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睾丸酮丛毛单胞菌中MBD的生物学作用及调控研究

2020-12-09阅读(179)

睾丸酮丛毛单胞菌中MBD的生物学作用及调控研究

论文摘要

内消旋-丁二醇脱氢酶（Meso-butanediol dehydrogenase,MBD）是睾丸酮丛毛单胞菌（Comamonas testosteroni,C.T.）ATCC11996中的一种酶。因其能够催化反应产生大量的乙偶姻（Acetoin,AC）和内消旋-2,3-丁二醇（Meso-2,3-butanediol,meso-2,3-BD）生物产物,成为专家学者关注的热点。本文以MBD为研究对象,探索该酶在睾丸酮丛毛单胞菌中对甾体类激素代谢的影响及基因调控情况。通过激素诱导、总RNA提取、全转录组测序、测序信息比对、基因扩增、构建基因表达载体、外源蛋白表达、蛋白质亲和层析纯化、基因敲除、质粒共转化、高效液相、ELISA等实验方法,结果表明:经睾丸酮诱导后的C.T.菌中共有4835个基因在转录水平发生了差异,有110个显著差异基因,其中MBD基因差异Log2值达到1.80,与未诱导前差异达3.48倍。通过构建MBD敲除型C.T.株,并使用高效液相色谱法检测其对于睾丸酮、甲睾酮、雌酮、雌二醇等甾体类激素的降解能力,研究表明将C.T.菌中的内消旋-丁二醇脱氢酶基因敲除后对睾丸酮的降解率为27.80%,比野生型下降了47.40%;敲除株对甲睾酮的降解率为24.10%,比野生型下降了18.20%;敲除株对雌酮的降解率为14.80%,比野生型下降了16.20%;敲除株对雌二醇的降解率为19.30%,比野生型下降了5.60%。MBD共转化ELISA实验发现,LuxR和MBD质粒共转化株中MBD表达量降低,LysR和MBD质粒共转化株中MBD表达量提高,TetR和MBD质粒共转化株中MBD表达量差别不明显。本文实验结果说明MBD在睾丸酮丛毛单胞菌代谢睾丸酮等甾体类激素有着重要生物作用,睾丸酮丛毛单胞菌中的两种转录调节因子LuxR、LysR对MBD有调控作用,其中LuxR对其有下调作用,LysR对其有上调作用。研究结果对于研究C.T.菌中甾体类激素代谢通路及基因调控提供重要的理论和实验基础。

论文目录

  • 摘要
  • ABSTRACT
  • 第一章 绪论
  •   1.1 引言
  •   1.2 睾丸酮丛毛单胞菌与甾体类激素污染
  •   1.3 全转录组测序
  •   1.4 研究目的及意义
  •   1.5 主要研究内容
  • 第二章 睾丸酮诱导下C.T.菌全转录组测序
  •   2.1 实验材料
  •     2.1.1 菌株
  •     2.1.2 主要试剂及试剂盒
  •     2.1.3 主要仪器
  •     2.1.4 溶液配制
  •   2.2 实验方法
  •     2.2.1 C.T.菌生长曲线测定
  •     2.2.2 C.T.菌总RNA提取
  •     2.2.3 全转录组测序
  •     2.2.4 转录组数据分析
  •   2.3 实验结果
  •     2.3.1 C.T.菌生长曲线
  •     2.3.2 C.T.菌总RNA提取
  •     2.3.3 全转录组测序数据分析
  •   2.4 小结
  • 第三章 MBD敲除株构建及其对甾体类激素代谢研究
  •   3.1 实验材料
  •     3.1.1 实验细胞及质粒
  •     3.1.2 主要药品及试剂盒
  •     3.1.3 主要仪器
  •     3.1.4 溶液的配置
  •   3.2 实验方法
  •     3.2.1 敲除片段设计
  •     3.2.2 敲除质粒构建
  •     3.2.3 感受态制备及电转化
  •     3.2.4 敲除株筛选及鉴定
  •     3.2.5 激素诱导培养
  •     3.2.6 高效液相色谱法（HPLC）测定激素残留
  •   3.3 实验结果
  •     3.3.1 敲除片段引物
  •     3.3.2 敲除片段PCR
  •     3.3.3 敲除质粒构建
  •     3.3.4 MBD敲除株鉴定
  •     3.3.5 HPLC结果
  •   3.4 小结
  • 第四章 C.T.菌中LuxR、Lys R、Tet R蛋白对MBD的代谢调控研究
  •   4.1 实验材料
  •     4.1.1 实验菌种及质粒
  •     4.1.2 实验试剂
  •     4.1.3 实验仪器
  •     4.1.4 溶液配置
  •   4.2 实验内容
  •     4.2.1 MBD表达株构建
  •     4.2.2 MBD蛋白表达纯化
  •     4.2.3 MBD酶活测定
  •     4.2.4 MBD多克隆抗体制备
  •     4.2.5 MBD ELISA标准曲线制备
  •     4.2.6 各甾体类激素诱导下 C.T.菌 MBD 表达量差异 ELISA 实验
  •     4.2.7 MBD启动子预测
  •     4.2.8 MBD受调控质粒构建
  •     4.2.9 MBD 共转化实验
  •     4.2.10 共转化菌株MBD表达量检测
  •   4.3 实验结果
  •     4.3.1 MBD pET15b表达载体
  •     4.3.2 MBD蛋白表达纯化
  •     4.3.3 MBD酶活力测定
  •     4.3.4 MBD多克隆抗体效价测定
  •     4.3.5 MBD ELISA标准曲线
  •     4.3.6 各甾体类激素诱导下C.T.菌MBD表达量差异ELISA
  •     4.3.7 MBD启动子预测
  •     4.3.8 MBD调控质粒
  •     4.3.9 MBD共转化菌株筛选及鉴定
  •     4.3.10 ELISA测定共转化菌株MBD表达量
  •     4.3.11 MBD受调控机制预测
  •   4.4 小结
  • 第五章 结论
  •   5.1 论文结论
  •   5.2 展望
  • 参考文献
  • 致谢

    • 文章来源

    类型: 硕士论文

    作者: 张司晨

    导师: 于源华,宫平

    关键词: 蛋白,全转录组测序,基因敲除,基因调控

    来源: 长春理工大学

    年度: 2019

    分类: 基础科学,工程科技Ⅰ辑

    专业: 生物学,环境科学与资源利用

    单位: 长春理工大学

    分类号: X50;Q93

    总页数: 116

    文件大小: 4209K

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