猪非典型瘟病毒SC株全基因测序、病理损伤的研究及其转录差异分析

论文摘要

猪非典型瘟病毒（atypical porcine pestivirus,APPV）是黄病毒科、瘟病毒属成员,是造成AⅡ型先天性震颤的主要病原之一,其能引发感染仔猪全身肌肉震颤或者后肢无法站立的情况,造成初生仔猪因为无法吮乳而死亡,给养猪业造成了巨大的损失。由于该病属于新发疾病,目前还没有针对该病的特异性疫苗面世,而对病原致病机制的掌握,是能够科学制定防控措施的关键,使切断其传播途径及控制感染源成为可能。本研究获得了流行毒株CHN-SC的全基因序列,并通过分子生物学软件分析其与其他参考毒株在核苷酸水平上的差异;通过建立荧光定量RT-PCR方法及制作病理组织切片,对感染仔猪进行病理损伤机制的研究;并通过对感染仔猪和对照组进行转录水平的差异研究,探索APPV的致病机制。1.APPV CHN-SC株的全基因测序与分析采取四川遂宁某规模化养殖场内APPV疑似感染仔猪的各组织及血清,处理后进行RT-PCR检测,证实为阳性感染后,设计、合成12对引物,通过克隆、测序、拼接等步骤,获得四川地区APPV流行毒株CHN-SC的全基因序列全长11303bp;并进一步通过Editseq和Megalign软件分析CHN-SC病毒株与APPV参考毒株之间的同源性。结果显示与参考株对比,同源性在81.7%90.6%之间,其中,与来源于德国的APPV-GER01毒株同源性最高,为90.6%,与中国广东的两株APPV毒株同源性最低,均为81.7%。2.APPV感染仔猪的病理损伤的研究本实验首先针对APPV NS2基因建立了荧光定量RT-PCR检测方法,并利用此方法测得APPV在患病仔猪的中枢神经系统及外周淋巴器官中载量最高。并且,在排除了其余CT相关病原干扰后,对各组织器官进行病理学观察,结果显示,主要的和最严重的病变均集中在中枢神经系统。相对于对照组,实验组可观察到明显的神经元收缩,核深染,脑膜水肿,核颗粒层坏死且伴有核碎片,细胞染色质溶解,神经细胞坏死等严重的病理变化,提示APPV可能主要在淋巴器官中进行复制,主要感染中枢神经系统。3.APPV自然感染仔猪小脑组织的转录差异差异分析将上述排除其余CT病原干扰的感染仔猪,采取其小脑组织,采用Illumina Hiseq4000平台进行转录组测序,设健康仔猪小脑组织为对照组,构建两个cDNA文库:APPV感染小脑组织文库、健康小脑组织文库.本次测序一共筛选到381个差异表达的基因,其中显著上调的有163个,显著下调的有218个,筛选标准为P<=0.05,|log2（FC）|>=0.263。对差异基因通过GO富集分析,具有明显比例差异的二级功能类包括β-淀粉样蛋白清除的负调节（negative regulation of amyloid-beta clearance）、信号调节（regulation of signaling）、活化素受体信号通路（activin receptor signaling pathway）、激素分泌（hormone secretion）、细胞通讯调节（regulation of cell communication）、信号转导调控（regulation of signal transduction）、内涵体（endosome）、细胞内部（intracellular）、空泡（vacuole）、髓鞘（myelin）等。利用KEGG对差异基因进行注释,结果显示在小脑组织中差异表达的基因主要富集于甘油酯代谢（Glycerolipid metabolism）、神经营养因子信号通路（Neurotrophin signaling pathway）、长期抑郁症（Long-term depression）、突触囊泡循环（Synaptic Vesicle Cycle）、轴突指导（Axon guidance）、黏附斑信号通路（Focal adhesion）、癌细胞相关信号通路（Pathways in cancer）、Hippo信号通路（Hippo signaling pathway）、肾素分泌（Renin secretion）、癌症中的蛋白多糖（Proteoglycans in cancer）等。

论文目录

摘要

Abstract

主要缩略词

第一章文献综述

1 仔猪先天性震颤

1.1 仔猪先天性震颤的概况

1.1.1 流行特点

1.1.2 CT的分型

1.1.3 A-Ⅱ型CT相关的病毒及其报道

2 猪非典型瘟病毒概述

2.1 病原学

2.1.1 分类

2.1.2 基因组结构

2.1.3 抗原性

2.1.4 培养特性

2.2 流行病学

2.2.1 传染源

2.2.2 传播途径

2.2.3 易感动物

2.2.4 发生与分布

2.2.5 APPV流行现状

2.3 临床症状与病理变化

2.4 检疫与诊断

2.4.1 检疫

2.4.2 诊断

2.4.2.1 临床诊断

2.4.2.2 鉴别诊断

2.4.2.3 实验室诊断

3 RNA-Seq技术在动物病毒研究中的应用

3.1 流感病毒（Ⅳ）

3.2 猪繁殖与呼吸综合征病毒（PRRSV）

3.3 牛病毒性腹泻病毒（Bovine Viral Diarrhea Virus,BVDV）

4.研究目的与意义

第二章 APPV CHN-SC株的全基因测序与分析

1 试验材料

1.1 病料、菌株

1.2 主要试剂与设备

1.3 分子生物学分析软件

1.4 主要配置试剂

2 试验方法

2.1 APPV疑似病料的检测

2.1.1 检测引物的设计

2.1.2 病料的处理

2.1.3 RNA的提取及cDNA的合成

2.1.4 RT-PCR检测

2.2 APPV全基因扩增

2.2.1 引物设计

2.2.2 APPV基因组cDNA合成

2.2.2.1 RNA的提取

2.2.2.2 5 '-UTR与3'-UTR的 cDNA合成

2.2.2.3 ORF1的cDNA合成

2.2.3 APPV基因组的扩增

2.2.3.1 5 '-UTR与3'-UTR的 cDNA扩增

2.2.3.2 ORF的 cDNA的扩增

2.2.4 目的片段的回收

2.2.5 重组质粒的构建

2.2.5.1 目的基因与质粒的连接

2.2.5.2 感受态细胞的制备

2.2.5.3 转化

2.2.6 全基因组序列拼接与分析

3 结果

3.1 APPV检测结果

3.2 全基因的分段扩增与克隆

3.3 全基因组的序列拼接

3.4 全基因序列特征及与遗传进化树分析

3.4.1 全基因序列特征

3.4.2 全基因遗传进化树分析

4 讨论

第三章 APPV对感染仔猪的病理损伤的研究

1 实验材料

1.1 病毒病料

1.2 主要试剂与耗材

1.3 主要实验仪器

2 方法

2.1 猪非典型瘟病毒NS2 基因荧光定量PCR方法的建立

2.1.1 标准曲线的构建

2.1.2 敏感性试验

2.1.3 特异性试验

2.1.4 重复性试验

2.1.5 临床样品的检测

2.2 感染仔猪各组织器官APPV病毒载量的测定

2.2.1 样品处理

2.2.2 RNA抽提及反转录

2.2.3 APPV在感染仔猪体内各组织器官病毒载量的测定

2.3 患病仔猪病理学观察

2.3.1 排除其余病原干扰

2.3.1.1 RNA抽提

2.3.1.2 DNA抽提

2.3.1.3 细菌的分离培养

2.3.2 包埋制片染色

3 结果

3.1 猪非典型瘟病毒NS2 基因荧光定量RT-PCR方法的建立

3.1.1 标准曲线的构建

3.1.2 敏感性试验

3.1.3 特异性试验

3.1.4 重复性试验

3.1.5 APPV荧光定量RT-PCR方法对临床样品的检测

3.2 感染仔猪各组织器官APPV病毒载量测定结果及统计

3.3 病理学观察结果

3.3.1 排除干扰病原

3.3.2 病理学观察

4 讨论

第四章 APPV自然感染仔猪小脑组织的转录差异分析

1 材料与方法

1.1 病料组织

1.2 试验试剂及测序平台

1.3 测序样品的准备

1.4 样品RNA的抽提与反转录

1.5 文库构建

1.6 测序

1.7 差异表达基因的筛选及功能注释

1.8 qRT-PCR验证RNA-Seq测序结果

2 结果

2.1 测序质控

2.2 构建样品文库

2.3 差异表达基因及富集分析

2.3.1 差异表达转录本筛选

2.3.2 差异表达转录本的分析

2.4 荧光定量PCR验证RNA-Seq测序结果

3 讨论

全文总结

参考文献

致谢

附录

作者简历

文章来源

类型: 硕士论文

作者: 李雨濛

导师: 朱玲

关键词: 猪非典型瘟病毒,初生仔猪,病理损伤

来源: 四川农业大学

年度: 2019

分类: 基础科学,农业科技

专业: 生物学,畜牧与动物医学

单位: 四川农业大学

分类号: S852.651

DOI: 10.27345/d.cnki.gsnyu.2019.000681

总页数: 80

文件大小: 2352k

下载量: 14

猪非典型瘟病毒SC株全基因测序、病理损伤的研究及其转录差异分析

论文摘要

论文目录

文章来源

相关论文文献

猜你喜欢