵权, 黄燕, 米荣升, 游艳敏[9]2017年在《隐孢子虫叁种实时荧光定量PCR检测方法的比较》文中进行了进一步梳理为筛选一种检测谱广、敏感性好、特异性高的隐孢子虫实时荧光定量PCR法,对JVAP18S法、Csp18S法和CRU18S法叁种隐孢子虫实时荧光定量PCR方法的敏感性、特异性和重复性进行了检测,并与基于18S r DNA序列的套式PCR方法进行了比较。结果显示,以10倍倍比稀释的含有微小隐孢子虫18S r DNA基因片段的重组质粒为模板,成功地建立了叁种实时荧光定量PCR方法;敏感性试验显示,JVAP18S法和Csp18S法最低可检测0.1个卵囊,而CRU18S法最低只能检测到1个卵囊,但他们均比套式PCR方法敏感;特异性试验结果显示,叁种实时荧光定量PCR法均可检测微小隐孢子虫(Cryptosporidium parvum)、泰泽隐孢子虫(Cryptosporidium tyzzeri)和贝氏隐孢子虫(Cryptosporidium baileyi),而其他属寄生虫和细菌DNA的检测结果均为阴性;重复性试验结果显示,JVAP18S法、Csp18S法和CRU18S法的批内变异系数分别为0.69%~2.68%、0.11%~4.93%、0.04%~2.89%,批间变异系数分别为0.52%~5.75%、2.09%~5.13%、1.15%~3.71%;对50份小鼠田间粪便样品检测结果显示,JVAP18S法检测的阳性率为84.00%,显着高于套式PCR法检测的64.00%的阳性率。上述结果表明,叁种实时荧光定量PCR法均能有效检测隐孢子虫,比较而言,JVAP18S法敏感性高、特异性强、重复性好,尤其适合于隐孢子虫含量较少的样品检测。
王帅, 程林, 杨利民, 韩梅[10]2019年在《SYBR GreenⅡ黄芩18S rRNA基因实时荧光定量PCR方法的建立》文中提出利用SYBR GreenⅡ染料法,建立黄芩实时荧光定量PCR的反应体系。根据18S rRNA基因序列保守性,在18S rRNA基因保守区设计一对特异性引物,以常规PCR产物为标准品,浓度梯度稀释后制定标准曲线,对溶解曲线进行分析,对PCR退火温度,引物浓度,模板浓度等反应条件进行优化。结果表明:在20μL反应体系中,加入10μL SYBR Premix Ex Taq TM时,引物和cDNA最佳加入量分别为0.8μL和1.0μL;最佳反应程序:进行40次循环,95℃预变性30 s,95℃变性5 s,55℃退火30 s,72℃延伸30 s。标准曲线Ct的检测范围在14～29,扩增效率为97.8%;溶解曲线显示为单峰,其Tm为(85±1.0)℃。本研究建立的黄芩18S rRNA基因实时荧光定量PCR法,具有检测范围广,扩增效率高,特异性高等优点,对从分子水平阐明黄芩药效成分合成机制,筛选高产优质的黄芩种质资源具有重要的意义。
参考文献：
[1]. 基于COI和18S rDNA基因序列的长腹剑水蚤属系统进化分析[D]. 王兴霞. 上海海洋大学. 2018
[2]. 利用宏基因组方法分析堆肥生境中微生物区系的变化[D]. 贾洋洋. 山东大学. 2012
[3]. 丝瓜18S rRNA基因克隆及其作为内参基因的应用[J]. 朱海生, 陈敏氡, 温庆放, 蓝新隆, 李永平. 核农学报. 2016
[4]. 五种吸虫核糖体全序列的扩增与特征分析[D]. 宿欣. 黑龙江八一农垦大学. 2017
[5]. 家蚕核糖体18S RNA基因的序列分析及分子系统学研究[J]. 魏国清, 代君君, 刘朝良, 张和禹. 经济动物学报. 2006
[6]. 单子叶植物高级分类阶元系统演化:matK、rbcL和18S rDNA序列的证据[J]. 李晓贤, 周浙昆. 植物分类学报. 2007
[7]. 秸秆纤维素高效降解真菌的筛选、鉴定及其纤维素酶基因克隆[D]. 刘娣. 中国农业科学院. 2008
[8]. 基于双壳纲18S rDNA序列的系统发生分析及核DNA含量与其进化地位关系的初步探讨[D]. 高凌云. 中国海洋大学. 2007
[9]. 隐孢子虫叁种实时荧光定量PCR检测方法的比较[J]. 宋悦, 赵权, 黄燕, 米荣升, 游艳敏. 中国动物传染病学报. 2017
[10]. SYBR GreenⅡ黄芩18S rRNA基因实时荧光定量PCR方法的建立[J]. 王帅, 程林, 杨利民, 韩梅. 分子植物育种. 2019
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