ELISA方法研究多糖与人干扰素-γ相互作用

ELISA方法研究多糖与人干扰素-γ相互作用

冯伟云, 赵鲁杭, 王克夷[1]2004年在《ELISA方法研究多糖与人干扰素-γ相互作用》文中认为目的 :建立一种体外研究多糖与干扰素 - γ(Interferon- γ,IFN- γ)相互作用的 EL ISA方法。方法 :在硼氰氢化钠作用下合成肝素 -牛血清白蛋白复合物 (Heparin- BSA Complex,HBC) ,Sepharose4 B凝胶过滤系统分离纯化 HBC,并用 SDS- PAGE鉴定。将 HBC(相当于 0 .5 μg蛋白含量 )包被在酶标板上 ,EL ISA方法检测 HBC与 IFN- γ的相互作用 ,并探讨游离肝素、低分子量肝素、硫酸软骨素 A、硫酸软骨素 C和透明质酸 ,以及卡拉胶等多糖对这种结合的影响。结果 :IFN- γ与 HBC的结合呈 IFN- γ剂量依赖性 ,2 ng左右达到饱和。游离肝素和低分子量肝素以及其他多糖均不同程度地抑制了 IFN- γ与 HBC的结合 ,肝素和低分子肝素的 IC50 分别为 2 .4 μg/ ml和 18.6 μg/ml。结论 :IFN- γ与肝素、卡拉胶高亲和力结合 ,而与硫酸软骨素 A、硫酸软骨素 C、透明质酸结合力极弱。EL ISA是一个简单、灵敏的研究细胞因子与多糖相互作用的方法

冯伟云[2]2004年在《ELISA方法研究多糖与人干扰素-γ相互作用》文中指出[目的] 肝素是由N-乙酰葡萄糖胺与D-葡萄糖醛酸以1→4糖苷键连接起来的重复二糖单位组成的线性多糖,葡萄糖胺可带有N-硫酸基团,可在C6上形成0-硫酸酯,带有硫酸基团的独特结构参与了肝素与其他分子的相互作用。肝素能够与许多蛋白质结合并调节蛋白活性,包括细胞因子、生长因子、趋化因子、抗血管生成因子、粘附分子和补体成分等,肝素通过与蛋白相互作用发挥其生物学活性。肝素作为抗凝血试剂广泛地用于临床各种疾病并发的弥散性血管内凝血、心脏手术的体外循环、血栓形成或栓塞的防治。除了抗凝血活性外,肝素还具有调节免疫功能、抑制炎症反应、抑制肿瘤细胞的生成和转移及抗病毒等功能,但是肝素的抗凝血活性及出血性并发症限制了肝素抗炎症和抗肿瘤等其他生物学活性的临床应用。因此,我们试图寻找一些硫酸多糖来替代肝素的一些生物学活性而避免肝素的副作用。 以往主要是通过Sepharose-heparin亲和层析来研究肝素与蛋白的相互作用;20世纪90年代又发展了affinity-coelectrophoresis(ACE)技术研究蛋白质与肝素的相互作用。但亲和层析柱易被污染失活,ACE技术不能提供生理pH范围和离子强度及ACE技术必需的标记肝素的放射性物质对人和环境具有很大危害。为了避免这些不足及更加直观地反映肝素与蛋白的相互作用,本课题组通过化学方法合成肝素-牛血清白蛋白复合物(HBC),通过牛血清白蛋白将肝素包被到酶标板上,建立了一种酶联免疫吸附实验(ELISA)技术来体外检测肝素与IFN-γ的结合,为进一步研究其他多糖与浙江大学硕士学位论文蛋白质的结合特性提供简单、灵敏的方法。〔方法〕 与蛋白多肤不同,糖链很难吸附在酶标板上,为了用ELI SA方法研究肝素与于扰素一Y的相互作用,肝素和牛血清白蛋白(日SA)在硼氢氰化钠作用下合成肝素一牛血清白蛋白复合物(lIBC)。反应产物经Sephorose4B凝胶过滤层析系统分离纯化日BC,除去反应产物中游离的肝素和l,SA。纯化的HBC经SDS一队GE鉴定,选择纯度最高的HBC组分,通过I3CA蛋白定量试剂盒测定HBC中的蛋白含量。 将HBC(相当于0.5拜g蛋白含量)包被在酶标板上,ELISA方法检测肝素与IFN一Y的相互作用,用相同蛋白含量的BSA一对照作为对照。为了进一步研究游离肝素(heparin)、低分子量肝素(LMw素A(CS一A)、硫酸软骨素C(CS一C)、(HA)、hepa五n)、硫酸软骨硫酸葡聚糖(DxS)、葡聚糖(Dx)、(Carrageenans)多聚半乳糖胺、等多糖对肝素与 透明质酸岩藻聚糖(fueoidan)以及卡拉胶IFN一Y结合的影响,进行了竞争性抑制ELISA实验。分析了多糖结构和硫酸基团在多糖与正N一Y相互作用中的作用。〔结果」 凝胶过滤层析获得了高纯度的HBC,通过HBC将肝素包被在酶标板上,EllSA实验表明,IFN一Y主要与HBC中的肝素结合(p(O,01)。IFN一Y与肝素的结合呈IFN一Y剂量依赖性,Zng左右达到饱和。游离肝素和低分子量肝素以及其他多糖均不同程度地抑制了IFN一Y与肝素的结合,各种多糖竞争性抑制的Ics。分别为游离肝素(2 .4拼留ml),低分子量肝素(18.6环岁ml),es一A(>500拜g/ml),CS一e(巧00拜g/ml),HA(247.13环g/ml),岩藻聚糖(0.0177拜g/ml),卡拉胶一K(8.33林留ml),卡拉胶爪(0.17井g/ml),卡拉胶一(6 .16拜g/ml)。〔结论}浙江大学硕士学位论文 多糖与工FN一Y的结合是一个复杂的过程,EL工SA是一个简单、灵敏的体外研究蛋白与多糖相互作用的方法,能够在纳克水平检测到工FN一Y与肝素的结合。工FN一Y与肝素、低分子量肝素、DxS、岩藻聚糖及卡拉胶高亲和力结合,而与CS一A、CS一C、HA、Dx结合力极弱。

靳挺[3]2004年在《基因工程药物人干扰素-γ体外重折叠复性研究》文中研究指明通过外源基因在E. coli中的表达来获得蛋白质类药物,已经成为生产基因工程药物的重要手段,然而重组蛋白质在E. coli中易聚集形成不溶性、无活性的包涵体,如何对包涵体蛋白进行高浓度、高收率的复性,是重组蛋白质生产的关键性技术之一,且关系到基因工程药物的产业化。为此,本文对重组人干扰素-γ包涵体的重折叠复性进行了研究,以有助于这一问题的解决。 首先对重组人干扰素-γ基因工程菌(pBV220IFN-γDH5α)的培养条件进行了研究,通过考察不同的培养和诱导时间,并对培养基的组成和发酵条件进行了优化,得出了优选实验方案:人干扰素-γ基因工程菌在30℃培养8h,升温至42℃诱导6h,培养基组成为葡萄糖2g/L,胰蛋白胨15g/L,酵母提取物7.5g/L,NaCl 5g/L,Na_2HPO_4·12H_2O 12.6g/L,KH_2PO_4 3g/L,NH_4Cl 1.0g/L,1mol/L MgSO4 2mL/L,发酵条件为摇床转速:220r/min,接种量:1%,装液量:20%,pH:6.8。按此方案进行发酵实验,表达的人干扰素-γ包涵体占菌体总蛋白的60%以上,每升发酵液可获得1.6g包涵体。 稀释复性法是研究其它复性方法的基础。为消除杂质对复性的影响,在复性前,应对包涵体粗品进行洗涤。Triton X-100能有效地溶解杂蛋白,洗涤后的包涵体纯度可达88%左右。7mol/L盐酸胍和8mol/L尿素能有效溶解重组人干扰素-γ,包涵体。在4℃、pH 8.0、尿素浓度1.0mol/L、蛋白浓度0.1mg/mL及脉冲加样操作方式等条件下,复性后人干扰素-γ的活性为2.39×10~5IU/mL,比活达2.21×10~7IU/mg。 以SP Sepharose Fast Flow尿素梯度离子交换层析柱作为蛋白质复性系统,在高蛋白浓度下,能有效地复性重组人干扰素-γ,包涵体,并实现了复性和纯化的过程集成化。在上样量:2.5mg;流速:0.5mL/min;尿素梯度长度:3.4Column Volume;尿素终浓度:2mol/L的实验条件下,复性后人干扰素-γ的比活为7.5×10~5IU/mg,蛋白收率为:54%,纯度>95%。利用Superdex 75凝胶柱,分析离子交换层析复性的样品,证实重组人干扰素-γ的纯度很高,并且没有聚集体存在。 扩张床的处理量大,通过逐渐降低层析柱内的尿素浓度,使吸附在STREAMLINE SP凝胶上的蛋白质复性,在完成复性的同时又纯化了目标蛋白,实现了复性和纯化的集成化。在上样量:23.2mg;膨胀率:2.5;尿素梯度长度:6CV;尿素终浓度:3mol/L的实验条件下,复性后人干扰素-γ的比活为8.18×10~6IU/mg,蛋白收率为:52.7%,纯度>90%。浙江大学博士学位论文摘要 小分子伴侣Shi GroEL191一345在E.。011中表达、经3.7L罐发酵,再经过Ni一NTA亲和层析和脱盐两步纯化步骤,最终收获目标蛋白为216.2m留L发酵液,小分子伴侣Sht GroELI 91一345的总收率约80%,纯度大于95%。游离和固定化小分子伴侣sht GroEL191一345小分子伴侣能有效地协助rhIFN一丫包涵体的复性,在蛋白浓度100抖g/mL、巧℃、复性4h的条件下,复性后人干扰素一Y的总活性分别为6.63xl护Iu/mL和9.67x10s Iu/mL,蛋白收率分别为:32.5%和47.5%。 经荧光光谱测定,重折迭人干扰素一了的构象接近于天然构象,表明复性较为完全。

伦玉宁[4]2013年在《四氢嘧啶类化合物ZL-5015的免疫抑制作用及其作用机制研究》文中研究表明目的新型四氢嘧啶类化合物ZL-5015(1,3-二环戊基-1,2,3,6-四氢嘧啶-4,5-、甲酸二乙酯)兼具抗炎和免疫抑制活性,本研究采用体内和体外实验模型探讨ZL-5015的免疫抑制作用特点及作用机制,为后续的结构改造及深入的作用机制研究提供参考信息。研究内容1.ZL-5015对正常小鼠免疫功能的影响1.1对体液免疫功能的影响---兔红细胞免疫小鼠产生血清溶血素(IgM)模型1.1.1材料与方法BALB/c小鼠50只,随机分为5组,各组动物均连续7天给药,给药后第2天上午,每只鼠腹腔注射20%(V/V)的兔红细胞生理盐水0.2ml进行免疫,同日下午继续给药,免疫后第6天(免疫当天为第0天),动物摘眼球取血,分光光度法检测各组小鼠血清中的溶血素水平。1.1.2结果ZL-5015高、中剂量组(200.100mg/kg.b.w)能明显抑制小鼠血清溶血素水平,抑制率分别为32.8%和20.0%(P=0.000,P=0.000),ZL-5015低剂量组(50mg/kg.b.w)能轻微抑制小鼠血清溶血素水平,但与溶媒对照组比较差异无统计学意义(P=0.131)。1.2对细胞免疫功能的影响---二硝基氟苯(DNFB)诱导小鼠迟发型超敏反应(DTH)模型1.2.1材料与方法BALB/c小鼠50只,随机分为5组,给药第一天用1%DNFB致敏小鼠,连续给药7天,于致敏后第7天,取1%DNFB丙酮-橄榄油(1:1)20gL均匀涂布于每只小鼠右耳的两面进行攻击。于攻击24h后,给小鼠称重,颈椎脱臼处死,剪下左右耳廓,以左右耳片质量差值作为肿胀度,并计算肿胀率。取出脾脏和胸腺称重并计算相应的器官指数。1.2.2结果ZL-5015高、中、低剂量组(200、100、50mg/kg.b.w)与模型组比较,均能显着抑制二硝基氟苯诱导的小鼠耳廓肿胀(P=0.000,P=0.000,P=0.015),抑制率分别为:56.45%、47.58%、29.84%。ZL-5015高剂量(200mg/kg.b.w)能抑制小鼠的脾脏指数(P=0.013),中、低剂量组(100、50mg/kg.b.w)无抑制作用(P=0.482,P=0.418)。ZL-5015高、中、低剂量组(200、100.50mg/kg.b.w)对小鼠的胸腺指数无显着影响(P=0.384,P=0.527,P=0.570)。1.3ZL-5015对网状内皮细胞(巨噬细胞)吞噬功能的影响(碳粒廓清实验)1.3.1材料与方法BALB/c小鼠50只,随机分为5组,连续给药7天。末次给药1h后,先称小鼠体重,每只小鼠尾静脉均注射印度墨汁(用生理盐水稀释6倍),按0.1ml/10g注射。分别于注射后于1min(t1)和10min(t10)小鼠眼球取血,检测OD450值,最后将小鼠颈椎脱臼处死,同时摘取小鼠肝脏、脾脏,并称湿重,计算廓清指数(K)及吞噬指数(A)。1.3.2结果化合物ZL-5015高、中、低剂量组(200、100、50mg/kg.b.w)对小鼠吞噬指数A无明显影响(P=1.000,P=0.999,P=1.000)。2.ZL-5015对大鼠佐剂性关节炎模型的影响2.1ZL-5015对大鼠佐剂性关节炎模型关节炎指数、足趾肿胀度、体重的影响2.1.1材料与方法雌性SD大鼠48只,随机分为6组,每只鼠左后足趾皮内注射100μL弗氏佐剂,致炎后第16天开始给药和测量,共给药12天。采用排水法测足部体积:在大鼠足部踝骨关节突出部位划一条线作为标记,用足趾肿胀仪测量,间隔4天测一次足趾肿胀情况及体重。SD大鼠免疫后,根据大鼠四肢关节炎症的红、肿及硬化程度,计算多发性关节炎指数。2.1.2结果致炎后第20天,ZL-5015高剂量(200mg/kg.b.w)处理组关节炎指数与模型组比较明显下降,下降率为20.0%(P=0.010),说明此时高剂量药物开始起效。对足趾肿胀及体重无显着影响。致炎后第24天,ZL-5015高、中、低剂量(200、100、50mg/kg.b.w)使关节炎指数分别下降34.5%、25.0%、19.0%(P=0.000,P=0.001,P=0.010)。高剂量能使足趾肿胀度下降49.5%(P=0.048),中、低剂量使足趾肿胀度分别下降40.4%及21.5%,但无统计学意义(P=0.194,P=0.845)。对体重有增重趋势,但差异无统计学意义。致炎后第28天,ZL-5015高、中、低剂量(200、100、50mg/kg.b.w)使关节炎指数分别下降43.0%、36.7%、26.6(P=0.000,P=0.000,P=0.001)。高、中剂量使足趾肿胀分别下降54.0%及48.7%(P=0.034,P=0.041),低剂量下降39.4%,但差异无统计学意义(P=0.150)。对体重有增重趋势,但差异无统计学意义。2.2ZL-5015对弗氏佐剂关节炎大鼠血清促炎细胞因子的影响2.2.1材料与方法于佐剂关节炎造模第28天,股动脉取血,3000rpm离心10min,取上清,ELISA方法检测IL-1β及TNF-α活性2.2.2结果ZL-5015高、中剂量(200、100mg/kg)与模型组比较,均可显着降低关节炎大鼠血清IL-1β的水平(P=0.006,P=0.049),且有浓度依赖趋势,抑制率分别为:27.0%,19.1%;ZL-5015低剂量组(50mg/kg)可以轻微降低大鼠血清IL-1β的水平(P=0.426)。ZL-5015高、中剂量组(200、100mg/kg)均可以显着降低大鼠血清TNF-a的水平(P=0.000,P=0.005),且有浓度依赖趋势,抑制率分别为:29.2%,21.6%;ZL-5015低剂量组(50mg/kg可以轻微降低大鼠血清TNF-α的水平,但差异无统计学意义(P=0.173)。2.3ZL-5015对关节炎部位促炎细胞因子的影响2.3.1材料与方法于造模第28天,大鼠断头处死,在非致炎侧踝关节上方0.5cm处摘取肿胀的足爪,剪碎,生理盐水浸泡过夜,离心取上清,ELISA方法检测IL-1β及TNF-a活性。2.3.2结果ZL-5015高、中剂量(200、100mg/kg)与模型组比较,均可显着减少关节炎部位IL-1β的含量(P=0.000,P=0.019),且有浓度依赖趋势,抑制率分别为:30.3%,19.3%;ZL-5015低剂量(50mg/kg)可以轻微减少炎症部位IL-1β的含量,但差异无统计学意义(P=0.123)。ZL-5015高、中、低剂量组(200、100、50mg/kg)均可显着减少炎症部位TNF-α的含量(P=0.000,P=0.004,P=0.039),且有浓度依赖趋势,抑制率分别为:31.9%,22.0%和15.2%。3.ZL-5015对淋巴细胞功能的影响3.1ZL-5015对Con A和LPS诱导小鼠脾细胞增殖反应的影响3.1.1材料与方法Balb/c小鼠两只,常规制备脾细胞悬液,Con A(4μg/ml)和LPS(10μg/ml)刺激小鼠脾细胞增殖作为体外免疫模型,检测给药48小时后各组细胞的代谢活力。3.1.2结果ZL-5015高、中、低剂量均可以显着抑制Con A诱导的小鼠脾细胞增殖反应,(P=0.000,P=0.000,P=0.000),且有浓度依赖趋势,抑制率分别是:33.10%、21.0%和13.28%。ZL-5015高、中剂量组均可以显着抑制LPS诱导的小鼠脾细胞增殖反应(P=0.000,P=0.000),且有浓度依赖趋势,抑制率分别是:25.90%、14.95%,ZL-5015低剂量组有轻微抑制LPS诱导的小鼠脾细胞增殖反应的趋势,但差异无统计学意义(P=0.087)。3.2ZL-5015对混合淋巴细胞培养反应的影响3.2.1材料与方法将BALB/c小鼠和C57BL/6J小鼠的脾细胞分别制成悬液,按照1:1混合制成细胞浓度为6x106个/mL的细胞悬液,按分组加入药物,用96孔培养板培养72h后各组细胞的代谢活力。3.2.2结果ZL-5015高、中、低剂量组均可以显着抑制混合淋巴细胞的增殖反应(P=0.000,P=0.000,P=0.037),且有浓度依赖趋势,抑制率分别是:37.2%、17.4%和5.0%。3.3ZL-5015对Con A刺激小鼠脾细胞分泌白介素2和干扰素γ的影响3.3.1材料与方法Balb/c小鼠两只,常规制备脾细胞悬液,Con A(4μg/ml)刺激小鼠脾细胞活化,检测给药48小时后各组细胞中上清液白细胞介素2和干扰素γ的含量。3.3.2结果ZL-5015高、中、低剂量组(40、20、10μM)均可显着抑制Con A诱导的小鼠脾细胞分泌白介素2(P=0.000,P=0.000,P=0.007),且有浓度依赖趋势,抑制率分别是:29.37%、20.31%和11.35%。ZL-5015高、中、低剂量组(40、20、10μM)均可以显着抑制Con A诱导的小鼠脾细胞分泌干扰素γ(P=0.000,P=0.002,P=0.030),且有浓度依赖趋势,抑制率分别是:31.9%、23.6%和15.9%。3.4ZL-5015对小鼠脾细胞细胞因子mRNA表达的抑制作用3.4.1材料与方法Balb/c小鼠两只,常规制备脾细胞悬液,Con A(4μg/ml)刺激小鼠脾细胞活化,使用荧光定量PCR检测给药48小时后各组细胞中白细胞介素2和干扰素γmRNA表达的变化。3.4.2结果ZL-5015(40.20.10μM)可抑制由Con A诱导的IL-2mRNA的表达(P=0.010,P=0.024,P=0.048)。ZL-5015(40、20、10μM)可抑制由Con A诱导的INF-γmRNA的表达(P=0.005,P=0.013,P=0.043)。3.5ZL-5015对LPS刺激小鼠脾细胞分泌IgG1和IgG2a的影响3.5.1材料与方法Balb/c小鼠两只,常规制备脾细胞悬液,LPS(10μg/ml)激小鼠脾细胞活化,各组给药作用48小时后,收集培养上清液检测IgGl和IgG2a的含量。3.5.2结果ZL-5015高、中剂量组(40、20μM)均可以显着抑制LPS诱导的小鼠脾细胞分泌IgGl,(P=0.000,P=0.001),且有浓度依赖趋势,抑制率分别是:27.8%、18.0%;ZL-5015低剂量组(10μM)可以轻微抑制LPS诱导的小鼠脾细胞分泌IgGl,但差异无统计学意义(P=0.105)。ZL-5015高、中、低剂量组(40、20、10μM)均可以显着抑制LPS诱导的小鼠脾细胞分泌IgG2a(P=0.000,P=0.000,P=0.011),且有浓度依赖趋势,抑制率分别是:31.6%、22.7%和13.7%。3.6ZL-5015对T细胞亚类的影响3.6.1材料与方法脾细胞制备、实验分组及给药均同3.5.1所述,48小时后收集细胞,用荧光标记的抗小鼠CD3、CD4、 CD8抗体染色,流式细胞仪检测。统计方法3.6.2结果ZL-5015主要降低Con A诱导的CD4弱表达和CD3弱表达T细胞亚群(CD4LowCD3Low)的比例。统计学处理应用SPSS11.5统计软件进行统计分析。T细胞亚类占细胞总数的比例以百分数表示,先采用RxC表资料的卡方检验对各组细胞的百分率差异进行多组间的总体检验,然后采用四格表资料的卡方检验进行组间细胞百分率的两两比较。定量数据结果以均数±标准差表示,采用单向方差分析法分析,先进行方差齐性检验,若方差齐用LSD方法多重比较;若方差不齐,采用Welch F检验和Dunnett's T3法多重比较。显着性水准取α=0.05,以P<0.05时,组间差异具有统计学意义。结论1、ZL-5015可降低兔红细胞诱导小鼠产生血清溶血素的活性,降低二硝基氟苯诱导的小鼠耳廓的肿胀度,对小鼠碳粒廓清的速率无明显影响,提示对小鼠的体液免疫及细胞免疫功能有抑制作用,对非特异性免疫功能无影响。2、ZL-5015可以减轻弗氏佐剂关节炎模型的关节炎指数,足趾肿胀,提示对类风湿关节炎具有一定的临床应用前景。3、ZL-5015可以减少弗氏佐剂关节炎模型血清及炎症部位中的促炎细胞因子IL-1β和TNF-α的含量,提示对佐剂性关节炎的治疗作用与抑制促炎细胞因子的产生与关。4、ZL-5015可抑制Con A和LPS诱导的小鼠脾细胞的增殖反应,提示对T淋巴细胞和B淋巴细胞的增殖反应有直接的抑制作用。5、ZL-5015可以显着抑制混合淋巴细胞的增殖反应(代谢活力),提示对特异抗原诱导的淋巴细胞增殖反应有直接的抑制作用。6、ZL-5015可以显着抑制Con A诱导的小鼠脾细胞分泌白介素2和干扰素γ,提示其免疫抑制作用与抑制细胞因子的产生与分泌有关。7、ZL-5015可抑制由Con A诱导的IL-2及INF-y mRNA的表达,提示其抑制细胞因子产生的作用环节在mRNA表达水平。8、ZL-5015可以显着抑制LPS诱导的小鼠脾细胞分泌IgGl和IgG2a,提示其可直接作用于B淋巴细胞而抑制抗体的产生。9、ZL-5015可降低Con A诱导的CD4弱表达和CD3弱表达T细胞亚群(CD4LowCD3Low)的比例,提示其作用机制可能是抑制CD4+CD3+细胞的活化与增殖,从而抑制免疫反应。10、总之,ZL-5015对体液和细胞免疫反应均有抑制作用,对T和B淋巴细胞的增殖与分泌功能具有直接抑制作用,对自身免疫性疾病动物模型有效,但需要高剂量(100mg/kg以上),与现有临床药物相比其作用强度还不够理想,需要进一步结构改造。

曹伟[5]2014年在《益生菌对急性肝衰竭小鼠Notch信号通路的调控作用》文中认为背景:肝衰竭是多种因素(病毒、药物、肝毒性物质、酒精、遗传代谢性疾病等)引起的严重肝脏损害,导致其合成、解毒、排泄和生物转化等功能发生严重障碍或失代偿,出现以凝血功能障碍、黄疸、肝性脑病、腹水等为主要表现的一组临床症候群。急性肝衰竭(acute liverfailure, ALF)是其中一种亚型,起病急、死亡率高,发病2周内出现Ⅱ度以上肝性脑病。其发病机制复杂,目前尚不十分清楚。现已明确,肠源性内毒素血症在ALF的疾病进展中发挥着重要作用。内毒素的主要成分为脂多糖(lipopolysaccharide, LPS),其主要效应细胞是单核巨噬细胞。有学者发现LPS可激活巨噬细胞内Notch信号通路发挥多种生物学功能。目前关于Notch信号通路与炎症关系的研究尚存在争议,尤其是对白介素-10(interleukin-10, IL-10)的影响,有研究显示Notch信号通路可促进IL-10的分泌,但也有研究显示其可抑制IL-10的分泌。此外,最近研究发现LPS激活巨噬细胞Notch信号通路与晚期炎症介质高迁移率族蛋白B1(high mobility group protein B1, HMGB1)的分泌有关。HMGB1是内毒素血症中重要的晚期炎症介质,推测HMGB1在ALF的进展中也发挥着举足轻重的作用。目前,临床上应用益生菌辅助治疗肝病患者已取得很好的疗效,其可以通过调节肠道菌群失调,降低肠道内毒素的产生和吸收,减少血液循环中内毒素的含量,从而改善内毒素血症,对受损的肝脏起保护作用。但对其具体的作用机制尚不明确,且缺乏相关研究。肝衰竭死亡率高,虽然肝移植是最有效的治疗方法,但肝源奇缺、费用昂贵的矛盾仍非常突出。因此肝衰竭的预防显得尤为重要。非酒精性脂肪性肝病(nonalcoholic fatty liver disease, NAFLD)是目前仅次于病毒性肝炎的第二大肝病病因,NAFLD患者比健康人群更易进展为肝衰竭。早期诊断和治疗NAFLD,可在一定程度上预防肝衰竭的发生。非酒精性脂肪性肝炎(nonalcoholic steatohepatitis, NASH)是NAFLD疾病进展的重要限速步骤,因此NASH的早期诊断已成为肝衰竭的主要防治工作之一。目的:本研究通过腹腔注射D-氨基半乳糖建立小鼠ALF模型,并应用益生菌干预模型小鼠,通过检测血清丙氨酸氨基转移酶(alanineaminotransferase, ALT),天冬氨酸氨基转移酶(aspartate aminotransferase,AST)、IL-10、HMGB1及血浆LPS水平,肝组织内Jagged1、Notch1、Hes5mRNA和蛋白、NICD蛋白以及巨噬细胞活化标记物CD68的表达,同时行肝组织病理染色,观察益生菌干预后肝组织病理改变,以及LPS、IL-10、HMGB1与Notch信号通路相关指标的表达变化及意义;体外培养小鼠巨噬细胞株RAW264.7细胞,应用LPS和Notch信号通路的特异性阻断剂氮–[氮–(3,5-二氟苯乙酰)–L–丙氨酰]–S–苯基甘氨酸丁酯(N-[N-(3,5-difluorophenacetyl-L–alanyl)]-S–phenylglycinet-butyl ester, DAPT)进行干预,观察细胞上清液IL-10、HMGB1水平和细胞内Notch信号通路相关指标的表达变化,明确Notch信号通路在外源性LPS刺激巨噬细胞分泌细胞因子中的调控作用;同时应用正常小鼠血浆、ALF小鼠血浆和益生菌干预小鼠血浆分别刺激小鼠巨噬细胞株RAW264.7细胞,观察细胞上清液LPS、IL-10、HMGB1水平和细胞内Notch信号通路相关指标的表达变化,从整体、组织、细胞及分子水平探讨益生菌对于ALF的可能作用机制,为临床应用益生菌预防ALF提供新的理论基础和实验依据。此外,还通过检测NAFLD患者血清中与NAFLD发病密切相关的指标变化,应用统计学方法进行分析处理,建立NASH的无创诊断模型,从而为NASH的早期诊断,也为肝衰竭的预防提供新思路。方法:1益生菌对急性肝衰竭小鼠Notch信号通路的影响健康清洁级6-8周龄雄性BALB/c小鼠30只,体重(18-20)g,由河北医科大学动物实验中心提供。用标准饲料适应性喂养1周,随机分为以下叁组:a正常对照组10只:标准饲料喂养;b ALF模型组10只:标准饲料喂养,给予生理盐水(与益生菌干预组剂量相同)灌胃2周,于2周末腹腔注射3.0g/kg的D-氨基半乳糖(以生理盐水溶解,浓度为60mg/ml);c益生菌干预组10只:标准饲料喂养,给予益生菌(金双歧)900mg/kg/d(生理盐水配成100mg/ml混悬液)灌胃2周,于2周末腹腔注射3.0g/kg的D-氨基半乳糖(以生理盐水溶解,浓度为60mg/ml)。于腹腔注射3.0g/kg D-氨基半乳糖(造模)36小时处死全部小鼠,留取血清、血浆及肝组织。应用全自动生化分析仪测定血清ALT、AST水平;应用酶联免疫吸附(Enzyme-linked immunosorbent assay, ELISA)法测定血清IL-10、HMGB1水平;鲎试剂盒检查血浆LPS水平;取部分肝组织以10%中性甲醛溶液固定,用于常规苏木素-伊红(hematoxylin-eosin,HE)染色;实时荧光定量聚合酶链反应(real-time quantitative polymerasechain reaction, real time-PCR)法检测小鼠肝组织Jagged1、Notch1和Hes5mRNA的表达;Western Blot法检测小鼠肝组织Jagged1、Notch1、NICD和Hes5蛋白的表达变化;免疫组织化学染色方法检测小鼠肝组织CD68的表达。2Notch信号通路在脂多糖刺激巨噬细胞分泌细胞因子中的调控作用小鼠巨噬细胞株RAW264.7细胞购自中国医学科学院基础医学研究所基础医学细胞中心。将处于对数生长期的RAW264.7细胞接种在六孔板中,每孔5×105个细胞,用含10%胎牛血清和90%高糖DMEM培养至70%融合时进行分组干预。正常对照组:常规培养加入DMSO(剂量与LPS+DAPT组相同)培养24小时后,再加入1×PBS缓冲液(剂量与LPS组相同)继续培养30小时;LPS组:常规培养加入DMSO(剂量与LPS+DAPT组相同)培养24小时后,再加入LPS(100ng/ml)继续培养30小时;LPS+DAPT组:常规培养加入DAPT(10μM)培养24小时后[15],再加入LPS(100ng/ml)继续培养30小时;收取细胞及上清液。ELISA法测定细胞上清液IL-10、HMGB1水平;Real time-PCR法检测RAW264.7细胞Notch1、Hes5mRNA的表达;Western Blot法检测RAW264.7细胞NICD、Hes5蛋白的表达变化。3益生菌干预小鼠血浆调控巨噬细胞分泌细胞因子的分子机制将处于对数生长期的RAW264.7细胞接种在六孔板中,每孔5×105个细胞,用含10%胎牛血清和90%高糖DMEM培养至70%融合时进行分组干预。正常小鼠血浆干预组:80%细胞完全培养基(10%胎牛血清+90%高糖DMEM)+20%正常小鼠血浆培养48小时;ALF小鼠血浆干预组:80%细胞完全培养基(10%胎牛血清+90%高糖DMEM)+20%ALF小鼠血浆培养48小时;益生菌干预小鼠血浆干预组:80%细胞完全培养基(10%胎牛血清+90%高糖DMEM)+20%益生菌干预小鼠血浆培养48小时;收取细胞及上清液。ELISA法测定细胞上清液IL-10、HMGB1和LPS水平;Real time-PCR法检测血浆干预RAW264.7细胞Jagged1、Notch1、Hes5mRNA的表达;Western Blot法检测血浆干预RAW264.7细胞Jagged1、Notch1、NICD、Hes5蛋白的表达。4细胞角蛋白18、天冬氨酸氨基转移酶、血小板、甘油叁酯联合预测非酒精性脂肪性肝炎的发生入选患者均需行肝活检,诊断符合中华医学会肝病学分会脂肪肝和酒精性肝病学组制定的非酒精性脂肪性肝病诊疗指南(2010年修订版),同时排除酒精性脂肪性肝病(5年内乙醇摄入量男性≥40克/天或女性≥20克/天)或过量饮酒(男性乙醇摄入量≥140克/周或女性≥70克/周);病毒性肝炎;自身免疫性肝病;药物或毒物诱导的肝损害;遗传代谢性疾病(Wilson’s病、血色素沉着症、α1抗胰蛋白酶缺乏症等);胆道梗阻。根据肝组织病理学检查结果,将所有纳入的研究对象分为两组,即非-非酒精性脂肪性肝炎组(non-nonalcoholic steatohepatitis, non-NASH)和NASH组。计算患者体重指数、腰臀比;询问是否合并糖尿病、高血压、血脂异常及吸烟习惯;检测血清ALT、AST、总胆红素(total bilirubin,TB)、白蛋白(albumin, ALB)、碱性磷酸酶(alkaline phosphatase, ALP)、γ-谷氨酰转肽酶(γ-glutamyl transpeptidase, γ-GT)、国际标准化比率(international normalized ratio, INR)、血小板、白细胞(white blood cell,WBC)、肌酐、尿酸(Uric acid, UA)、空腹血糖(fasting glucose, FG)、甘油叁酯(triglycerides, TG),胆固醇(total cholesterol, TC)、血红蛋白、超敏反应蛋白(hs-Creactive protein, hs-CRP)和铁蛋白水平;ELISA法测定血清细胞角蛋白18(cytokeratin18, CK18)凋亡片段M30的水平。实验数据以x±s表示,单因素方差分析前进行正态性及方差齐性检验,Least-Significant-Difference法进行组间比较,双侧P<0.05为差异有统计学意义,P<0.01为有显着统计学意义。相关性分析采用直线相关分析法。应用SPSS13.0统计软件分析实验数据。结果:1益生菌对急性肝衰竭小鼠Notch信号通路的影响1.1小鼠的一般情况:正常对照组小鼠精神状态良好,食欲旺盛,对外界刺激或痛觉反应正常;ALF模型组小鼠精神萎靡,进食减少,动作迟缓,对外界刺激反应减弱;益生菌干预组小鼠精神、食欲及对界外刺激反应介于正常对照组与ALF模型组之间。1.2小鼠生化指标、血清HMGB1、IL-10及血浆LPS水平变化:ALF模型组小鼠血清ALT(848.404±94.828U/L)、AST(911.490±67.652U/L)、HMGB1(101.909±12.428μg/L)、IL-10(4627.884±842.453pg/ml)和血浆LPS(11.801±0.887EU/ml)水平均高于正常对照组(38.994±9.628U/L、55.279±7.499U/L、20.733±5.369μg/L、1064.924±238.455pg/ml、0.578±0.119EU/ml)(P值均<0.01);而益生菌干预组血清ALT(689.891±84.649U/L)、 AST (776.026±61.892U/L)、 HMGB1(82.556±9.719μg/L)、IL-10(3182.596±769.235pg/ml)和血浆LPS(7.396±0.919EU/ml)水平均较ALF模型组明显降低(P值均<0.01)。1.3肝组织病理学变化:光镜下,HE染色可见正常对照组小鼠肝组织内大小一致的肝细胞围绕肝小叶中央静脉呈放射状分布,肝细胞排列整齐,肝索结构完整;ALF模型组小鼠肝组织正常结构被破坏,肝索结构紊乱,可见大面积肝细胞坏死及大量炎性细胞浸润,残存肝细胞肿胀,呈气球样变;益生菌干预组小鼠肝细胞坏死、变性及炎性细胞浸润程度均较ALF模型组改善。1.4肝组织Jagged1、Notch1、Hes5mRNA和蛋白、NICD蛋白的表达:ALF模型组小鼠肝组织内Jagged1、Notch1、Hes5mRNA和蛋白、NICD蛋白的表达量均较正常对照组明显增加(P值均<0.01);而益生菌干预组上述指标的表达水平均较ALF模型组明显减少,差异有统计学意义(P值均<0.01或<0.05)。1.5肝组织CD68蛋白的表达:ALF模型组小鼠肝组织CD68蛋白(0.631±0.067μm2)较正常对照组(0.339±0.071μm2)明显增加(P<0.01);与ALF模型组比较,益生菌干预组CD68蛋白表达量(0.460±0.094μm2)明显减少(P<0.01)。1.6相关性分析小鼠血浆LPS水平与ALT、AST、Jagged1mRNA、Notch1mRNA、Hes5mRNA、Jagged1蛋白、Notch1蛋白、NICD蛋白、Hes5蛋白、血清HMGB1、IL-10水平及肝组织CD68蛋白的表达水平均呈正相关,相关系数分别为r=0.936、0.946、0.947、0.945、0.948、0.894、0.829、0.926、0.907、0.942、0.900、0.973(P值均<0.01)。2Notch信号通路在脂多糖刺激巨噬细胞分泌细胞因子中的调控作用2.1RAW264.7细胞上清液中HMGB1和IL-10的含量变化:正常对照组细胞上清液中可检测出低水平的HMGB1(0.213±0.046μg/L)和IL-10(59.192±23.304pg/ml)。经LPS刺激后细胞上清液HMGB(17.441±0.634μg/L)和IL-10(315.188±79.133pg/ml)水平均有不同程度的升高(P值均<0.01),其中以HMGB1升高为主;应用DAPT进行特异性阻断后,细胞上清液HMGB1(6.218±0.711μg/L)和IL-10(252.060±57.633pg/ml)水平均较LPS刺激组下降明显,以HMGB1下降最为显着,差异有统计学意义(P值<0.01或<0.05)。2.2DAPT特异性阻断剂对LPS诱导的RAW264.7细胞Notch1mRNA、Hes5mRNA和蛋白、NICD蛋白的影响:RAW264.7细胞经LPS刺激后,细胞内Notch1mRNA、Hes5mRNA和蛋白、NICD蛋白水平均较正常对照组明显升高(P值均<0.01);加入DAPT特异性阻断剂进行干预后,与LPS刺激组比较,上述指标的表达水平均显着降低,差异有统计学意义(P值均<0.01)。2.3相关性分析小鼠巨噬细胞株RAW264.7细胞上清液中HMGB1水平与Notch1mRNA、Hes5mRNA、NICD蛋白和Hes5蛋白均呈正相关,相关系数分别为r=0.849、0.933、0.833、0.866(P值均<0.01);细胞上清液中IL-10水平也与Notch1mRNA、Hes5mRNA、NICD蛋白和Hes5蛋白呈正相关,相关系数分别为r=0.798、0.810、0.821、0.834(P值均<0.01)。3益生菌干预小鼠血浆调控巨噬细胞分泌细胞因子的分子机制3.1小鼠血浆干预RAW264.7细胞上清液中HMGB1、IL-10和LPS的含量变化:正常小鼠血浆干预组细胞上清液中HMGB1(3.433±0.674μg/L)、IL-10(286.524±33.507pg/ml)和LPS(0.090±0.014EU/ml)水平较低;ALF小鼠血浆干预组细胞上清液中HMGB1(34.691±9.058μg/L)、IL-10(1812.736±185.574pg/ml)和LPS(2.102±0.121EU/ml)水平则较正常小鼠血浆干预组明显升高,差异有统计学意义(P值均<0.01);与ALF小鼠血浆干预组比较,益生菌干预小鼠血浆干预组细胞上清液HMGB1(20.058±2.278μg/L)、IL-10(1338.322±151.339pg/ml)和LPS(1.220±0.069EU/ml)水平均明显下降(P值均<0.01)。3.2小鼠血浆干预RAW264.7细胞内Jagged1、Notch1、Hes5mRNA和蛋白、NICD蛋白的表达变化:RAW264.7细胞经ALF小鼠血浆干预后,细胞内Jagged1、Notch1、Hes5mRNA和蛋白、NICD蛋白水平均较正常小鼠血浆干预组明显升高(P值均<0.01);加入益生菌干预小鼠血浆后,与ALF小鼠血浆干预组比较,上述指标表达水平显着降低,差异有统计学意义(P值均<0.01)。3.3相关性分析小鼠血浆干预RAW264.7细胞上清液LPS水平与Jagged1mRNA、Notch1mRNA、Hes5mRNA、Jagged1蛋白、Notch1蛋白、NICD蛋白、Hes5蛋白、细胞上清液HMGB1和IL-10水平均呈正相关,相关系数分别为r=0.969、0.911、0.955、0.931、0.889、0.937、0.940、0.913、0.965(P值均<0.01)。4细胞角蛋白18、天冬氨酸氨基转移酶、血小板、甘油叁酯联合预测非酒精性脂肪性肝炎的发生4.1人口学及实验室指标的变化:Non-NASH组和NASH组患者年龄、性别构成比、吸烟习惯、糖尿病、高血压、血脂异常、收缩压、舒张压、血清TB、WBC、血红蛋白、肌酐、INR、FG、TC和铁蛋白水平差异均无统计学意义(均P>0.05),而NASH患者BMI、WHR、血清AST、ALT、ALP、γ-GT、UA、hs-CRP、TG和血小板水平均较non-NASH组明显升高,血清ALB水平则明显降低(均P<0.05)。4.2血清CK18片段M30水平及其与肝组织病理学特征的相关性分析:NASH组患者血清CK18片段M30水平(372.9U/L(319.6,431.4))较non-NASH组(248.1U/L(237.5,266.6))明显升高(P<0.001)。其与肝组织脂变(r=0.492)、气球样变(r=0.211)、汇管区炎症(r=0.346)和纤维化分级(r=0.407)均成正相关(P<0.05或P<0.01)。4.3多变量分析:体重指数、腰臀比、血清AST、ALT、ALP、ALB、γ-GT、UA、hs-CRP、TG、CK-18片段M30及血小板均纳入多变量模型分析。其中ALT、血小板、CK-18片段M30和TG是NASH的预测因素。四个指标的AUROC分别为0.811(95%CI:0.722-0.899)、0.631(95%CI:0.515-0.746)、0.892(95%CI:0.824-0.960)和0.714(95%CI:0.611-0.818)。其中血清CK-18片段M30水平与ALT(r=0.639)和TG(r=0.390)水平均成正相关(均P<0.05),而与血小板无相关性(P>0.05)。4.4NASH预测模型:Logistic回归分析得出NASH预测模型,具体公式为-12.764+0.075×ALT(U/L)+0.013×血小板(×109/L)+0.012×CK-18片段M30(U/L)+0.006×TG(mg/dL)。该模型的AUROC为0.920(95%CI:0.866-0.974),临界值为0.361,敏感性、阳性预测值和阴性预测值均为89%,特异性为86%。结论:1应用D-氨基半乳糖腹腔注射小鼠可以成功复制ALF模型,其中血浆LPS水平的升高在ALF的发生发展中起着重要作用。2ALF小鼠血浆中升高的LPS可使肝组织内巨噬细胞活化,激活细胞内Notch信号通路,促进晚期重要炎症介质HMGB1和抗炎细胞因子IL-10的分泌,其中以升高HMGB1为主,参与肝脏的炎症损伤过程,加速ALF的疾病进展。3益生菌可通过降低ALF小鼠血浆LPS水平,减少肝组织中巨噬细胞的活化,抑制Notch信号转导,降低HMGB1和IL-10的水平,从而发挥保护肝脏的作用,为临床预防ALF提供了新的思路和方向。4由CK-18、ALT、血小板和甘油叁酯组成的无创诊断模型可准确预测NASH的发生,该模型可能在延缓NAFLD病情进展,改善患者预后及预防肝衰竭中发挥一定作用。

廖运学[6]2014年在《HMGB1表达水平与COPD大鼠肺动脉平滑肌细胞合成分泌的关系》文中指出慢性阻塞性肺疾病(COPD)是一种重要的慢性呼吸系统疾病,患病人数多,病死率高,已成为全球第四大致死疾病,而我国COPD总患者数高达4300万人,平均每分钟就有2.5人死于COPD。由于其缓慢进行性发展,严重影响患者的劳动能力和生活质量,人们对该病的重视程度已越来越高。COPD患者在急性发作期过后,临床症状虽有所缓解,但其肺功能仍在继续恶化,并且由于自身防御和免疫功能的降低以及外界各种有害因素的影响,经常反复发作,容易继发肺动脉高压,而逐渐产生各种心肺并发症。COPD发病机制复杂,与个人吸烟、环境破坏、空气污染、小气道感染、尘肺等关系密切,尤其PM2.5浓度与COPD息息相关。一项为期6个月的纵向研究表明,室内PM2.5和NO2的浓度升高与COPD患者夜间症状加重和急性发作增加有关。因此,预防COPD的主要措施是避免发病的高危因素、急性加重的诱发因素以及增强机体免疫力。戒烟是预防COPD的简单易行且有效措施。控制职业和环境污染,减少有害气体或有害颗粒的吸人,可减轻气道和肺的异常炎症反应;另有研究报道,如果早期发现和早期干预,且有利于防治COPD。研究证实,COPD是一种慢性全身性炎症反应性疾病。多种细胞因子及炎症介质如高迁移率族蛋白1(HMGB1)、干扰素γ(IFN-γ)、白介素6(IL-6)等参与炎症反应过程。高迁移率族蛋白系于上世纪60年代最早发现,一种含量丰富的高度保守的非组蛋白核蛋白,广泛分布于哺乳动物细胞,具有晚期促炎作用,因其在凝胶电泳中泳动速度快而得名。高迁移率族蛋白存在于多种细胞的细胞核、细胞质和细胞膜上,通过HMGB box与DNA结合。高迁移率族蛋白包含HMGB1、HMGB2、HMGB3叁个相关成员,且85%有同源性,同时HMGB1是在各种因素作用下以主动分泌和被动释放两种方式到达细胞核外。HMGB1是新近发现的晚期炎症细胞因子,具有免疫刺激特性,在COPD等疾病发病过程中具有重要作用。深入研究发现,HMGB1升高与血清中TNF一a、IL一plL一6等炎性细胞因子的水平上调有关。当细胞坏死或受损时,在TNF的作用下核内的HMGB1可释放到胞外,引发单核巨噬细胞分泌促炎因子;而促炎因子又可进一步促进HMGB1的分泌,形成正反馈环,或者说网络式级联放大“瀑布”效应。在炎性反应的后期,这种正反馈效应对炎性反应的维持具有重要的作用。1973年Younger和Salvin最先发现γ干扰素,其来自淋巴细胞。其生物学功能主要是免疫调节,诱导多种抗原提呈细胞表达MHC-I/II分子,活化单核、巨噬细胞,分泌IL-1、6、8及TNF-a等。IFN-γ还能活化中性粒细胞等,刺激血管内皮细胞,促进Th1细胞发育和抑制TH2细胞活化与增殖。IFN-γ诱导巨噬细胞可诱导性一氧化氮合酶(iNOS)产生,促进NO的合成, IFN-γ可增加LPS诱导的IL-1转录翻译和分泌。IL-6是TH2细胞因子的典型代表,主要由巨噬细胞、T细胞、B细胞等多种细胞产生,能调节多种细胞的生长与分化,如调节免疫应答、急性期反应及造血功能,并在抗感染免疫反应中起重要作用。IL-6在COPD等多种疾病时有明显改变;IL-6表达失调可引起许多疾病,其临床表现主要为发病时IL-6水平增高。研究显示,IL-6上升的水平与疾病的活动期以及治疗效果都密切相关,因此,对病人体液中IL-6水平的检测可反映患者的病情变化。COPD的全身炎症反应与肺血管重塑、肺动脉高压密切相关。研究表明,PASMCs不仅是肺血管重塑的主要效应细胞,而且可作为免疫细胞合成分泌相关细胞因子参与炎症发生、发展,促进肺血管重塑。作为主要前炎症细胞因子的HMGB1与COPD患者PASMCs的合成分泌功能之间是否存在调控关系未见相关报道。本实验以COPD模型大鼠原代培养的PASMCs为研究对象,采用分子生物学技术,从细胞水平内探讨HMGB1表达水平与PASMCs合成释放IFN-γ、IL-6等炎性细胞因子的相关性,以期进一步探讨COPD肺血管重塑、肺动脉高压的发病机制,并为进一步预治COPD提供实验依据和干预靶标。第一部分大鼠远端肺动脉平滑肌细胞原代培养及其生物学特性和功能的研究目的研究采用组织块贴壁法体外培养原代大鼠远端PASMCs,探讨COPD模型大鼠与正常大鼠远端PASMCs的生物学特性及功能的异同。方法SPF级SD雄性大鼠12只,分2组:(1)对照组:第1、14天经气道内注入同等剂量生理盐水,无香烟烟雾暴露,与模型组同等条件下正常饲养。(2) COPD大鼠模型组:于实验第1、14天经气道内注入脂多糖(LPS)溶液,200μg/次,香烟烟雾暴露1h/d,共8周。模型建立后,组织块贴壁法提取并原代培养各组大鼠远端PASMCs。倒置相差显微镜下观察细胞形态及生长特点;细胞免疫组化、透射电镜鉴定PASMCs;CCK8和细胞荧光流式细胞仪检测各组细胞增殖情况。结果倒置相差显微镜下PASMCs为长梭形或“鱼尾”状,为典型的“峰-谷”样生长,两组细胞形态及生长特点无明显差异;细胞免疫组化、透射电镜鉴定所培养的细胞98%以上为PASMCs;CCK8检测结果示:COPD模型组PASMCs吸光度(A值)高于生理盐水对照组(P<0.05);采用CFDASE通过流式细胞仪检测示:COPD模型组PASMCs增殖强于生理盐水对照组(P<0.05),即生理盐水对照组PASMCs荧光会增强。结论正常组与COPD模型组原代培养的PASMCs细胞形态学相似,但生物学特性不同,功能亦存在差异。第二部分HMGB1表达水平与COPD大鼠PASMCs合成分泌IFN-γ、IL-6的关系目的探讨慢性阻塞性肺疾病(COPD)模型大鼠远端肺动脉平滑肌细胞(PASMCs)高迁移率族蛋白B1(HMGB1)表达水平与其合成分泌干扰素-γ(IFN-γ)、IL-6的相关性及临床意义。方法建立COPD大鼠模型,原代培养PASMCs并鉴定,检测香烟烟雾提取物(CSE)及脂多糖(LPS)诱导下PASMCs合成分泌细胞因子的功能,实验分组:A组(对照组,加入含25%胎牛血清DMEM培养)、B组(另加入5%CSE0.5ml)、C组(另加入100ng/ml LPS0.1ml)、D组(另加入5%CSE0.5ml+100ng/mlLPS0.1ml),同时A、B、C、D四组另瓶培养,并分别加入1:1000抗HMGB1抗体0.2ml培养设立抗HMGB1抗体干预组(A1、B1、C1、D1);分别于培养12h、24h、48h、72h后,采用Western blot检测各组PASMCs中HMGB1蛋白表达变化,ELISA检测细胞培养上清液HMGB1、IFN-γ浓度,并进行相关分析。结果(1)光镜下见细胞呈长梭形或“峰、谷”状生长,α-actin免疫组化染色及细胞免疫荧光鉴定为PASMCs;(2) Western blot及ELISA法检测结果显示,培养12h后B、C、D实验组中HMGB1表达水平及细胞上清液HMGB1、IFN-γ、IL-6浓度较A组强(P<0.05),且B、C、D叁组呈依次递增(P<0.05);HMGB1蛋白表达水平与IFN-γ、IL-6浓度变化呈正相关(r=0.91、0.83);加入抗HMGB1抗体干预培养12h后,干预组与对应实验组相比HMGB1、IFN-γ、IL-6都减弱(P<0.05);同组内,于细胞培养12h、24h、48h、72h,Western blot及ELISA法检测结果均无明显差异(P>0.05)。结论1. COPD模型大鼠远端PASMCs合成分泌HMGB1较生理盐水对照组增加;2.HMGB1表达水平与IFN-γ、IL-6成正相关,抗HMGB1抗体可通过抑制HMGB1,下调IFN-γ、IL-6的表达,提示HMGB1可能成为临床上防治COPD炎症的干预靶点。

古小彬[7]2009年在《兔疥螨虫株的分子分类及其疫苗研究》文中研究表明兔疥螨病是家兔常见的多发性寄生虫病,具有高度接触性和传染性,能引起病兔发生剧痒及各种类型的皮炎,严重影响家兔的生长发育,降低皮毛质量,严重时可引起死亡,给养兔业造成巨大的经济损失。对该病病原的准确诊断是尽早对动物实施药物治疗、有效控制该病流行的关键。但长期以来,疥螨属内的螨虫虫种分类还是一个颇具争议的话题,疥螨的免疫机制也尚不清楚。目前,兔疥螨病防治仍以药物为主,尚无可用于免疫防制的疥螨疫苗。但药物长期使用不仅费用高,效果不理想,而且容易导致抗药虫株的出现和较严重的毒副作用,特别是药物在畜产品中的残留,通过食物链会对人体健康造成潜在威胁,有的甚至可能致癌。因此,本研究采用PCR技术扩增兔疥螨虫株的线粒体细胞色素氧化酶Ⅰ(COI)基因,并进行测序和序列分析;同时克隆兔疥螨的副肌球蛋白基因(Pmy),构建该基因的原核表达载体和真核表达载体,对兔疥螨副肌球蛋白核酸疫苗、重组副肌球蛋白(PmyP)和疥螨全虫蛋白(ScTP)免疫小鼠的体液免疫和细胞免疫应答进行分析,为解决兔疥螨虫株的分类地位和开发防治兔疥螨病的有效疫苗打下基础。主要研究工作和结果如下:1、采用PCR技术首次扩增了分离自中国兔和猪的4个疥螨分离株的线粒体细胞色素氧化酶Ⅰ(COI)基因,并与GenBank中注册的14个国外疥螨分离株的同源基因进行了比较。序列分析结果显示:扩增的4个疥螨株COI基因长度均为1427 bp,序列间无插入、缺失,A+T含量(73%)明显高于G+C含量(27%),碱基组成存在明显偏移。兔和猪的4个疥螨分离株间的COI基因同源性较高(99.1%~100.0%),它们与澳大利亚人疥螨株、国外动物疥螨株的同源性范围为98.4%~99.6%。在构建的NJ树中,分离自中国兔和猪的4个疥螨分离株同澳大利亚人疥螨分离株、国外动物疥螨分离株亲缘关系较近。根据疥螨COI基因同源性分析和系统树构建结果,我们认为分离自中国猪和兔的4个疥螨分离株与澳大利亚人疥螨分离株以及国外的动物疥螨分离株均应属于同一个种。2、首次扩增出兔疥螨副肌球蛋白基因的全序列,测序并进行了生物信息学分析。结果表明:兔疥螨副肌球蛋白基因全长2628bp,序列中A+T含量(58.1%)和G+C含量(41.9%)差异不明显;与已报道猪疥螨虫株、红狐疥螨虫株、大熊猫足螨、黑白花奶牛德州足螨、刺翼尘螨、热带无爪螨的副肌球蛋白基因的同源性分别为99.6%、99.5%、83.0%、82.6%、82.1%和82.0%,推导的氨基酸同源性分别为100.0%、97.6%、97.6%、94.4%、97.1%和95.2%。兔疥螨副肌球蛋白基因共编码875个氨基酸,以Glu、Leu和Gln的含量最高,Cys、Pro和Trp的含量最低:副肌球蛋白分子理论值为102.36 kDa,理论pI=5.59,带负电荷,无信号肽,无跨膜区,含有大量的亲水性区域,共有4个潜在的N-糖基化位点;其二级结构中含96.91%的α-螺旋,0.11%的β-转角,2.86%不规则盘绕。3、将构建的原核表达质粒pET32a-Pmy转化表达宿主菌BL21(DE3)进行原核表达,同时对表达条件进行优化,确立了pET32a-Pmy表达的最佳条件为37℃、0.2 mmol/LIPTG诱导6 h,融合表达的副肌球蛋白分子量为124.36 kDa,并以不溶的包涵体形式存在于菌体中:免疫印迹发现该表达蛋白能与疥螨病患兔血清相识别。将构建的真核表达载体pVAX1-Pmy转染COS-7细胞,通过RT-PCR及间接免疫荧光检测,表明pVAX1-Pmy真核表达质粒在COS-7细胞中得到正常转录与表达。4、将构建的兔疥螨副肌球蛋白DNA疫苗pVAX1-Pmy以100μg/只剂量肌肉注射免疫BALB/c小鼠,共免疫3次,每次间隔2周。一免后24 h、7 d、14 d、21 d、28 d、35 d、49 d、63 d、77 d及105 d采集小鼠的抗凝血、心脏、肝脏、脾脏、肺脏、肾脏、肌肉及脑组织,提取血液和各组织DNA进行PCR扩增。以纯化后的组织总DNA为模板,PCR法检测质粒DNA整合到小鼠细胞染色体基因组上的可能性,评价疫苗的安全性。结果表明:一免后24 h、7 d、14 d、21 d、28 d、35 d及49 d能在小鼠血液及各检测的组织器官检测到该质粒;一免后63 d,除脑组织外,其余各组织器官及血液中均有质粒的分布:一免后77d,只在血液、肌肉和心脏中检测到质粒;一免后105 d仅在注射部位的肌肉中检测到该质粒。纯化后的组织基因组DNA经PCR扩增均呈阴性,未发现整合情况,证实该DNA疫苗安全性好。5、pMD18-T-IL-2、pMD18-T-IL-4、pMD18-T-IFN-γ质粒分别经BamHⅠ+XhoⅠ、EcoRⅠ+XhoⅠ、EcoRⅠ+HindⅢ酶切后,与经相同限制性内切酶处理的pVAX1质粒,经胶回收后,连接、转化入DH5α。扩大培养后小量抽提质粒,经PCR和双酶切鉴定正确,表明成功构建了pVAX1-IL-2、pVAX1-IL-4和pVAX1-IFN-γ真核表达质粒。6、将120只BALB/c小鼠随机分成对照组(PBS组、pVAX1组)、DNA疫苗免疫组(Pmy组、Pmy+IL-2组、Pmy+IL-4组、Pmy+IFN组)、蛋白疫苗免疫组[兔疥螨全虫蛋白组(ScTP组)和重组副肌球蛋白组(PmyP组)](共8组)。PBS组:肌肉注射PBS液100μL;pVAX1组:肌肉注射pVAX1质粒100μg;Pmy组:肌肉注射pVAX1-Pmy质粒100μg;Pmy+IL-2组:肌肉注射质粒pVAX1-Pmy和pVAX1-IL-2各100μg;Pmy+IL-4组:肌肉注射质粒pVAX1-Pmy和pVAX1-IL-4各100μg;Pmy+IFN组:肌肉注射质粒pVAX1-Pmy和pVAX1-IFN-γ各100μg;PmyP组:皮下注射重组副肌球蛋白50μg:ScTP组:皮下注射兔疥螨全虫蛋白50μg。共免疫3次,每次间隔2周,检测小鼠的抗体水平(IgG、IgG1、IgG2a、IgE、IgM)、淋巴细胞增殖能力、脾细胞悬液分泌的细胞因子(IL-2、IL-4、IL-5及IFN-γ)含量及外周血CD4~+、CD8~+T淋巴细胞亚群的数量。ELISA检测小鼠血清中的抗体结果显示:ScTP组和PmyP组小鼠的IgG、IgG1抗体水平高于DNA疫苗组,但这两个组小鼠的IgG2a水平低于DNA疫苗组;一免后14d~42d,Pmy+IL-2组、Pmy+IL-4组、Pmy+IFN组小鼠的IgG水平高于Pmy组;Pmy+IL-4组产生IgG1的水平高于Pmy组,除免疫后14 d,其余检测时间内均差异显着(P<0.05);Pmy+IL-2组、Pmy+IFN组小鼠的IgG2a水平高于Pmy组,免疫后14 d~35 d,Pmy+IL-2组与Pmy组的差异显着(P<0.05);Pmy+IL-4组产生的IgE水平高于其他免疫组,免疫后14 d,差异显着(P<0.05);ScTP组和PmyP组产生的IgM水平高于各DNA疫苗组,免疫后7 d~35 d,与Pmy组差异显着(P<0.05):免疫后21 d~42 d,Pmy+IL-2组小鼠的IgM值高于Pmy组、Pmy+IL-4组、Pmy+IFN组,但差异不显着(P>0.05)。脾淋巴细胞增殖结果显示:ScTP组、PmyP组、Pmy组、Pmy+IL-2组、Pmy+IL-4组、Pmy+IFN组刺激指数明显高于pVAX1组刺激指数(P<0.05),且DNA疫苗组的增殖能力大于蛋白疫苗组。脾细胞悬液分泌的细胞因子检测结果显示:Pmy+IL-2组、Pmy+IFN组小鼠脾细胞悬液分泌的IL-2含量显着高于其他免疫组(P<0.05),它们分泌的IFN-γ显著高于Pmy+IL-4组、ScTP组及PmyP组(P<0.05),但这两组的小鼠脾细胞悬液分泌的IL-4显着低于其他疫苗免疫组(P<0.05);Pmy+IL-4组小鼠脾细胞悬液分泌的IL-4、IL-5显着高于其他疫苗免疫组(P<0.05)。外周血CD4~+、CD8~+T淋巴细胞亚群数量检测结果显示:ScTP组、PmyP组、Pmy组、Pmy+IL-2组、Pmy+IL-4组、Pmy+IFN组小鼠外周血CD4~+、CD8~+T数量明显高于空载体组(P<0.05)。从检测分析结果来看,疥螨全虫蛋白和重组副肌球蛋白免疫小鼠主要引起小鼠的Th2免疫应答;而pVAX1-Pmy+pVAX1-IL-2和pVAX1-Pmy+pVAX1-IFN-γ免疫小鼠后主要引起小鼠的Th1型免疫应答:pVAX1-Pmy+pVAX1-IL-4则主要引起小鼠的Th2型免疫应答;且疫苗免疫各组小鼠的T淋巴细胞均进行了有效增殖。本研究对兔疥螨全虫疫苗、兔疥螨重组副肌球蛋白疫苗及副肌球蛋白核酸疫苗的免疫应答进行了评价,为研制高效的兔疥螨疫苗奠定了基础。

唐神结[8]2014年在《慢性阻塞性肺疾病合并肺结核患者体液和细胞免疫功能的研究》文中指出第一部分慢性阻塞性肺疾病合并肺结核患者体液免疫功能的研究目的:慢性阻塞性肺疾病(COPD)易患结核病,然而,其确切机制尚未阐明。免疫机制可能参与了COPD伴发肺结核的发生与发展中,但相关研究很少,尤其是COPD合并肺结核患者体液免疫功能的研究更少。通过对COPD合并肺结核患者血清IgG、IgM和IgA的水平进行检测,了解其体液免疫功能状态,探讨COPD患者易患结核病的免疫发生机制。方法:对2009年1月至2012年3月在上海市肺科医院的COPD合并肺结核患者(COPD合并TB组)、肺结核患者(TB组)以及COPD患者(COPD组)和正常健康人(健康对照组)的体液免疫功能进行对比分析。采用免疫比浊法检测各组血清中IgM、IgG、IgA含量。数据的结果应用SPSS15.0统计学软件(SPSS Inc., IL)进行分析。四组间的比较采用的是K个独立样本的非参数检验中的Kruskal-Wallis检验。两组间的比较采用的是两个独立样本的非参数检验中的Mann-Whitney U检验。不同参数的相关性通过Spearman’s等级相关系数来确定。P<0.05为差异有统计学意义。结果:该研究共入选152例COPD合并肺结核患者、157例COPD患者、150肺结核患者以及50例正常健康人。COPD合并TB组血清IgG水平明显高于COPD组,差异有统计学意义(Z=-2.826,P=0.005)。TB组血清IgG水平明显高于COPD组,差异有统计学意义(Z=-2.595,P=0.009)。COPD合并TB组IgA含量明显高于COPD组,差异有统计学意义(Z=-3.377,P=0.001)。COPD合并TB组IgA含量明显高于健康对照组,差异有统计学意义(Z=-2.955,P=0.003)。TB组IgA含量明显高于COPD组,差异有统计学意义(Z=-3.640,P=0.000)。TB组IgA含量明显高于健康对照组,差异有统计学意义(Z=-3.066,P=0.002)。结论:COPD合并TB患者IgG和IgA水平均明显升高,这种增强的体液免疫应答在COPD并发肺结核发生过程中可能对机体起到一定的保护作用。第二部分慢性阻塞性肺疾病合并肺结核患者T淋巴细胞及NK细胞的变化及其意义目的:T淋巴细胞、自然杀伤(NK)细胞均参与了结核病及COPD的免疫发病过程。然而,这些细胞在COPD合并肺结核患者中的表达情况如何却知之甚少。为此,我们对COPD合并肺结核患者T淋巴细胞和NK细胞的水平进行检测,以探讨这些细胞在COPD合并结核病发生发展过程中的作用和意义。方法:对2009年1月至2012年3月在上海市肺科医院的COPD合并肺结核患者(COPD合并TB组)、肺结核患者(TB组)以及COPD患者(COPD组)和正常健康人(健康对照组)的免疫细胞水平进行对比分析。采用流式细胞仪(BDAccuri C6)抗体双标法测定NK细胞及T淋巴细胞亚群及其比率。数据的结果应用SPSS15.0统计学软件(SPSS Inc., IL)进行分析。四组间的比较采用的是K个独立样本的非参数检验中的Kruskal-Wallis检验。两组间的比较采用的是两个独立样本的非参数检验中的Mann-Whitney U检验。不同参数的相关性通过Spearman’s等级相关系数来确定。P<0.05为差异有统计学意义。结果:该研究共入选152例COPD合并肺结核患者、157例COPD患者、150肺结核患者以及50例正常健康人。COPD合并TB组、TB组和COPD组血清CD4+T细胞比率均低于健康对照组,差异有统计学意义(P≤0.001)。TB组血清CD4+T细胞比率明显高于COPD合并TB组,差异有统计学意义(P=0.02)。COPD合并TB组、TB组和COPD组血清CD8+T细胞比率均高于健康对照组,差异有高度统计学意义(P=0.000)。COPD合并TB组、TB组和COPD组血清CD4+/CD8+T细胞比值均低于健康对照组,差异有统计学意义(P=0.000)。TB组血清NK细胞比率明显低于其他各组,差异有统计学意义(P=0.000)。COPD合并TB组和COPD组之间NK细胞比率差异也无统计学意义(P>0.05),COPD合并TB组和健康对照组之间NK细胞比率差异无统计学意义(P>0.05),COPD组和健康对照组之间NK细胞比率差异无统计学意义(P>0.05)。结论:COPD合并TB患者血清CD4+T细胞比率、CD4+/CD8+T细胞比值均低于健康对照组, CD8+T细胞比率均高于健康对照组。表明,COPD合并肺结核患者细胞免疫功能受损。CD4+T细胞比率、CD4+/CD8+T细胞比值降低以及CD8+T细胞比率升高可能是其重要免疫发病机制之一。第叁部分慢性阻塞性肺疾病合并肺结核患者细胞因子的变化及其意义目的:多种CK参与结核病及COPD的免疫应答及免疫发病过程。然而,这些细胞因子在COPD合并肺结核患者中的表达状态和特征如何却知之甚少。为此,我们对COPD合并肺结核患者血清细胞因子水平进行检测,以探讨这些细胞因子在COPD合并结核病发生发展过程中的作用和意义。方法:对2009年1月至2012年3月在上海市肺科医院的COPD合并肺结核患者(COPD合并TB组)、肺结核患者(TB组)以及COPD患者(COPD组)和正常健康人(健康对照组)的细胞因子水平进行对比分析。采用双抗体夹心ELISA方法测定患者血清中IL-1、IL-5、IL-6、sIL-2R、TNF-、IFN-γ等细胞因子水平。数据的结果应用SPSS15.0统计学软件(SPSS Inc., IL)进行分析。四组间的比较采用的是K个独立样本的非参数检验中的Kruskal-Wallis检验。两组间的比较采用的是两个独立样本的非参数检验中的Mann-Whitney U检验。不同参数的相关性通过Spearman’s等级相关系数来确定。P<0.05为差异有统计学意义。结果:该研究共入选152例COPD合并肺结核患者、157例COPD患者、150肺结核患者以及50例正常健康人。COPD合并TB组IL-1水平明显低于健康对照组,差异有统计学意义(P=0.002)。TB组IL-1水平明显低于健康对照组(P=0.003)。COPD组IL-1水平明显低于健康对照组(P=0.000)。COPD合并TB组以及TB组sIL-2R水平均明显高于健康对照组(P=0.000)。COPD合并TB组sIL-2R水平明显高于TB组(P=0.041)。COPD合并TB组sIL-2R水平明显高于COPD组(P=0.000)。COPD合并TB组IL-5水平明显高于TB组(P=0.026)。TB组IL-5水平明显低于健康对照组(P=0.005)。COPD组IL-5水平高于TB组(P=0.011)。COPD合并TB组以及TB组IL-6水平明显高于健康对照组(P=0.000)。COPD合并TB组IL-6水平明显高于TB组(P=0.035)。COPD合并TB组IL-6水平明显高于COPD组(P=0.000)。COPD合并TB组以及TB组TNF-ɑ水平明显高于健康对照组(P=0.000)。COPD合并TB组TNF-ɑ水平明显高于TB组(P=0.003)。COPD合并TB组TNF-ɑ水平明显高于COPD组(P=0.000)。COPD合并TB组以及TB组IFN-γ水平明显高于COPD组和健康对照组(P=0.000)。COPD合并TB组IFN-γ水平明显高于COPD组(P=0.000)。中重度肺结核患者血清中IL-6、TNF-ɑ、IFN-γ水平明显高于轻度患者(P<0.05~0.01)。重度肺结核患者血清中sIL-2R、IL-6水平明显高于轻中度患者(P<0.05~0.01)。单纯COPD轻中度患者血清中IL-6、TNF-ɑ水平与COPD患者FEV1预计值呈明显负相关性(P=0.000)。结论:COPD合并TB患者血清某些细胞因子水平存在不同程度的失衡,提示其细胞免疫功能受到一定的损害,免疫受损的程度较单纯COPD和肺结核患者更为明显。同时表明,这些细胞因子在COPD合并肺结核的发生发展中起着重要作用。对COPD合并肺结核免疫功能的深入研究将进一步阐明其免疫发病机制,并为免疫干预治疗提供一定的理论依据。

周瑶瑶[9]2015年在《姜黄素介导THP-1来源巨噬细胞极化及其机制的研究》文中研究说明目的本研究旨在探讨姜黄素对THP-1来源巨噬细胞极化及炎症反应的影响,并且进一步探讨其可能的分子机制。方法用佛波酯(Phorbol myristate acetate,PMA)诱导人THP-1单核细胞分化为巨噬细胞,并用1μg/ml脂多糖(lipopolysaccharide,LPS)+20 ng/ml人干扰素γ(interferon-γ,INF-γ)使细胞进一步极化为M1型巨噬细胞。用氚标胸腺嘧啶核苷([3H]thymidine,3H-Td R)渗入法检测不同浓度姜黄素对巨噬细胞增殖的影响。分别用荧光定量Real-time PCR和酶联免疫吸附实验方法检测各分组中炎症因子TNFα、IL-6及IL-12的转录和分泌情况。流式细胞术和Western blot方法检测各组巨噬细胞的极性情况及Toll样受体4(Toll like receptor4,TLR4)-丝裂原活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinase,MAPK)/核因子κB(nuclear factorκB,NF-κB)信号通路的表达和磷酸化水平。另外,TLR4小干扰RNA和MAPK抑制剂用于研究TLR4-MAPK/NF-κB信号通路在介导巨噬细胞极化中的作用,以探讨姜黄素在调控巨噬细胞极化的分子机制。结果姜黄素在0~30μmol/L的浓度范围内,对THP-1来源巨噬细胞增殖无明显抑制作用,且其本身不影响巨噬细胞极性。姜黄素能明显抑制M1型巨噬细胞的极性及TNFα、IL-6和IL-12的表达,且呈浓度依赖性(P<0.05)。与对照组相比,姜黄素能明显抑制TLR4的表达及下游MAPK(p38,ERK1/2及JNK1/2)和NF-κB(IκBα及p65)通路的磷酸化(P<0.05)。同时,与空白对照组相比,TLR4小干扰RNA和MAPK抑制剂(SP600125,SCH772984及Skepinone-L)可分别减少姜黄素对M1型巨噬细胞极性的抑制作用(P<0.05)。结论姜黄素可通过抑制TLR4-MAPK/NF-κB通路的信号转导调控巨噬细胞的极化,从而达到抑制炎症反应的作用。

侯江厚[10]2012年在《免疫制剂在耐多药结核病治疗中作用的研究》文中进行了进一步梳理目的研究胸腺五肽、重组人白介素(2rh-IL-2)和重组人干扰素(γrh-IFN-γ)三种免疫制剂在巨噬细胞吞噬耐多药结核分枝杆菌中的作用及可能的机制。方法鼠源巨噬细胞用培养基稀释后加入48孔细胞培养板,每孔加入耐多药结核分枝杆菌,设为实验组和对照组,实验组由低到高分别加入不同浓度的胸腺五肽、rh-IL-2和rh-IFN-γ,对照组不加任何免疫制剂。培养24小时后,在显微镜下观察各组巨噬细胞吞噬耐多药结核分枝杆菌的活动情况,用实时荧光定量PCR(RT-qPCR)测定各组吞噬耐多药结核分枝杆菌的相对量。结果(1)显微镜下观察,与对照组比较,巨噬细胞在高浓度胸腺五肽和rh-IL-2作用下吞噬耐多药结核分枝杆菌的数量多于低浓度,而巨噬细胞在高浓度rh-IFN-γ的作用下吞噬耐多药结核分枝杆菌的数量少于低浓度。(2)实时荧光定量PCR测定显示,添加低浓度的胸腺五肽、rh-IL-2和rh-IFN-γ后,实验组Ratio较对照组分别高3.34、3.71和12.24,随着浓度增加,胸腺五肽的Ratio值增加,rh-IL-2的Ratio值无显着性变化,rh-IFN-γ的Ratio值降低。结论胸腺五肽、rh-IL-2和rh-IFN-γ在体外均能促进鼠源巨噬细胞吞噬耐多药结核分枝杆菌,其中,胸腺五肽的作用具有依赖性,rh-IL-2的作用与浓度无关,而rh-IFN-γ应选择最适低浓度。目的研究胸腺五肽、rh-IL-2和rh-IFN-γ在耐多药结核病(MDR-TB)小鼠中的治疗作用和免疫学机制。方法165只成年雄性BALB/c小鼠,用含耐多药结核分枝杆菌的气溶胶感染后,采用随机数字表法分为对照组(不给予任何药物治疗)和7个实验组(胸腺五肽组、rh-IL-2组、rh-IFN-γ组、莫西沙星组、胸腺五肽+莫西沙星组、rh-IL-2+莫西沙星组和rh-IFN-γ+莫西沙星组),每组20只,另有5只作空白对照的小鼠在感染21天(设定为治疗0周)脱颈处死,余下160只当天开始给药治疗,治疗4、8、16、20周各组脱颈处死5只,4只小鼠观察血清细胞因子IFN-γ和IL-10的水平,肺脾活菌(CFU)计数和肺脾质量指数,余下1只小鼠肺组织作病理切片。结果(1)对照组:20周时小鼠血清IFN-γ水平较0周增高(P <0.05),而各时间段小鼠血清IL-10水平无显着性差异(P>0.05)。8周开始小鼠肺组织CFU显着低于治疗0周(P <0.05),而各时间段小鼠脾组织CFU无显着性差异(P>0.05)。治疗16周、20周小鼠肺指数降低(P <0.05),但病理切片则显示肺组织炎症病变程度从治疗4周至16周逐渐加重。而各时间段小鼠脾指数无显着性差异(P>0.05)。(2)叁个免疫制剂治疗组(胸腺五肽组、rh-IL-2组和rh-IFN-γ组):①血清细胞因子水平:与对照组0周相比,叁个免疫制剂组小鼠血清IFN-γ水平于治疗20周时增高(P <0.05),而各时间段小鼠血清IL-10水平无明显变化(P>0.05)。在同一时间段,与对照组相比,胸腺五肽组于治疗4和8周时、rh-IL-2和rh-IFN-γ组于治疗8周时小鼠血清IFN-γ水平降低(P <0.05),而叁组小鼠血清IL-10则均与对照组相接近(P>0.05)。②肺、脾组织CFU:在治疗的不同时间段和相同时间段,叁个免疫制剂组小鼠肺组织CFU与对照组均相接近(P>0.05)。而在治疗的同一时段,与对照组相比,胸腺五肽组16、20周小鼠脾组织CFU降低(P <0.05),rh-IFN-γ组20周小鼠脾组织CFU降低(P <0.05),而rh-IL-2组小鼠脾组织CFU无明显变化(P>0.05)。③炎症:治疗8周时,叁个免疫制剂组肺指数较对照组降低(P<0.05),病理切片显示各时间段肺组织炎症病变程度均为轻度。叁个免疫制剂组脾指数均与对照组相接近(P>0.05)。(3)叁个免疫制剂辅助莫西沙星治疗组(胸腺五肽+莫西沙星组、rh-IL-2+莫西沙星组和rh-IFN-γ+莫西沙星组):①莫西沙星治疗:与对照组相比,治疗4、8、16周小鼠血清IFN-γ水平降低,治疗4周时IL-10水平降低(P <0.05);小鼠肺CFU于治疗4、8周降低、16、20周达到0(P <0.05),脾CFU自治疗4周起即达到0;脾、肺指数自治疗8周始均降低(P <0.05),病理切片显示肺组织轻度炎症病变。②叁个免疫制剂辅助莫西沙星治疗:叁个免疫制剂辅助莫西沙星治疗组小鼠血清细胞因子IFN-γ和IL-10水平、肺脾CFU、肺脾质量指数、病理切片肺组织病变程度与莫西沙星组均相接近,无显着性无差异(P>0.05)。结论(1)小鼠感染耐多药MTB后,其自身先天性免疫可发挥作用,可能通过增强Th1优势免疫应答,促进肺组织耐多药MTB的杀灭、减轻肺组织炎症。(2)叁种免疫制剂治疗早期(治疗8周)均可下调MDR-TB小鼠血清IFN-γ水平,但也不排除IFN-γ在免疫制剂促进巨噬细胞活化时被消耗,呈现Th1弱势免疫应答,但在治疗后期MDR-TB小鼠血清IFN-γ水平逐渐接近正常,恢复Th1优势免疫应答。这种免疫机制在治疗后期对清除小鼠脾组织耐多药MTB、在治疗早期减轻小鼠肺部炎症具有重要作用,但对清除小鼠肺组织耐多药MTB无明显作用。叁种免疫制剂比较,胸腺五肽和rh-IFN-γ促进小鼠脾脏杀菌作用较强。(3)叁种免疫制剂辅助莫西沙星治疗MDR-TB小鼠,因莫西沙星较为强大的杀菌作用,使叁种免疫制剂的辅助作用未能体现,也提示免疫制剂是否能与强杀菌剂联用值得探讨。

参考文献:

[1]. ELISA方法研究多糖与人干扰素-γ相互作用[J]. 冯伟云, 赵鲁杭, 王克夷. 浙江大学学报(医学版). 2004

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[3]. 基因工程药物人干扰素-γ体外重折叠复性研究[D]. 靳挺. 浙江大学. 2004

[4]. 四氢嘧啶类化合物ZL-5015的免疫抑制作用及其作用机制研究[D]. 伦玉宁. 南方医科大学. 2013

[5]. 益生菌对急性肝衰竭小鼠Notch信号通路的调控作用[D]. 曹伟. 河北医科大学. 2014

[6]. HMGB1表达水平与COPD大鼠肺动脉平滑肌细胞合成分泌的关系[D]. 廖运学. 桂林医学院. 2014

[7]. 兔疥螨虫株的分子分类及其疫苗研究[D]. 古小彬. 四川农业大学. 2009

[8]. 慢性阻塞性肺疾病合并肺结核患者体液和细胞免疫功能的研究[D]. 唐神结. 苏州大学. 2014

[9]. 姜黄素介导THP-1来源巨噬细胞极化及其机制的研究[D]. 周瑶瑶. 上海交通大学. 2015

[10]. 免疫制剂在耐多药结核病治疗中作用的研究[D]. 侯江厚. 北京市结核病胸部肿瘤研究所. 2012

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ELISA方法研究多糖与人干扰素-γ相互作用
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