新型提高重组CHO细胞转基因表达MARs的筛选与功能分析

论文摘要

背景利用基因工程技术生产的治疗性重组蛋白已经成为生物医药产业重要组成部分。哺乳动物表达系统是生产治疗性重组蛋白的主要平台,在哺乳动物表达系统中应用最为广泛的是中国仓鼠卵巢细胞（Chinese hamster ovary,CHO）表达系统。但是CHO细胞表达系统存在转基因沉默或表达水平不稳定等问题。研究发现核基质附着区（matrix attachment regions,MAR）作为一种表观遗传调控元件,不仅能够克服转基因沉默而且能提高转基因表达水平。但目前报道的用于提高转基因表达的MAR序列有限,并且其调控转基因表达的作用机制和分子特征尚不清楚。目的筛选出能有效提高转基因表达的新型MAR序列,用于CHO细胞中提高转基因表达水平并分析其作用机制及分子特征。方法1.载体构建和细胞转染:人工合成human CSP-B MAR（本文称为hu-MAR）、MAR-6（本文称为MAR1）和DHFR intron MAR（本文称为MAR2）序列,将不同MAR序列分别克隆至含绿色荧光蛋白（enhanced green fluorescence protein,eGFP）表达载体的poly A下游。将构建好的载体转染宿主细胞CHO-S细胞。2.瞬时表达分析:转染48 h后荧光显微镜观察eGFP报告基因的瞬时表达情况,分析不同载体的转染效率。3.稳定表达分析:转染48 h后加入遗传霉素（Geneticin,G418）进行加压筛选,获得多克隆稳定细胞池（cell pool）,当细胞加压筛选至20代,流式细胞术分析报告基因eGFP的表达水平。4.目的基因拷贝数分析:实时荧光定量PCR（qPCR）法检测目的基因eGFP的拷贝数。5.长期表达稳定性分析:G418加压筛选至细胞培养40代,流式细胞术分析报告基因eGFP的表达水平。6.贝伐单抗表达:贝伐单抗重链和轻链基因替换上述载体的报告基因eGFP,贝伐单抗表达载体转染CHO-S细胞,转染48 h后加入G418进行加压筛选,获得多克隆稳定细胞池,蛋白质印迹法（Western Blot）检测贝伐单抗在CHO-S细胞中的表达水平。结果1.在表达载体polyA下游成功构建含三种不同MAR序列的真核表达载体,并用于表达报告基因eGFP和重组蛋白贝伐单抗。2.瞬时表达结果表明hu-MAR、MAR2、MAR1能够提高载体转染效率以及eGFP瞬时表达水平,转染效率分别为96%、89%、83%及提高瞬时表达水平2.3倍、2.0倍和1.5倍。3.稳定表达结果表明hu-MAR、MAR2、MAR1均能提高eGFP稳定表达水平,分别提高4.5倍、2.7倍、2.5倍。4.基因拷贝数分析表明MAR序列提高转基因表达水平与基因拷贝之间没有显著相关性。hu-MAR、MAR2、MAR1提高eGFP基因拷贝数分别为2.80±0.43、6.40±0.89、6.90±1.21。5.长期表达稳定性分析结果表明hu-MAR、MAR2、MAR1均能维持eGFP稳定表达水平,其维持率分别为70%、65%、43%。6.贝伐单抗表达结果表明hu-MAR、MAR2、MAR1分别提高贝伐单抗的表达水平1.46倍、1.09倍、1.15倍。结论1.hu-MAR、MAR2、MAR1均能提高转基因表达水平与稳定性,其中筛选出的hu-MAR提高转基因表达作用最为显著。2.NFAT和VTBP两种转录因子结合位点有助于提高转基因表达。

论文目录

文章来源

类型: 硕士论文

作者: 田政伟

导师: 王天云

关键词: 核基质附着区,转基因表达,中国仓鼠卵巢细胞,重组蛋白

来源: 新乡医学院

年度: 2019

分类: 基础科学

专业: 生物学,生物学

单位: 新乡医学院

分类号: Q78

DOI: 10.27434/d.cnki.gxxyc.2019.000101

总页数: 68

文件大小: 3105K

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