氮限诱导下胶球藻油脂合成积累路径相关调控基因的筛选与鉴定

论文摘要

能源微藻胞内油脂合成积累路径的调控基因是通过基因工程策略提高其油脂产率并实现微藻生物柴油低成本产业化的关键之一。然而由于目前对微藻油脂合成积累路径关键调控基因的认知不足及精准研究相对匮乏,导致相关增强藻细胞脂质积累的基因工程策略也缺乏一定理论指导。本研究以新型能源极地胶球藻Coccomyxa subellipsoidea C-169为受试对象,基于转录组学和代谢组学关联对应分析技术,先解析胶球藻细胞脂质积累与氮限浓度-时间效应的定量关系,在此基础上筛选胶球藻细胞中调控油脂合成积累的相关基因,再以基因超量表达等方法确认基因表达模式与油脂积累正负相关性,为准确进行产油微藻基因工程改造奠定理论基础。取得的主要研究结果如下:1)在氮充足-氮限制两段法诱导模式下,胶球藻细胞经第一阶段的氮充足基础培养基（1.25 g/L NaNO3）培养168 h后获得的最大生物量和油脂含量分别为3.26 g/L和36%,将第一阶段3.26 g/L生物量的胶球藻细胞收集离心重悬于新鲜的第二阶段氮限制基础培养基中（0、0.25、0.5、0.75、1.0、1.25 g/L NaNO3）分别诱导培养2 h、4 h、6 h、12 h、24 h、36 h、72 h,其在0.5 g/L NaNO3诱导4 h获得最大的油脂含量为66%,对应生物量为4.78 g/L。2)以两段法培养第一阶段的胶球藻细胞（3.26 g/L和36%）为对照样本,第二阶段油脂最大积累的胶球藻细胞（4.78 g/L和66%）为实验组样本进行转录组分析筛选差异表达基因。结果显示:541个基因发生显著性变化,513个基因显著性上调,28个基因显著性下调,通过KEGG通路数据库分析得知其中124个差异表达基因集中在与油脂合成积累直接相关的糖酵解、戊糖磷酸途径、氧化磷酸化途径、甘油酯及脂肪酸合成等路径中。进一步地,将调控糖酵解路径中的磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶基因（gene4216）和丙酮酸脱氢酶基因（gene899）,甘油三酯合成中的长链酰基辅酶A合成酶基因（gene8195）、丙二酰辅酶A转移酶基因（gene1393）和3-酮乙基-酰基载体蛋白合成酶基因（gene9592）共5个代表性的关键基因进行qRT-PCR实时定量分析,发现其表达模式与在转录组中一致,证实转录组筛选的差异表达基因数据较为可靠。3)同理,以两段法培养模式第一阶段最大生物量的胶球藻细胞（3.26g/L和36%）为对照样本,以第二阶段油脂最大积累的胶球藻细胞（4.78 g/L和66%）为实验样本进行代谢组学分析筛选差异代谢物。结果显示:140个代谢物发生显著性变化,54个代谢物下调,86个代谢物上调,KEGG通路数据库分析其中24个差异代谢物包括脂肪酸、磷脂酸、磷脂酸酰基醇、磷脂酰甘油、甘油二酯、磷脂酰丝氨酸、磷脂酰乙醇胺、卵磷脂集中在谷胱甘肽代谢、磷酸肌醇代谢、脂肪酸合成等与油脂合成积累直接相关的路径中。4)转录组差异表达基因和代谢组差异表达代谢物关联对应分析共存在10个关联对应通路。结果显示:与油脂合成积累相关的糖酵解路径中的谷胱甘肽和6-磷酸葡萄糖表达上调,而调控该途径中的磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶ppc基因（gene 4216）和丙酮酸脱氢酶PDHA基因（gene899）也发生显著性上调,证实gene 4216和gene899是调控油脂富集的关键性基因;差异代谢物油酸含量大大增加,而其调控脂肪酸合成积累的相关差异表达基因如乙酰辅酶A羧化酶gene1159（accC）、gene2002（accA）、gene2481（accB）、丙二酰辅酶A转移酶基因gene1393（fabD）、3-草酰酰基载体蛋白合成酶基因gene9592（fabF）也上调,表明这些基因是调控脂肪酸合成积累的重要调控因子;代谢物磷脂酸（PA）和甘油二酯（DAG）富集增加与调控甘油三酯合成积累的脂肪酸硫酯酶基因gene823（FATA）和长链酰基辅酶a合成酶gene2932（ACSL）的表达模式相一致,表明gene823和gene2932可能是胶球藻油脂富集的关键基因。5)为进一步确认筛选的相关基因在调控油脂合成积累的作用,将丙酮酸脱氢酶基因（gene899）通过基因工程策略克隆并转导生物模式藻莱茵衣藻中进行超量表达,结果显示:转基因莱茵衣藻细胞生物量较非转基因藻株无显著性变化,而油脂含量为59.61%,较非转基因莱茵衣藻细胞油脂含量提高了1.84倍。此外,转基因藻株胞内脂肪酸成分以C16-C18脂肪酸为主,是制备高质量生物柴油的理想原料。

论文目录

文章来源

类型: 硕士论文

作者: 王振瑶

导师: 李玉芹

关键词: 胶球藻,氮充足氮限制两段法,油脂合成积累,调控基因,转基因莱茵衣藻

来源: 湘潭大学

年度: 2019

分类: 基础科学,工程科技Ⅰ辑

专业: 生物学,燃料化工,石油天然气工业

单位: 湘潭大学

分类号: TE667;Q78

DOI: 10.27426/d.cnki.gxtdu.2019.000183

总页数: 90

文件大小: 2676K

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