L-天冬氨酸α-脱羧酶热稳定性改造及全细胞催化制备β-丙氨酸

论文摘要

L-天冬氨酸α-脱羧酶（L-aspartateα-decarboxylase,EC4.1.1.11,ADC）催化L-天冬氨酸脱去α羧基生成β-丙氨酸。β-丙氨酸在食品、医药、化工等领域具有广泛应用,合成方法主要有化学合成法和生物合成法。相较于化学合成法,生物合成法具有副产物少,操作简便,绿色环保等优点。但是用于催化生成β-丙氨酸的ADC酶活普遍偏低,限制了β-丙氨酸的生物法大规模制备。基于此,本研究对赤拟谷盗来源ADC进行分子改造,提升其催化性能,并利用全细胞催化法制备β-丙氨酸。主要研究结果如下:（1）依据嗜热蛋白的氨基酸内在进化趋势,将位于酶分子表面的Lys和Gly分别突变为Arg和Ala,成功提高了该酶的稳定性。共构建22个突变体。初筛结果显示,大多数突变体酶活及稳定性较野生型相差不大,其中,K49R、K221R、G369A突变体显示出较好的催化性能。酶学性质测定结果表明,K221R突变体比酶活较野生酶提高20.3%;在50℃处理30 min,K49R、K221R和G369A的残余酶活较野生酶提高0.7倍、1.2倍和1.0倍。分子动力学模拟结果显示,突变体K221R、G369A的柔性区域较野生型减少,并且与周围氨基酸产生相互作用力,推测是其热稳定性增强的原因。（2）构建基因工程菌,建立全细胞催化生产β-丙氨酸工艺。研究比较了一次性加入高浓度底物、多次添加底物分批补料催化工艺,野生型菌株最佳补料次数是3次,转化生成β-丙氨酸1079.9 mmol·L-1,摩尔转化率为90.0%;K221R菌株和G369A菌株最佳补料次数为4次,转化生成β-丙氨酸分别为1512.2 mmol·L-1和1509.6 mmol·L-1,摩尔转化率分别达到94.5%和94.4%。（3）对K221R菌株进行5 L发酵罐高密度发酵实验。通过对诱导剂种类和浓度进行优化,确定最佳诱导剂浓度为终浓度0.8 mmol·L-1 IPTG。发酵53 h左右菌体量达到OD600=130,最高酶活为851.6 U·mL-1。采用高密度发酵菌株进行全细胞催化,生成β-丙氨酸1820.0 mmol·L-1,摩尔转化率达到91.0%。

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第一章绪论

1.1 L-天冬氨酸α-脱羧酶概述

1.1.1 L-天冬氨酸α-脱羧酶来源及研究进展

1.1.2 L-天冬氨酸α-脱羧酶结构及催化机理

1.2 β-丙氨酸概述

1.2.1 β-丙氨酸的理化性质

1.2.2 β-丙氨酸的应用

1.2.3 β-丙氨酸的合成

1.3 蛋白质热稳定性

1.3.1 影响蛋白质热稳定性因素

1.3.2 酶分子的改造策略

1.3.3 提高酶热稳定性的方法

1.4 全细胞催化技术

1.5 分子动力学模拟概述

1.6 高密度发酵概述

1.7 本课题立题意义及主要研究内容

1.7.1 本课题立题意义

1.7.2 本课题主要研究内容

第二章材料与方法

2.1 材料

2.1.1 菌株及质粒

2.1.2 试剂

2.1.3 主要仪器设备

2.1.4 培养基

2.1.5 主要溶液

2.2 L-天冬氨酸α-脱羧酶突变库构建

2.2.1 质粒提取

2.2.2 引物设计

2.2.3 全质粒PCR

2.2.4 PCR产物纯化

2.2.5 E.coli感受态制备

2.2.6 E.coli感受态化学转化法

2.2.7 DNA测序鉴定阳性克隆

2.3 L-天冬氨酸α-脱羧酶表达及纯化

2.3.1 L-天冬氨酸α-脱羧酶诱导表达

2.3.2 L-天冬氨酸α-脱羧酶纯化

2.4 L-天冬氨酸α-脱羧酶酶学性质检测

2.4.1 L-天冬氨酸和β-丙氨酸检测方法

2.4.2 L-天冬氨酸α-脱羧酶酶活的测定方法

2.4.3 突变体酶活和热稳定性初步筛选方法

2.4.4 最适反应温度测定方法

2.4.5 最适反应pH测定方法

2.4.6 热稳定性检测方法

2.4.7 pH稳定性检测方法

2.4.8 L-天冬氨酸α-脱羧酶动力学参数测定

2.5 分子动力学模拟

2.5.1 同源建模的方法

2.5.2 分子动力学模拟方法

2.6 全细胞催化生产β-丙氨酸工艺建立与优化

2.6.1 一次性加入高浓度底物催化方法

2.6.2 PLP对全细胞催化反应的影响

2.6.3 底物分批补料合成β-丙氨酸方法

2.7 重组大肠杆菌5 L发酵罐培养

2.7.1 重组大肠杆菌细胞酶活测定方法

2.7.2 种子培养

2.7.3 5L发酵罐的分批-补料培养方法

2.7.4 指数流加的补料策略

2.7.5 诱导剂种类对细胞生物量和酶活的影响

2.7.6 诱导剂浓度对细胞生物量和酶活的影响

2.8 高密度发酵菌株全细胞催化生产β-丙氨酸

第三章结果与讨论

3.1 L-天冬氨酸α-脱羧酶酶活及热稳定性改造

3.1.1 TcADC分子表面Gly和 Lys预测

3.1.2 突变体的初步筛选

3.1.3 突变酶的纯化

3.1.4 突变酶酶学性质表征

3.1.5 野生酶及突变酶动力学常数测定

3.1.6 组合突变体构建及筛选

3.1.7 分子动力学模拟

3.2 全细胞催化生产β-丙氨酸工艺的建立与优化

3.2.1 L-天冬氨酸α-脱羧酶培养条件优化

3.2.2 一次性加入高浓度底物催化工艺

3.2.3 底物分批补料合成β-丙氨酸工艺

3.2.4 K221R、G369A菌株全细胞催化生产β-丙氨酸

3.3 重组大肠杆菌5 L发酵罐优化

3.3.1 指数流加补料策略

3.3.2 诱导剂种类和浓度对细胞生物量和酶活的影响

3.3.3 高密度发酵菌株全细胞催化生产β-丙氨酸

主要结论与展望

主要结论

展望

致谢

参考文献

附录作者在攻读硕士学位期间发表的专利及论文

文章来源

类型: 硕士论文

作者: 王超

导师: 周哲敏

关键词: 天冬氨酸脱羧酶,热稳定性,全细胞催化,丙氨酸,高密度发酵

来源: 江南大学

年度: 2019

分类: 基础科学,工程科技Ⅰ辑

专业: 生物学,一般化学工业

单位: 江南大学

分类号: TQ922.2

总页数: 52

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