一、人突变p27重组腺病毒的构建及其在结肠癌细胞SW480中的表达（论文文献综述）
谭丽[1]（2021）在《Tenovin-6抑制结肠癌细胞增殖的作用及机制研究》文中提出结肠癌是常见的消化道恶性肿瘤之一,其发病率呈现出地域性差异,发病率高的区域主要集中在欧洲、北美等发达国家。结直肠癌发病率已经被认为是社会发展的一个标志,在2020全球统计的癌症数据中,有190多万的结直肠癌病例,其中结肠癌占比57.5%。目前,随着经济发展与人们饮食结构的改变,结肠癌也成为我国发病率上升快速的恶性肿瘤之一,且发病呈现年轻化。早期结肠癌患者症状不明显易被忽视,晚期确诊的患者死亡率高不易治疗。目前最为常见的治疗方式是手术切除根除、放疗和化疗辅助治疗及分子靶向治疗,其中靶向治疗逐渐成为后期治疗的重要方式,但是虽然有贝伐单抗,西妥昔单抗以及瑞格非尼等,但是治疗效果有限,亟需开发新的靶向治疗药物。能量代谢的改变以满足不受控制的增殖已成为肿瘤中最重要的标志之一。Sirtuin家族是Ⅲ型的组蛋白去乙酰化酶,参与肿瘤细胞增殖与代谢的调控,与结肠癌的发生和发展密切相关。组蛋白去乙酰化酶抑制剂有很好的抗癌前景,Tenovin-6是Sirtuin家族中SIRT1和SIRT2的抑制剂,能够抑制SIRT1和SIRT2的去乙酰化活性。到目前为止,多个研究证明了Tenovin-6在恶性黑色素瘤、犬血管肉瘤、弥漫性大B细胞淋巴瘤、急性淋巴细胞白血病、慢性淋巴白血病、胃癌等肿瘤的发生和发展中有显着的抑制作用。Tenovin-6在结肠癌中除能通过上调死亡受体5诱导外在的凋亡途径,其他的作用和机制还不清楚。因此本篇针对Tenovin-6在结肠癌的机制探索设计了一系列的实验,发现Tenovin-6能显着抑制结肠癌细胞的增殖和代谢,我们主要的研究结果如下:1.Tenovin-6影响结肠癌细胞细胞增殖能力为了探索Tenovin-6对结肠癌HCT116、SW480两种细胞系的影响作用,我们首先通过MTT、i CELLigence、Brd U等实验检测结肠癌细胞的增殖情况,结果显示Tenovin-6能够抑制结肠癌细胞增殖。然后我们进一步进行了软琼脂实验、平板克隆等实验验证了Tenovin-6抑制结肠癌细胞的增殖能力。这些结果证实了Tenovin-6能够抑制结肠癌细胞的增殖能力。2.Tenovin-6影响结肠癌细胞周期和凋亡进程由于Tenovin-6能够明显的抑制结肠癌细胞的增殖能力,我们通过流式细胞仪进行周期检测,发现Tenovin-6诱导结肠癌细胞HCT116阻滞在G2M期,SW480阻滞在S期。我们进一步通过Western blot实验发现HCT116细胞中周期相关蛋白Cyclin B1和CDK2下调,SW480细胞中Cyclin A2和CDK2显着下降。除此之外,在Tenovin-6对结肠癌HCT116、SW480两种细胞系进行药物处理后,发现细胞死亡现象,通过流式细胞仪检测发现Tenovin-6能诱导结肠癌细胞凋亡。此外,我们通过Western blot实验检测了细胞凋亡核心成员半胱天冬酶的切割底物PARP以及剪切体Cleaved-PARP、线粒体BCL-2家族中的促凋亡蛋白BAX,发现PARP下调,Cleaved-PARP和BAX上调。这些实验结果说明Tenovin-6能够显着诱导结肠癌细胞凋亡。以上实验结果表明,Tenovin-6能够抑制结肠癌细胞增殖并且诱导细胞周期阻滞和细胞凋亡。3.Tenovin-6影响结肠癌细胞内能量代谢水平Tenovin-6是SIRT1和SIRT2的抑制剂,且SIRT1和SIRT2参与肿瘤细胞代谢的调控。通过流式细胞仪检测,结肠癌HCT116、SW480两种细胞系在Tenovin-6处理后对于葡萄糖的吸收能力和ATP水平都显着降低。通过q RT-PCR、Western blot实验发现结肠癌细胞经Tenovin-6处理后,线粒体生物功能转录共激活因子PGC-1α和葡萄糖转运蛋白GLUT4呈现下调趋势。以上实验结果表明Tenovin-6能够抑制结肠癌细胞内能量代谢水平。4.Tenovin-6通过影响PGC-1α/GLUT4通路从而抑制细胞代谢和增殖由于Tenovin-6处理后PGC-1α和GLUT4呈现下调趋势,我们在此基础上过表达PGC-1α并使用Tenovin-6处理结肠癌细胞,通过MTT、平板克隆、葡萄糖吸收、ATP检测等实验发现结肠癌的增殖能力和代谢水平得到一定程度的恢复。q RTPCR、Western blot实验也证实了GLUT4的m RNA水平和蛋白水平得到一定程度的恢复。体内实验结果也显示PGC-1α特异性激活剂ZLN005处理后能够显着恢复Tenovin-6引起的结肠癌肿瘤细胞的成瘤性。研究表明Tenovin-6通过影响PGC-1α/GLUT4通路从而抑制细胞代谢和增殖。综上所述,本文旨在从细胞增殖和代谢的角度出发,发现Tenovin-6能够通过影响PGC-1α/GLUT4通路从而抑制结肠癌细胞代谢水平和增殖,从而为治疗结肠癌提供新的思路和途径。
韩玮[2]（2021）在《苦豆碱通过调节miR-296-5p/STAT3轴抑制结直肠癌细胞的增殖和转移及其机制研究》文中认为目的:观察苦豆碱（ALO）对结直肠癌（CRC）细胞生物学行为的影响,研究苦豆碱在CRC中对miR-296-5p和转导和转录激活因子3（STAT3）的表达影响,从而进一步探讨苦豆碱抗CRC的作用及其潜在机制。方法:1.用不同浓度的ALO处理细胞,MTT法检测CRC细胞增殖。2.qRT-PCR检测不同浓度的ALO处理CRC细胞中miR-296-5p的表达。3.利用生物信息网站TargetScan V7.2对基于miRNA序列的靶基因进行预测,并采用双荧光素酶报告分析（dual-luciferase reporter assay）对预测结果进行验证。4.在室温下转染或共转染miR-296-5p mimics、过表达 STAT3 质粒、miR-296-5p inhibitor、siSTAT3,并且予以 ALO 处理。采用 qRT-PCR 检测处理后CRC细胞miR-296-5p的表达情况,Western blot检测STAT3的表达情况。5.采用细胞克隆形成实验检测ALO处理后转染的HCT116和SW480细胞增殖影响情况,使用流式细胞仪检测细胞凋亡影响情况,最后采用western-blot检测细胞凋亡蛋白相关影响情况。6.采用划痕愈合实验检测ALO对采用不同转染方案的HCT116和SW480细胞迁移影响,使用Transwell侵袭试验细胞侵袭影响。7.采用western-blot检测处理后EMT相关蛋白N-cadherin和E-cadherin的表达影响况。结果:1.采用MTT法检测,结果表明ALO对不同CRC细胞增殖具有不同程度抑制作用,并且具有剂量依耐性。其中针对不同的CRC细胞抑制作用不同,以对SW480细胞增殖的抑制作用最强,但对HCT116细胞增殖的抑制作用最弱,并且SW480细胞的IC50为 0.611mmol/L,而 HCT116 细胞的 IC50 为 1.141mmol/L。2.通过 StarBasev3.0 分析比较了结直肠腺癌和正常样本miR-296-5p,明确了 miR-296-5p再结直肠腺癌中低表达,再通过 qRT-PCR 验证了 CRC 细胞系（SW480、HCT116、HT29、SW620）内 miR-296-5p 的表达低于人肠上皮细胞HIEC,并且miR-296-5p在SW480细胞表达最高,HCT116表达最低。选择SW480细胞和HCT116细胞做为代表,经过ALO处理24h后,检测两者miR-296-5p表达,结果表明ALO能够上调SW480细胞和HCT116细胞miR-296-5p的表达,并且呈现剂量依赖性。3.采用TargetScan V7.2对miR-296-5p进行靶基因预后,结果提示STAT3是靶基因,并且目标位点位于3’-UTR。构建野生型（STAT3-WT）和突变型（STAT3-MUT）基因靶点STAT3的3’UTR-荧光素酶表达载体。对miR-296-5p表达最低的HCT116细胞行miR-296-5p mimic共转染,对miR-296-5p表达最高的SW480细胞进行miR-296-5p inhibitor共转染。双荧光素酶报告基因系统分析后,结果提示与STAT3-MUT共转染的细胞相比,miR-296-5p mimic和STAT3-WT共转染的HCT116细胞的荧光素酶活性明显抑制,而与miR-296-5p inhibitor和STAT3-WT共转染的SW480细胞的荧光素酶活性增强,从而证明STAT3是miR-296-5p靶基因。4.miR-296-5p mimics和ALO都抑制了 CRC细胞中STAT3的表达,但miR-296-5p inhibitor增强了 STAT3的表达。从而得出结论:上调MIR-296-5p和ALO处理均抑制STAT3的表达。5.上调miR-296-5p和ALO抑制了 CRC细胞的增殖以及Bcl-2的表达,但促进凋亡以及Bax表达,并且这些作用都通过过表达的STAT3逆转。实验结果表明ALO通过调节miR-296-5p/STAT3通路调控CRC细胞增殖和凋亡。6.上调miR-296-5p和ALO抑制了 CRC细胞的迁移、侵袭,并且通过过表达的STAT3逆转。实验结果表明ALO通过调节miR-296-5p/STAT3通路调控CRC细胞迁移和侵袭。7.上调miR-296-5p和ALO抑制CRC细胞的N-cadherin的表达,但促进E-cadherin的表达,这些作用可以被过表达的STAT3逆转,结果表明:ALO通过调节miR-296-5p/STAT3通路调控EMT相关蛋白的表达。结论:ALO以剂量依赖性的方式抑制CRC细胞增殖。miR-296-5p在CRC组织和细胞中低表达,ALO促进miR-296-5p的表达。STAT3是mi R-296-5p的靶基因,上调miR-296-5p和ALO均抑制STAT3的表达。ALO可以通过调节miR-296-5p/STAT3通路调控CRC的增殖、凋亡、迁移、侵袭和EMT。
郑晓丽[3]（2018）在《Wnt6对结肠癌发生和发展的影响》文中指出结肠癌是常见的消化道癌症之一,全球第三大癌症,全球死亡率第四。在我国结肠癌的发病率位居第四位,死亡率位居第五位,仅次于肺癌和胃癌。结肠癌5年生存率较低,治疗和预后效果较差,已经严重的影响了人类的健康。Wnt通路在生物的生长、发育和分化等多个方面发挥着重要的作用,己有的研究结果表明Wnt通路的异常表达与多种癌症密切相关,包括结肠癌。结肠癌的发生和发展与遗传因素和环境因素密切相关。现阶段在结肠癌中己经发现了 APC、β-catenin、KRAS、P53等基因突变,以及多种Wnt蛋白的异常表达。据报道Wnt6基因的多态性与结肠癌密切相关,但Wnt6对结肠癌的作用还鲜有报道。本实验拟通过研究比较正常人群结肠组织、结肠癌患者结肠癌组织和癌旁组织中Wnt6mRNA和蛋白的表达量以及Wnt6对结肠癌细胞系的影响,来初步探讨Wnt6对结肠癌发生和发展的作用,并为进一步的研究Wnt6对结肠癌发生和发展的分子机制奠定基础。第一部分结肠癌组织Wnt6的表达量目的:检测来源于正常人群的结肠组织、结肠癌患者结肠癌组织和癌旁组织中Wnt6的表达量,初步判断Wnt6与结肠癌之间的关系。方法:结肠癌组织来源于我院2015年7月至2016年7月原发性结肠癌术后病例45例,在手术时随机收取对应癌旁组织20例。收取20例经胃肠镜及其他影像学、实验实检查确诊为正常人群的少量结肠组织。45例患者中男性23例,女性22例（年龄39～68岁,平均年龄54.44 ±7.03岁）。20例正常人群中男性11例,女性9例（年龄41～62岁,平均年龄52.15 ±5.91岁）。使用t检验和卡方检验对对照组和实验组性别和年龄差异进行分析。本实验共分为3组:结肠癌组织组、癌旁组织组和正常结肠组织组。采用荧光定量PCR检测各组所有样品Wnt6的mRNA表达量。再从三组中各随机抽取8个样品,采用Western blotting检测Wnt6的蛋白表达量。结果:患者和正常人群年龄（t=1.272,p=0.208）和性别（F=0.084,p=0.772）之间的差异无统计学意义。结肠癌组织中Wnt6 mRNA的表达量显着高于正常结肠组织和癌旁组织（P<0.01）。癌旁组织中Wnt6的表达量与正常结肠组织之间的差异无统计学意义。从Western blotting的结果,可以发现随机挑选的8个样品,结肠癌组织中Wnt6蛋白的表达量高于癌旁组织和正常结肠组织。结论:高表达的Wnt6与结肠癌相关,Wnt6可能在结肠癌的发生和发展中发挥着重要的作用。第二部分shRNA干扰和过表达Wnt6载体的构建和结肠癌细胞系的选择目的:构建shRNA干扰Wnt6载体和过表达Wnt6载体,从5种结肠癌细胞系中筛选出高表达Wnt6的细胞系,用于shRNA干扰载体和过表达载体的转染,获得稳转细胞系,用于下一步的研究。方法:通过荧光定量PCR检测5种结肠癌细胞系LoVo、SW480、HCT116、SW620和HT29中Wnt6的mRNA的表达水平,挑选出高表达Wnt6的细胞系。构建shRNA干扰载体和过表达载体,用Lip02000进行HCT116和SW480细胞的转染。转染后24小时荧光显微镜下观察各组（CON、shNC、shWnt6、EV和pWnt6）绿色荧光的表达情况,并采用荧光定量PCR检测转染后各组细胞Wnt6的mRNA表达水平。结果:从荧光定量PCR结果,发现5种结肠癌细胞系中,SW620、HCT116和SW480这3种细胞系Wnt6的表达量最高,均显着性高于LoVo细胞系（P＜0.01）。而LoVo和HT29细胞系中Wnt6表达量之间的差异无统计学意义。转染shRNA干扰载体和过表达载体后24小时,在荧光显微镜下各组都可以观察到绿色荧光蛋白的表达。转染shRNA干扰载体后,HCT116和SW480细胞系Wnt6的mRNA表达水平均显着下降（P＜0.01）,而转染过表达载体后HCT116和SW480细胞系Wnt6表达水平均显着升高。结论:HCT116和SW480细胞系Wnt6表达量最高,shRNA干扰载体能够有效的沉默Wnt6的表达,过表达载体能够有效地提高Wnt6的表达量。第三部分Wnt 6对HCT116和SW480两种结肠癌细胞生长的影响目的:研究Wnt6对2种结肠癌细胞系生长的影响。方法:对HCT116和SW480细胞进行shRNA干扰载体的转染,shRNA干扰载体和过表达Wnt6载体的共转染。用MTT法检测各组（CON、shNC、shWnt6、EV和shWnt6+pWnt6）细胞中Wnt6对结肠癌细胞增殖能力的影响。采用流式细胞仪检测各组细胞凋亡和细胞周期。采用transwell检测细胞的迁移能力以及采用Western blotting检测凋亡相关基因Bax、Caspase-3以及迁移相关基因MMP2的蛋白表达水平的变化。结果:与shNC组相比,shWnt6组结肠癌细胞增殖能力显着降低（P<0.01）,细胞凋亡数目显着增加,细胞周期停滞在GO-G1期的比例显着增加,细胞周期处于S期比例显着减少,且细胞迁移能力降低,促细胞凋亡基因Bax蛋白表达水平上升,凋亡相关蛋白Caspase-3表达水平下降,促进细胞迁移基因MMP2的蛋白表达水平下降。而共转染shWnt6干扰和过表达Wnt6载体后,与转染shWnt6相比结果相反且存在显着性差异。结论:Wnt6能够促进癌细胞的生长和迁移,该作用可能通过抑制细胞的凋亡、促进细胞的迁移实现。
王爱磊[4]（2018）在《芒柄花黄素对结肠癌影响及机制的实验研究》文中研究说明结直肠癌（colorectal cancer,CRC）是全球范围内最多见的消化系统疾病之一,其包括结肠癌和直肠癌,在临床上也统称为大肠癌,结肠癌细胞和直肠癌细胞有相似的生物学特性,结肠癌和直肠癌的临床治疗原则也基本相似。结直肠癌的发病率位于恶性肿瘤的第3位,列于肺癌和乳腺癌之后;死亡率位于全球恶性肿瘤的第4位。在中国,结直肠癌的发病率和死亡率均居前5位。2015年统计中国结直肠癌的发病率约为37.6/10万,死亡率约为19.1/10万。并且,随着年龄的增长,结直肠癌的患病危险性逐渐增加。近年来,随着生活方式、饮食习惯的改变和人口老龄化的到来,结直肠癌的患病率和死亡率呈逐渐升高的趋势。积极对结直肠癌开展有效治疗,可大大提高患者5年生存率,因此对结直肠癌的治疗方法的深入研究尤为重要。目前,结直肠癌的主要治疗方式是手术和化学治疗。结直肠癌根治术后,50%的患者会出现复发或转移而死亡,化疗药物可以提高结直肠癌的临床疗效。但是,化疗药物影响肿瘤细胞的同时也作用于人体的正常细胞。其破坏快速分裂的肿瘤细胞的同时也会破坏毛囊细胞、口腔和胃肠道黏膜细胞、红细胞和白细胞等。因此,化疗药物的非特异性作用可以引起诸多副作用。越来越多的研究表明,传统中药对肿瘤的治疗发挥积极意义,并且有良好的耐受性。所以,积极开发具有抑瘤作用且副作用小的中药制剂尤显重要。芒柄花黄素（Formononetin,Form）又名刺芒柄花素、芒柄花素,是一种生物活性异黄酮,可以抑制多种癌细胞增殖,诱导其凋亡,但对结直肠癌的研究报道不多且不深入。本研究选用结肠癌SW1116、HCT116细胞株为研究对象,研究刺芒柄花素对结肠癌细胞的生长、增殖及侵袭能力的抑制作用,并分析其可能的作用机制。在此基础上,应用移植肿瘤动物模型,研究芒柄花黄素对动物结肠癌的体内的作用效果及机制。为芒柄花黄素治疗结直肠癌提供实验依据。第一部分芒柄花黄素对结肠癌细胞SW1116和HCT116生长、增殖及侵袭影响的研究。目的:检测Form对结肠癌细胞SW1116及HCT116生长、增殖、侵袭及细胞周期的影响,明确Form对结肠癌的作用效果。方法:常规培养结肠癌细胞SW1116及HCT116,MTT法测定Form对结肠癌细胞SW1116及HCT116生长的影响,流式细胞术进行细胞周期测定,Transwell法测定Form对结肠癌细胞SW1116及HCT116侵袭能力的影响。结果:1.Form对结肠癌细胞生长的抑制以20、50、100、200μM浓度的Form作用于正常结肠上皮细胞株NCM460和结肠癌SW1116和HCT116细胞株24、48和72h后,可抑制结肠癌细胞的生长,且对细胞生长的抑制作用具有时间和浓度依赖性,而Form对正常结肠上皮细胞株NCM460的生长同样具有抑制作用,但同最高浓度Form（200μM）对结肠癌细胞株SW1116和HCT116最长作用时间（72h）抑制率（83.67±4.32%、86.2±5.48%）相比,Form对人正常结肠上皮细胞株NCM460（18.26±3.09%）抑制作用较弱。2.Form对结肠癌细胞周期及增殖指数的影响培养结肠癌细胞株SW1116和HCT116,以不同浓度的Form（20、50、100μM）作用于细胞,用流式细胞术测定Form对结肠癌细胞周期的影响,用上述浓度Form作用于结肠癌SW1116和HCT116细胞株48h后,结果表明,随着Form浓度的逐渐增加,G0/G1期细胞比例上升,100μM Form作用结肠癌SW1116和HCT116细胞48h后,G0/G1期细胞比例分别上升至79.2%、79.7%。说明Form对结肠癌细胞SW1116及HCT116细胞周期具有明显阻滞作用,阻滞于G0/G1期。随着Form浓度的逐渐增加,PI值逐渐降低。3.Form对结肠癌细胞侵袭能力的影响培养人正常结肠上皮细胞株（NCM460）和结肠癌细胞株（SW1116和HCT116）,以不同浓度Form（50、100μM）作用于细胞24 h,Transwell法观察Form对细胞侵袭能力的影响。结果表明,Form可抑制结肠癌细胞SW1116及HCT116的侵袭能力,且这种抑制作用具有剂量依赖性,但对正常结肠上皮细胞株NCM460的侵袭能力无抑制作用。小结:1.Form可抑制结肠癌细胞生长,且抑制作用具有剂量及时间依赖性;2.Form对结肠癌细胞周期阻滞发生于G0/G1期,Form可抑制结肠癌细胞增殖,且抑制作用具有剂量依赖性;3.Form可抑制结肠癌细胞侵袭能力,且抑制作用具有剂量依赖性。第二部分:芒柄花黄素对结肠癌细胞作用机制研究。目的:通过检测Form对结肠癌细胞miR-149及EphB3mRNA、信号通路分子、细胞周期及侵袭相关蛋白表达的影响,探讨其可能的分子抑瘤机制。方法:Western Blot检测Form对结肠癌细胞SW1116及HCT116周期蛋白CyclinD1、Cyclin B1及MMP-2/9、p-ERK、p-AKT、p-PI3K和p-STAT3信号通路的影响。RT-PCR检测Form处理结肠癌细胞SW1116及HCT116后miR-149及EphB3 mRNA的相对表达量。应用瞬时转染技术研究 miR-149和EphB3基因在Form对结肠癌细胞SW1116及HCT116生长及侵袭影响中的作用。结果:1.Form对结肠癌细胞SW1116及HCT116 CyclinD1、Cyclin B1、MMP-2/9及AKT/PI3K/ERK/STAT3蛋白表达的影响Form可抑制结肠癌细胞周期蛋白CyclinD1的表达,且抑制作用呈现剂量依赖性,而对周期蛋白Cyclin B1的表达无影响。Form可下调MMP-2及MMP-9的表达,且抑制作用呈现剂量依赖性。Form显着下调结肠癌细胞SW1116及HCT116p-AKT、p-PI3K和p-STAT3的表达,而对p-ERK的表达无影响,并且总ERK、AKT、PI3K和STAT3蛋白水平在Form作用前后无统计学差异。2.Form对正常结肠上皮细胞株NCM460和结肠癌细胞株SW1116、HCT116 miR-149及EphB3mRNA表达的影响同对照组比较,Form能上调结肠癌细胞SW1116及HCT116miR-149的表达,且具有剂量依赖性（P<0.05）。而Form对EphB3m RNA的表达呈现出相反的作用效果,即下调其表达,并且同样显示出剂量依赖性（P<0.05）。但Form在低浓度时对正常结肠上皮细胞株NCM460的miR-149及EphB3mRNA表达无影响,而在高浓度（100μM）时上调miR-149表达,下调EphB3mRNA表达。3.miR-149及EphB3 siRNA转染人结肠癌细胞株SW1116、HCT116及鉴定同对照组比较,miR-149 mimic转染组SW1116和HCT116细胞miR-149的表达显着上升,表明miR-149 mimic转染成功。siRNA Eph B3RT-PCR结果表明,siEph B3 200nM组及siEphB3 300nM组EphB3mRNA的表达显着低于siRNA对照组及siEphB3 100nM组,且siEphB3 200nM组及siEphB3 300nM组间的表达差异不具有显着性,提示200nM siEphB3即可明显达到沉默EphB3mRNA的效果。4.miR-149转染人结肠癌细胞株SW1116、HCT116后对其EphB3表达的影响miR-149转染人结肠癌细胞株SW1116、HCT116后,EphB3在上述两种细胞的表达均显着降低,提示miR-149对EphB3的表达具有抑制作用。5.Form对miR-149转染人结肠癌细胞株SW1116、HCT116后细胞活性及侵袭能力的影响对照组、Form组、mimic-NC+Form组和mimic miR-149+Form组SW1116细胞活性分别为1.0±0.0、0.39±0.14、0.41±0.18和0.18±0.06;其侵袭细胞数分别为168.2±16.3、67.5±12.0、72.0±18.6和28.3±2.8。对照组、Form组、mimic-NC+Form组和mimic miR-149+Form组HCT116细胞活性分别为1.0±0.0、0.41±0.16、0.42±0.28和0.19±0.07;其侵袭细胞数分别为146.8±11.5、56.2±5.6、58.8±7.2和26.7±5.1。结果表明:上调miR-149表达后Form能抑制SW1116和HCT116细胞活性及侵袭能力。6.Form对siEphB3人结肠癌细胞株SW1116、HCT116后细胞活性及侵袭能力的影响对照组、Form组、siNS+Form组和siEphB3+Form组SW1116细胞活性分别为1.0±0.0、0.49±0.17、0.51±0.24和0.11±0.02;其侵袭细胞数分别为189.6±10.2、63.7±5.9、61.8±4.6和11.2±1.8。对照组、Form组、siNS+Form组和siEphB3+Form组HCT116细胞活性分别为1.0±0.0、0.52±0.19、0.51±0.10和0.22±0.08;其侵袭细胞数分别为171.5±12.0、72.3±9.5、69.4±8.2和12.2±5.0。提示siEphB3后Form能抑制SW1116和HCT116的细胞活性及侵袭能力。小结:1.Form对结肠癌细胞周期阻滞作用是通过抑制细胞周期蛋白Cyclin D1实现的,对结肠癌细胞侵袭能力抑制作用通过下调基质金属蛋白酶MMP-2及MMP-9实现的,Form可下调结肠癌细胞p-AKT、p-PI3K和p-STAT3的表达。2.Form可上调结肠癌细胞miR-149的表达,同时下调EphB3mRNA的表达,且具有剂量依赖性。3.miR-149mimic成功转染;200nM siEphB3即可明显达到沉默EphB3mRNA的效果。4.miR-149对结肠癌细胞EphB3的表达具有抑制作用。5.上调miR-149表达后Form能抑制SW1116和HCT116的细胞活性及侵袭能力。6.沉默EphB3后Form能抑制SW1116和HCT116的细胞活性及侵袭能力。第三部分:芒柄花黄素对裸鼠结肠癌移植瘤生长的影响及机制研究。目的:通过建立结肠癌移植瘤的动物模型,观察Form在体内的抑瘤效果,验证体外实验中的可能作用机制。方法:建立裸鼠移植肿瘤模型,测定Form对肿瘤体积、湿重的影响,计算抑瘤率。HE染色观察Form处理荷瘤小鼠后肿瘤组织病理学变化,免疫组化计数肿瘤组织PCNA阳性细胞,检测肿瘤组织中细胞周期蛋白CylinD1及细胞侵袭相关蛋白MMP-9的表达。结果:1.腺病毒感染HCT116细胞效果应用RT-PCR鉴定腺病毒（Ad-EphB3）及空载腺病毒（Ad-GFP）感染HCT116细胞结果表明,腺病毒（Ad-EphB3）成功感染HCT116细胞,腺病毒（Ad-EphB3）感染HCT116细胞中EphB3mRNA的表达高于空载腺病毒（Ad-GFP）感染HCT116细胞中EphB3mRNA的表达。2.构建了裸鼠结肠癌HCT116细胞和Ad-EphB3感染HCT116细胞移植瘤模型左侧腋窝接种结肠癌细胞后,第5天左右开始可以触及局部结节,瘤体渐增大,所有裸鼠均形成瘤体。移植瘤形状尚规则,多为结节状,有不典型的分叶,初期瘤体表面尚光滑,但随着瘤体的逐渐增大,部分瘤体内发暗,有坏死及出血。3.裸鼠体重及一般状况变化用药期间观察发现,三组裸鼠的体重均逐渐增加,对照组、Ad-EphB3+Form组及Form组的净增加体重分别为4.82±0.62g、5.13±0.81及4.91±0.53 g,经统计学检验,三组间差异无统计学意义（P>0.05）。裸鼠结肠癌移植瘤模型建立过程中及给药后的观察过程中,饮食未见明显变化,精神状态良好,活动自如。4.Form对裸鼠结肠癌移植瘤生长的抑制作用4.1裸鼠结肠癌移植瘤生长曲线以用药天数为横坐标,以计算出的肿瘤体积为纵坐标（V/mm3）,绘制肿瘤生长曲线。从生长曲线看,对照组裸鼠移植瘤第11、14、17、20、23及26天的平均体积分别为60.05±9.2mm3、102.2±10.2mm3、207.2±19.8mm3、265.0±24.3mm3、421.2±40.7mm3及640.0±45.1 mm3,Ad-EphB3+Form组的相应天数平均体积分别为72.8±6.3mm3、107.9±9.8mm3、149.9±13.5mm3、192.2±17.4mm3、253.8±20.6mm3及409.7±32.4mm3,Form组的相应天数平均体积分别为52.6±4.3mm3、97.3±8.8mm3、130.1±11.5mm3、173.5±15.4mm3、213.9±19.1mm3及308.8±29.7mm3,Form组和Ad-EphB3+Form组的裸鼠移植瘤体积均低于对照组,且Form组的裸鼠移植瘤体积低于Ad-EphB3+Form组,差异均有统计学意义（P<0.05）。4.2.Form对裸鼠结肠癌移植瘤湿重、抑瘤率的影响第26天处死裸鼠后,无菌剥离裸鼠肿瘤组织并称取湿重,对照组、Ad-EphB3+Form组及Form组肿瘤湿重分别为0.78±0.10g、0.54±0.06 g及0.42±0.05g。经方差分析,同对照组比较,Form组及Ad-EphB3+Form组肿瘤湿重均降低,差异具有统计学意义（P均<0.05）,Form组肿瘤湿重低于Ad-EphB3+Form组,差异具有统计学意义（P<0.05）。应用Form处理荷瘤裸鼠后,Form组及Ad-EphB3+Form组抑瘤率分别为46.41±5.90%及30.26±7.88%。经独立样本的t检验,两组差异具有显着性。5.Form作用后裸鼠结肠癌移植瘤的光镜形态学观察HE染色后,对Form处理荷瘤小鼠后肿瘤组织进行病理学观察,镜下可见移植瘤细胞呈明显异型性改变,细胞大小不一,细胞核大小、形状及染色不一,核分裂像易见,肿瘤组织内可见部分区域坏死。同对照组比较,Form组和Ad-EphB3+Form组肿瘤组织内坏死范围多见并广泛,纤维组织增生,炎性细胞浸润明显,且Form组较Ad-EphB3+Form组肿瘤组织内坏死范围、纤维组织增生及炎性细胞浸润更明显。6.Form作用后裸鼠结肠癌移植瘤PCNA免疫组化结果免疫组化分析结果表明:同对照组比较,Form组和Ad-EphB3+Form组肿瘤组织PCNA阳性细胞数量明显降低,且Form组PCNA阳性细胞比例低于Ad-EphB3+Form组。7.Form作用后裸鼠结肠癌移植瘤CyclinD1、MMP-9免疫组化结果应用免疫组化检测Form处理荷瘤小鼠后肿瘤组织中细胞周期蛋白CylinD1及细胞侵袭相关蛋白MMP-9的表达,结果表明:同对照组比较,Form组和Ad-EphB3+Form组荷瘤小鼠肿瘤组织中CylinD1、MMP-9的表达降低,且Form组CylinD1、MMP-9的表达低于Ad-EphB3+Form组。小结:1.腺病毒（Ad-EphB3）成功感染HCT116细胞;2.裸鼠结肠癌移植瘤形成良好,成瘤率为100%;3.Form能抑制裸鼠结肠癌移植瘤生长,且EphB3mRNA可削弱Form的抑制作用效果;4.Form促使裸鼠结肠癌移植瘤组织坏死,且EphB3mRNA可削弱Form的作用效果;5.Form抑制裸鼠结肠癌移植瘤细胞PCNA、CylinD1和MMP-9的表达,且EphB3mRNA可削弱Form的作用效果。结论:1.Form可上调结肠癌细胞miR-149的表达,继而作用于其靶基因EphB3,引起靶基因的表达降低;2.Form通过下调结肠癌细胞p-AKT、p-PI3K和p-STAT3信号通路发挥抑瘤作用;3.Form通过抑制结肠癌细胞CyclinD1表达,引起细胞周期阻滞于G0/G1期,继而抑制肿瘤细胞的增殖,且抑制作用具有剂量依赖性。同时,抑制MMP-2/9的表达,对结肠癌的侵袭发挥抑制效应,且抑制作用具有剂量依赖性。4.Form可抑制裸鼠结肠癌移植瘤的生长。
王政强[5]（2017）在《PTEN调控p66shc表达影响结肠癌侵袭转移的机制研究》文中提出第一部分 PTEN和p66shc基因在结肠癌中的表达及其关系研究目的:探讨PTEN与p66shc在结肠癌中的表达情况及PTEN对p66shc表达的影响方法:（1）收集67例结肠癌组织、25例上皮内瘤变组织及57例癌旁组织,通过免疫组织化学检测p66shc的表达,收集67例结肠癌患者临床病理特征,分析p66shc表达与患者临床特征的相关性（2）采用免疫组织化学方法在67例结肠癌组织及57例癌旁组织中检测PTEN表达,并分析PTEN、p66shc两者表达相关性;（3）收集8对新鲜结肠癌及癌旁标本,利用免疫印迹方法检测PTEN及p66shc表达情况;（4）利用慢病毒介导结肠癌细胞系HCT116、SW480中PTEN基因沉默,采用实时定量PCR及免疫印迹法检测PTEN、p66shc mRNA及蛋白表达。结果:（1）p66shc蛋白在结肠癌、上皮内瘤变、癌旁组织中表达水平逐渐降低。在结肠癌中,p66shc表达水平与患者年龄、性别、肿瘤大小、肿瘤分化、T分期及M分期无相关性,而与肿瘤N分期呈正相关,p66shc表达越高,越容易出现淋巴转移;（2）PTEN蛋白在结肠癌中表达较癌旁组织低。在结肠癌及癌旁组织中,PTEN及p66shc表达呈负相关性。（3）2种结肠癌细胞系中,PTEN敲除后,p66shc在mRNA及蛋白水平表达均升高。结论:（1）p66shc可能与结肠癌发生及结肠癌淋巴转移相关;（2）PTEN可在mRNA及蛋白水平抑制p66shc基因的表达。第二部分 PTEN基因通过p66shc调控结肠癌细胞侵袭和转移研究目的:探讨PTEN对结肠癌转移的影响及可能的机制。方法:（1）以结肠癌细胞系HCT116为对象,利用体外细胞侵袭试验检测空白处理组、对照慢病毒组（Control shRNA）、PTEN基因敲低组（PTEN shRNA）以及PTEN基因敲低联合p66shc小干扰RNA组（PTENshRNA+p66siRNA）癌细胞侵袭力。（2）将HCT116细胞及PTEN敲低的HCT116细胞原位种植到裸鼠结肠肠壁构建裸鼠结肠癌原位模型,7周后观察对照组及PTEN基因敲低组裸鼠的成瘤率以及局部和远处转移情况。（3）取对照组及PTEN基因敲低组裸鼠原位癌组织,免疫组化检测PTEN和p66shc的表达。用免疫印迹方法检测AKT、p-AKT、GSK3β、p-GSK3β、p66shc 蛋白的表达情况。结果:（1）PTEN敲低后结肠癌细胞侵袭能力增强。PTEN基因低表达结肠癌细胞,用小干扰RNA抑制p66shc的表达后,癌细胞侵袭能力得到抑制;（2）PTEN敲低促进结肠原位种植瘤的生长以及淋巴结转移;（3）原位种植瘤组织中,PTEN与p66shc表达相反,PTENN低表达,p66shc则高表达。结论:（1）PTEN敲低可促进结肠癌转移;（2）PTEN可能通过调控p66shc的表达而抑制结肠癌的转移。第三部分 PTEN调控p66shc转录的机制研究目的:探讨PTEN调控p66shc基因转录的可能机制方法:（1）利用免疫印迹法检测PTEN基因敲低、PI3K抑制剂LY294002处理、GSK3β抑制剂处理对HCT116细胞p66shc蛋白表达的影响;（2）利用免疫印迹法检测PTEN基因敲低、PI3K抑制剂LY294002处理、GSK3β抑制剂处理对 HCT116 细胞 AKT、p-AKT、GSK-3β、p-GSK-3β、p66shc 的表达以及细胞核内NFAT2的表达影响;（3）软件预测p66shc启动子序列及NFAT2结合位点,采用电泳迁移率及超迁移试验检测NFAT2与特异性探针的结合情况及PTEN敲低对NFAT2与特异性探针结合的影响;（4）采用染色质免疫共沉淀检测NFAT2与p66shc启动子的结合情况及PTEN对NFAT2与启动子结合的影响;（5）设计合成p66shc的启动子载体,利用荧光素酶报告基因实验检测NFAT2与p66shc的结合情况;（6）根据p66shc启动子序列及NFAT2结合位点进行启动子截短试验,截短的载体分别是P-888,P-592,P-395以及P-348,利用荧光素酶报告基因实验检测p66shc启动子活性;（7）对p66shc启动子两处结合位点进行突变,分别形成p66shc-Ml、p66shc-M2、p66shc-M1-M2等3种突变载体,利用荧光素酶报告基因实验检测各突变载体对p66shc启动子荧光素酶活性的影响。结果:（1）PTEN基因敲低促使p66shc蛋白水平升高;PI3K抑制剂LY294002及GSK3β抑制剂可阻断PTEN对p66shc蛋白表达的影响;（2）PTEN基因敲低促使核内NFAT2、p-AKT、p-GSK3β蛋白表达升高,AKT、GSK3β表达水平未见变化,而PI3K抑制剂LY294002及GSK3β抑制剂可抑制核内NFAT2、p-AKT、p-GSK3β蛋白表达升高;（3）NFAT2能与针对2处结合位点设计的生物素标记NFAT2特异性探针结合,而不能与NFAT2突变探针结合;PTEN基因敲低促使NFAT2活性升高;（4）NFAT2可以与p66shc启动子内NFAT2结合位点染色质结合,PTEN基因敲低促使转录因子NFAT2与染色质结合增强;（5）PTEN基因敲低促使p66shc启动子荧光素酶活性增强,而转染NFAT2siRNA可以抑制PTEN基因敲低对p66shc启动子荧光素酶活性的影响。转染NFAT2表达质粒促使p66shc启动子荧光素酶活性升高;（6）缺失第一个NFAT2结合位点的P-395载体转染结肠癌细胞后荧光素酶活性较启动子载体P-888降低,同时缺失2个结合位点的P-348载体荧光素酶活性较P-395载体低;（7）分别突变两处NFAT2结合位点以及同时突变两处NFAT2结合位点,启动子荧光素酶活性均降低。结论:（1）PTEN通过AKT/GSK3β/NFAT2信号通路负向调控p66shc基因的表达。（2）NFAT2是p66shc的正向转录因子,NFAT2在p66shc启动子上有两处结合位点。
高超[6]（2016）在《沉默Musashi1基因对结肠癌细胞生物学特性及放疗敏感性的影响》文中提出结肠癌是全球范围内消化道最常见的恶性肿瘤之一,其发病率在我国仅次于胃癌和食道癌,位居第三,且近年来发病率持续升高,预后差。有关其发病机制及防治措施的研究是生物医学领域研究的热点之一。结肠癌的发生是在不同遗传背景下由致癌基因的激活和抑癌基因的失活共同作用的结果。转录后调控是基因表达的关键部分,这一过程主要受RNA结合蛋白（RNA-Binding Proteins,RBPs）的调节。业已证实,人体基因组中包含有800多种RBPs,其中的几种被发现控制着与癌变过程相关的基因网络。对RBPs深入的研究逐步揭示,它们与转录因子类似,具有抑癌和促癌作用。Musashi1（Msi1）作为一种进化保守的RNA结合蛋白家族成员,对于维持自我更新与分化之间的平衡具有重要作用。众多研究表明,Msi1可作为一种致癌基因,也是多种肿瘤干细胞和（或）祖细胞的重要标记物,能刺激肿瘤干、祖细胞的形成和发展。过度表达Msi1的肠上皮祖细胞可通过激活Wnt、Notch信号通路及调节p21这三个作用靶点,使细胞增殖旺盛,促进祖细胞的致瘤性,增加移植瘤的致瘤性。一般认为,肿瘤干细胞对放化疗抗拒,是肿瘤发生、发展和复发、转移的根源。Msi1可能通过促进β-链蛋白（β-catenin）的核内聚,增加结肠癌放疗的不敏感性,促进侵袭性肿瘤发展。此外Msi1位于多个信号通路的交汇点,是细胞基因表达的关键调节器,在细胞发育和内环境稳态中发挥重要作用。同时,Msi1也可作为多种癌变的关键调节剂,参与肿瘤的发生和发展。Msi1有望成为防治癌症的一个分子靶点。因此,确定Msi1在结肠癌中的作用及其机制具有重要的理论意义和潜在的应用价值。但目前有关Msi1对结肠癌细胞的作用及其机制尚不明确。本研究旨在探讨Msi1在结肠癌发生、发展中的作用及其机制,以及对放疗敏感性的影响。本课题研究将分四部分进行。1.首先在结肠癌患者的癌组织和结肠癌细胞系证实Msi1的高表达,通过RNA干扰技术构建沉默msi1稳转细胞系;2.探讨沉默msi1对结肠癌细胞生物学特性的影响;3.探讨沉默msi1对结肠癌细胞生长影响的分子机制;4.探讨沉默msi1对结肠癌细胞放疗敏感性的影响。第一部分结肠癌组织和细胞中musashi1蛋白表达及musashi1稳定低表达结肠癌细胞系构建目的:检测musashi1在结肠癌组织和结肠癌细胞系的表达水平;构建msi1稳定低表达结肠癌细胞系。方法:采用westernblot方法检测结肠癌患者癌组织、癌周正常组织、以及hct116、sw480和sw620三种结肠癌细胞系中msi1的蛋白表达,挑选msi1表达水平最高的结肠癌细胞系进行后续研究。应用rna干扰技术设计沉默msi1的基因序列及阴性对照序列,通过与质粒连接后感染工具细胞,将干扰质粒及阴性对照质粒植入慢病毒载体,随后感染结肠癌细胞;经过抗生素筛选获得稳定低表达细胞株,并运用real-timepcr及westernblot的方法从rna水平和蛋白水平检测空白组（blank）、阴性对照组（negativecontrol,nc）和敲低组（knockdown,kd）hct116结肠癌细胞基因沉默的效果。结果:通过westernblot方法检测,发现与正常肠粘膜相比,结肠癌组织及三种结肠癌细胞株中msi1蛋白均特异性高表达;在hct116、sw480、sw620三种结肠癌细胞株中,hct116细胞msi1蛋白的表达量最高,因此选取hct116细胞作为后续研究的目的细胞。本研究中,成功构建了带有干扰msi1基因序列gv248-msi1-shrna的慢病毒及阴性对照慢病毒gv248-nc-shrna,将干扰慢病毒及阴性对照慢病毒感染结肠癌hct116细胞,利用嘌呤霉素筛选出稳定的表达株。同时real-timepcr和westernblot结果显示,感染msi1干扰慢病毒载体后结肠癌hct116细胞msi1在rna水平和蛋白水平分别下降了73.85%和59.01%。小结:结肠癌组织及结肠癌细胞株中msi1蛋白均特异性高表达。利用结肠癌hct116细胞株可成功构建稳定低表达msi1细胞系。第二部分沉默musashi1对结肠癌hct116细胞生物学特性的影响目的:探讨沉默musashi1对结肠癌hct116细胞生物学特性的影响。方法:利用构建稳定低表达msi1的结肠癌hct116细胞,应用mts法检测沉默msi1后结肠癌细胞增殖情况,应用流式细胞仪检测细胞周期及凋亡的变化,transwell小室检测其体外侵袭能力,肿瘤球实验检测肿瘤细胞干性。并通过建立裸鼠移植瘤模型,观察沉默msi1对裸鼠成瘤的影响。结果:mts法及transwell小室检测结果显示,沉默msi1后,结肠癌hct116细胞体外增殖及侵袭能力显着下降。流式细胞检测结果显示,沉默msi1后肿瘤细胞的凋亡明显增加,g0/g1期细胞增多。肿瘤球实验结果显示,沉默msi1可明显降低肿瘤球形成的数量。结肠癌hct116细胞裸鼠皮下移植瘤结果显示,降低msi1表达可明显抑制移植瘤的生长。小结:沉默msi1能抑制结肠癌hct116细胞体外增殖能力和侵袭能力,导致细胞g0/g1期阻滞,诱导细胞凋亡。沉默msi1可明显降低结肠癌hct116细胞的干性,抑制移植瘤的生长。第三部分沉默musashi1对结肠癌hct116细胞生长抑制的分子机制目的:探讨沉默musashi1抑制结肠癌hct116细胞生长的分子机制。方法:利用real-timepcr和westernblot技术检测沉默msi1基因后细胞周期蛋白依赖性激酶抑制物p21（抑癌基因）mrna和蛋白的表达水平,并构建p213’-utr荧光素酶报告基因载体（p21wt）及其突变体（p21mu）,将报告基因载体转染沉默msi1的细胞和对照组细胞株,计算msi1敲低组细胞与对照组细胞的荧光比值,并进行比较以判断p213’-utr区活性。结果:westernblot方法检测发现,与空白组及阴性对照组相比较,沉默msi1后结肠癌hct116细胞的p21蛋白表达明显上调;real-timepcr结果显示,3组细胞p21mrna水平的表达未见明显变化。进一步荧光素酶报告实验结果显示,与空白组、阴性对照组相比,敲低组p21wt的荧光素酶活性明显上升,msi1反应位点突变体p21mu的荧光素酶活性则没有明显变化。小结:结肠癌hct116细胞中,msi1能够与其靶基因p21mrna的3’-utr区特异性的结合,并抑制其翻译,下调p21蛋白表达,进而促进肿瘤细胞生长。沉默msi1后可通过上调p21蛋白的表达,发挥抑制肿瘤生长作用。第四部分沉默musashi1对结肠癌hct116细胞放疗敏感性的影响目的:探讨沉默musashi1对结肠癌hct116细胞放疗敏感性的影响。方法:采用慢病毒介导的Msi1干扰表达质粒感染HCT116细胞;对感染的HCT116细胞进行X线照射;运用克隆实验检测沉默Msi1基因对HCT116细胞放射敏感性的影响。通过MTS法检测照射后结肠癌细胞增殖情况,并计算其抑制率。运用流式细胞术检测照射后细胞周期及凋亡的变化。结果:克隆形成实验显示,经08Gy X线照射后,敲低组细胞存活曲线下降,D0、Dq、N和SF2值均明显低于空白组和阴性对照组,相对于空白组和阴性对照组放射增敏比SER分别为1.56和1.47。MTS试验结果显示,各时间段敲低组细胞的增殖活性均显着低于空白组和阴性对照组,而且随着时间和剂量的增加,各组抑制率逐渐增加。进一步流式细胞术显示,照射后各组细胞凋亡率明显增加,并呈现时间依赖性,随着时间延长,凋亡率逐渐增加。敲低组凋亡比例在各时间点增加的程度更加明显。并且照射后敲低组细胞G2/M期比例较空白组和阴性对照组显着下降。小结:抑制结肠癌HCT116细胞Msi1基因表达具有放疗增敏作用,其增敏机制可能是通过促进细胞凋亡,解除放疗后细胞G2/M期阻滞,从而增加结肠癌HCT116细胞的放疗敏感性。结论:1结肠癌组织及结肠癌细胞株中Msi1蛋白均特异性高表达,提示Msi1可能在结肠癌发生与发展中起重要作用;2利用结肠癌HCT116细胞可成功构建稳定低表达Msi1的细胞株;3沉默Msi1可抑制结肠癌HCT116细胞增殖和侵袭能力,导致细胞G0/G1期阻滞,诱导细胞凋亡,降低细胞干性,抑制移植瘤的生长;4沉默Msi1可上调结肠癌HCT116细胞Msi1的靶基因p21蛋白的表达,发挥抑制肿瘤生长的作用;5沉默Msi1可通过促进结肠癌HCT116细胞凋亡,解除放疗后细胞G2/M期阻滞,发挥放疗增敏作用。
姜靖雯[7]（2016）在《CCND1在结肠癌中受microRNA-340调控而增加细胞对5-Fu的耐药》文中进行了进一步梳理研究背景和目的结肠癌（colorectal cancer, CRC）是发生在结肠部位的消化道肿瘤,发病率有逐渐升高的趋向。其好发于直肠与乙状结肠交界处,高危年龄为40～50岁,男女发病比例为2～3：1。在全球最高影响因子杂志CA-A Cancer Journal for Clinicians最近发表的2015年中国癌症统计数据中表示,结肠癌为我国最常见的肿瘤之一,严重威胁了国人的健康。结肠癌根据组织学病理类型主要分为腺癌、鳞腺癌、鳞癌和未分化癌,其中,腺癌又包括了几个亚型,如管状腺癌、乳头状腺癌、黏液腺癌等。结肠癌早期是指原发灶肿瘤限于粘膜层或粘膜下层者,其治愈率较高,5年生存率已超过80%,而晚期的结肠癌患者由于出现局部淋巴结转移和远处器官侵犯,5年生存率低于50%。肿瘤的发生发展是一个非常复杂的过程,与日常饮食不节、环境的污染以及遗传因素密切相关。其包含各种基因的参与。结肠癌的致病因素很多,目前证据比较明确的包括：1、30%的结肠癌发病与遗传有关；2、不良的饮食习惯,如低纤维、高脂肪、高蛋白饮食,近年来发病率的升高与近年来我国人民生活水平的提高不无关系：3、不良的排便习惯会使有害物质聚集在结肠癌,从而损伤肠粘膜而致癌。在分子水平方面,结肠癌发生发展的分子机制发生的病因主要有以下几个方面：修复基因的突变；3、抑癌基因的失活、功能缺失,如管家基因APC突变后失去对β连环蛋白的调节,从而影响细胞间粘附和相关信号通路；4、原癌基因过表达、激活,如KRAS基因点突变可导致其下游靶蛋白p21的氨基酸的改变,p21的功能出现下降；5、端粒酶长度的改变；6、相关信号通路的异常激活；7、相关凋亡调控紊乱等。细胞周期蛋白Cyclin家族是一类广泛存在于真核细胞中,在细胞周期进展中可循环反复地出现-消失-出现的蛋白质,其中,CCND1,也叫CyclinD1,细胞周期蛋白1,属于高度保守的细胞周期家族蛋白。CCND1的编码基因定位在11q13上,包含5个外显子,全长约15kb。在有生长因子的促进下,CCND1最早在细胞周期中被合成,在合成前期的中期到达峰值。CCND1可与细胞周期蛋白依赖性激酶cyclin-dependent kinases （CDKs）,如CDK4或者CDK6结合形成复合体并作为它们的调节亚基,促进细胞周期从G1到S期的转化,完成对细胞周期进程的调控。此外,研究发现,除了促进细胞分裂外,CCND1还具有一些独立于CDKs活性的促进基因转录的功能。作为大家较早认可的原癌基因,CCND1的异常表达通过调控细胞周期使细胞停滞于合成期引起细胞过度增殖进而导致肿瘤的发生。在多种肿瘤中,如结肠癌、膀胱癌、生殖系统肿瘤、胃癌、肺癌等,肿瘤组织的CCND1表达明显高于邻近正常组织的CCND1表达,且与病理类型、肿瘤临床分期等指标相关。另外,CCND1在促进肿瘤的侵袭转移方面,也发挥着举足轻重的作用。文献报导,CCND1的过表达可以在不同肿瘤里,如乳腺癌、胃癌等,促进细胞的侵袭和迁移,导致不良的预后。MicroRNA （miRNAs）,是一系列小分子非编码的单链RNA,一般由内源基因编码的约22个核苷酸组成,主要参与转录后基因表达调控。miRNAs有广泛多样的生物学功能,它们参与了人体生命过程中一系列的重要进程,包括早期发育,细胞增殖,细胞凋亡,细胞死亡,脂肪代谢和细胞分化等。miRNAs可以通过识别并互补结合目的基因的3’UTR端来直接靶向目的基因,下调目的基因的表达,调节相关信号通路,进而发挥其生物学功能。miRNAs主要通过以下三种方式发挥抑制靶基因的作用：1、切断靶基因的mRNA分子：niRNAs通过完全互补地结合靶基因的序列而切断了靶基因的mRNA;2、阻碍靶基因的翻译过程：miRNAs可以不影响mRNA的序列,但是可以不完全地结合靶基因的序列进而阻碍靶基因的翻译过程；3、上述两种方式同时进行,一方面切断靶基因mRNA,一方面不完全结合靶基因阻碍翻译。近年来研究表明,miRNAs在肿瘤的发生发展中过程中也发挥了相当大的作用。在各种肿瘤中,我们常常可以检测到多种肿瘤中多种miRNAs的异常表达,包括过表达和表达下调,这种现象也提示我们miRNAs在肿瘤的发生、发展、转移等不同的过程中发挥着不同的作用。从发挥的功能来说,miRNA事实上可以被当作癌基因或者是抑癌基因来看,如miR-21则通过靶向抑癌基因PTEN促进肿瘤细胞生长,而let-7,作为,miRNAs的一种,可以通过靶向调控其下游RAS蛋白来发挥其抑癌的作用。更为重要的是,miRNAs还与细胞对化疗药物的敏感性有关,如在卵巢癌中,过表达的miR-214通过作用于其下游靶基因PTEN,进而导致PTEN的表达下调,从而激活AKT信号转导通路,促进细胞的增殖,导致患者对顺铂（cisplatin）化疗的不敏感。5-Fu,5-氟尿嘧啶,即胸苷酸合成酶抑制药,为临床上治疗常见实体瘤,如结肠癌、乳腺癌、胃癌的常用化疗药物。5-Fu作为抗代谢类化合物,5-Fu进入体内后可转变为5-氟尿嘧啶脱氧核苷酸（5F-dUMP）,可抑制脱氧胸苷酸合成酶,抑制脱氧尿苷酸（dUMP）甲基化转变为脱氧胸苷酸（dTMP）的进程,进而达到干扰DNA的合成和修复的作用。另外,在体内还可转化为5-氟尿嘧啶核苷,以伪代谢产物形式与RNA整合,干扰蛋白质的合成,导致细胞的凋亡。肿瘤耐药性（drug resistance, DR）,导致患者对化疗不敏感,是化疗失败的主要原因之一,他的发生是非常复杂的,需要各种因素参与、共同作用。虽然5-Fu作为恶性消化道肿瘤治疗的一线药物,但是由于肿瘤耐药问题的出现,治疗的总体效果并不是很好。导致5-氟尿嘧啶耐药的原因很多,包括药物活化障碍、体内转运、摄取功能失控、作用靶点酶的数量及活性、代谢异常等。如黏蛋白MUC1（mucinl）的过度表达可以抑制胰腺癌细胞对5-Fu的摄入减少进入导致5-氟尿嘧啶的作用效果减弱,肿瘤细胞对5-Fu的敏感性降低。研究目的分析CCND1在结肠癌组织及正常肠组织中的表达特性;研究干扰CCND1后结肠癌细胞对5-Fu敏感性的变化;研究miR340调控结肠癌细胞对5-Fu的敏感性的影响；验证CCND1为miR340的直接靶向基因。研究内容与方法1.CCND1在结肠癌组织及正常肠组织中表达特性1)用实时荧光定量RT-qPCR技术检测CCND1在结肠癌组织及正常肠组织中mRNA水平表达差异；2)采用western-blotting技术检测CCND1在结肠癌组织及癌旁组织中的蛋白水平表达差异；3)IHC观察CCND1蛋白在结肠癌癌症组织和其对应的癌旁组织的表达情况。2.研究经干扰CCND1作用后,结肠癌细胞对5-Fu的敏感性的变化1)采用siRNA干扰技术,将3个携带干扰CCND1序列的siRNA和对应negtive control的siRNA分别转到2个结肠癌细胞株HCT116和SW480中,通过RT-qPCR和western-blotting在RNA水平和蛋白水平验证干扰效率,筛选出干扰效率最高的片段,进行后续实验;2)铺96孔板,将干扰CCND1的HCT116和SW480细胞和相应的negtive control细胞分别接种到孔板中,加入5-Fu后检测IC50值,观察药物浓度反应效果。3.研究miR340对结肠癌细胞对5-Fu的敏感性的影响1)利用瞬时转染技术,将miR340的mimic分别转入HCT116和SW480细胞中,RT-qPCR检测瞬转效率；2)铺96孔板,将过表达miR340 mimic的SW480细胞和negtive control细胞分别接种到孔板中,加入5-Fu后检测IC50值,观察药物浓度反应效果。4.验证CCND1为miR340的直接靶向基因1)在两株结肠癌细胞HCT116和SW480中转染miR-340的mimic,48小时后RT-qPCR和western-blotting检测CCND1的mRNA水平及蛋白水平;2)在两株结肠癌细胞HCT116和SW480中转染miR-340的inhibitor,48小时后RT-qPCR和western-blotting检测CCND1的mRNA水平及蛋白水平3)用生物预测软件预测到CCND1可能为miR-340的靶基因,miR-340可结合到CCND1的3’UTR端；4)用双荧光素酶报告显示miR-340可直接靶向CCND1。5.统计学分析：采用SPSS 21.0统计软件对结果得到的数据采取统计检测P值,计量资料的数值用x±s来显示。①实时荧光定量PCR检测各种癌和癌旁组织或结肠癌细胞表达量的2-ΔΔC t值的统计使用单因素方差分析方法（ONEWAY ANOVA）,如有统计学意义,进行多重比较,采用Dunnett方法；②生存分析用单因素Cox回归模型,再用多因素Cox回归模型确定各参数是否可作为独立预后因素；两组间率的比较采用四格表卡方检验)；③噻唑蓝方法观察药物浓度反应曲线,应该拿析因设计资料的方差分析进行数据处理,结果如果有统计学差异,不同组别之间同一个药物浓度的OD值比较采用unpaired t test,同一个组不同药物浓度测出来的OD值采用One-Way ANOVA方法分析,如果存在统计学上的差异,不同的药物浓度之间的两两比较使用Dunnett统计学方法；④不同处理组间的比值、穿膜细胞数等指标采用两独立样本t检验；以P<0.05认定为其结果具有统计学差异。研究结果1.与正常肠组织相比,CCND1的表达量在癌组织中显着偏高,且卡方检验得出表达量与T分期相关（即Ⅲ-Ⅳ期的患者CCND1的表达明显高于Ⅰ-Ⅱ期的患者）,与年龄、性别、N分期、临床分期无关。单因素和多因素Cox回归分析得出年龄、N分期与CCND1的表达量可作为独立预后因素。1)通过RT-qPCR检测癌组织及对应癌旁组织中CCND1mRNA含量,发现癌组织的mRNA水平明显高于癌旁组织mRNA水平（P<0.01）,数据统计应用两独立样本t检验,结果有统计学意义;2)通过western-blotting检测癌组织及对应癌旁组织中CCND1蛋白含量,以GADPH为内参,发现癌组织的CCND1蛋白含量明显高于癌旁组织；3)IHC结果显示,CCND1主要在核表达。与癌旁组织相比,CCND1在癌组织中染色更深,表达细胞比例更多,统计学分析其在两种组织中的表达有显着性差异（P<0.01）。CCND1表达量与临床参数之间相关性的统计学分析证明,CCND1的表达量与T分期显着相关（P<0.01）,即III-IV期的患者CCND1的表达明显高于I-H期的患者,而与性别、年龄、N分期、临床分期无关（P值分别为0.484,0.774,0.135,0.503）；4)经单因素生存分析,年龄、CCND1表达量和N分期都可影响患者的总体生存时间,年龄>65岁患者预后差于年龄<65岁患者（P<0.01）,CCND1高表达的患者预后差于低表达者（P<0.01）,NO患者预后明显好于N1-N2患者（P<0.01）。多因素生存分析结果表示,年龄（P<0.01）、CCND1表达量（P<0.05）以及N分期（P<0.01）可以作为患者预后的独立影响因素,而性别、T分期和临床分期（P值分别为0.723,0.262,0.132）均不构成独立影响因素。2.干扰CCND1后,结肠癌细胞对5-Fu的敏感性增加1)采用SiRNA干扰技术,将携带干扰CCND1序列的3个siRNA和对应negtive controlsiRNA分别转到2个结肠癌细胞株HCT116和SW480中,分别于转染后的24小时、48小时通过RT-qPCR和western-blotting来验证CCND1在RNA和蛋白水平的干扰效率,筛选出干扰效率最高的2号片段,48小时的干扰效率分别达79%和68%,故在后续的试验中,选定2号片段,干扰48小时作为实验标准;2)铺96孔板,将干扰CCND1的HCT116和SW480细胞和相应的negtive control细胞分别接种到孔板中,加入5-Fu作用48小时后检测2组细胞的IC50值,观察药物浓度反应效果。结果显示,干扰CCND1后,HCT116和SW480的IC50值均有下降,HCT116细胞的siCCND1组IC50值约为10uM, negtive control组的IC50值为20uM, SW480细胞的siCCND1组IC50值也约为10uM, negtive control组的IC50值约为20uM。经siCCND1干扰后,两株细胞对5-Fu的敏感性均有增加,差异均具有统计学意义（P<0.05）。3.过表达miR-340后,结肠癌细胞对5-Fu的敏感性增加1)利用瞬时转染技术,将miR-340的mimic转入结肠癌细胞株HCT116和SW480细胞中,RT-qPCR检测瞬转效率分别高于对应negtive control3倍和4倍（P<0.01）；2)铺96孔板,将过表达miR340 mimic的HCT116和SW480细胞及对应的negtivecontrol细胞分别接种到孔板中,加入5-Fu后48小时检测IC50值,观察药物浓度反应效果。结果显示,过表达miR-340后,HCT116和SW480的IC50值均有下降,HCT116中siCCND1组IC50值约为10uM,对照为20uM, SW480中siCCND1组IC50值也约为10uM,对照约为20uM。两株细胞对5-Fu的敏感性均有增加,差异具有统计学意义（P<0.05）。4.验证CCND1为miR-340的直接靶向基因1)在两株结肠癌细胞HCT116和SW480中转染miR-340的mimic,48小时后RT-qPCR和western-blotting检测CCND1的mRNA水平及蛋白水平,结果显示两株细胞中CCND1表达水平均明显下降（P<0.01）；2)在两株结肠癌细胞HCT116和SW480中转染miR-340的inhibitor,48小时后RT-qPCR和western-blotting检测CCND1的mRNA水平及蛋白水平均有上升（P<0.05）；3)用生物预测软件预测到CCND1可能为miR-340的靶基因,miR-340可结合到CCND1的3’UTR端；4)双荧光素酶报告显示miR-340可直接靶向CCND1。结论CCND1在结肠癌中高表达,其表达量与T分期相关（即III-IV期的患者CCND1的表达明显高于I-II期的患者）,且年龄、N分期与CCND1的表达量可作为独立预后因素。干扰CCND1后,发现结肠癌细胞对5-Fu的敏感性增加,同样,过表达miR-340后细胞对5-Fu的敏感性也显着增加。通过生物软件预测及双荧光素酶报告证实,miR-340可以直接靶向CCND1。换句话说,CCND1可以受miR-340的抑制从而影响结肠癌细胞对5-Fu的敏感性。
冯飞雪[8]（2014）在《NF-κB介导的Rab27A表达上调促进结肠癌干细胞的干性》文中认为结肠癌全球高发,常规治疗后往往发生复发和转移,治愈率低,致死率世界排名第四。肿瘤干细胞（Cancer Stem Cells,CSCs）是肿瘤组织中具有自我更新、多向分化潜能、无限增殖能力、转移和耐药特征的数量极少的细胞群,是肿瘤发生、发展、复发和转移的决定性因素。因此深入研究肿瘤干细胞调控机制有助于设计针对肿瘤干细胞的治疗策略。肿瘤干细胞处在一个由内皮细胞、成纤维细胞、炎性细胞和胶质细胞等组成的微环境“niche”中。肿瘤干细胞微环境介导的基因表达异常是肿瘤演变过程中重要分子事件。微环境中的炎性因子通过激活肿瘤干细胞相关通路,如Notch、Hedgehog、STAT3和NF-κB,实现对CSCs的调控;同时CSCs通过分泌细胞因子对自身所处的“niche”进行改造。研究肿瘤干细胞如何应对肿瘤微环境中的炎症信号,以及如何通过自分泌和旁分泌的方式对微环境产生影响是本课题的研究方向。在细胞分泌途径中Rab蛋白家族发挥着重要作用。Rab为小GTP酶,属于Ras超家族,主要负责细胞内囊泡运输,Rab27是其中主要负责细胞内物质分泌的蛋白,有两个异构体Rab27A和Rab27B。Rab27A功能失常会引发疾病的发生,如格里塞利综合征和代谢综合症。在肿瘤研究领域,过表达Rab27A促进乳腺癌和黑色素瘤的生长和转移。Rab27A以外泌体依赖和非依赖的方式对肿瘤微环境进行改造,为肿瘤的发展和转移提供条件。本研究旨在回答rab27a是否影响结肠癌干细胞的功能?其机制是否与细胞因子分泌有关?炎症信号nf-κb是否影响rab27a的表达?【目的】1)利用结肠癌临床样本,肿瘤细胞系和肿瘤干细胞微球培养模型,检测rab27a与肿瘤恶性程度以及肿瘤干细胞干性是否存在相关性。2)干预rab27a是否对ht29肿瘤干细胞干性和增殖有影响?3)在上述功能变化的基础上,回答rab27a影响肿瘤干细胞的功能是否与细胞因子分泌有关。4)最后探讨肿瘤干细胞的炎症微环境是否参与影响rab27a在肿瘤干细胞中的表达水平。【方法和结果】1)免疫组织化学染色结果显示,在结肠癌临床样本中rab27a染色阳性率为66.7%。6株结肠肿瘤细胞系均能在肿瘤干细胞微球（tumorsphere）培养体系中生长,但是球体形状不同;流式细胞术结果表明,这6株细胞系中干性标志分子cd44+细胞比例与肿瘤的恶性程度呈正相关性;rt-pcr和westernblot结果显示,rab27a的表达水平与结肠癌的恶性程度呈正相关性。2)流式细胞术结果显示ht29sphere中干细胞标志物cd44+和pkh26high细胞比例明显高于贴壁肿瘤细胞;rt-pcr结果显示,与贴壁ht29细胞比较,肿瘤干细胞标志分子在传代的sphere中表达升高,而分化标志分子表达降低。该结果表明通过肿瘤干细胞微球培养体系获得的ht29sphere具有干性特征。3)rt-pcr和westernblot结果显示,在ht29sphere中rab27a的表达高于贴壁ht29细胞;过表达rab27a使ht29sphere形成数目和体积增加;流式细胞术结果显示,过表达rab27a使ht29肿瘤细胞中cd44+和pkh26high细胞比例升高。rt-pcr和westernblot结果显示过表达rab27a使周期相关蛋白cyclind和cdk4表达升高,而p27表达降低;流式细胞术结果显示,过表达rab27a后ht29肿瘤细胞和sphere细胞中s期细胞比例升高。同时,干涉rab27a后得到与过表达反向的结果。4)过表达rab27a的sphere培养上清促进了ht29sphere的生长。elisa结果显示,过表达rab27a的sphere培养上清中vegf和tgf-β的浓度升高。我们通过激光共聚焦显微镜观察到,Rab27A呈现细胞核周单侧聚集分布,分布密度由细胞核向细胞膜依次递减;Rab27A表达水平高的细胞群中PKH26high细胞比例增加。该结果说明Rab27A通过促进细胞因子的分泌影响肿瘤干细胞的功能。5)体内功能实验表明,100个HT29 sphere细胞即可在免疫缺陷小鼠体内成瘤。过表达Rab27A后,HT29肿瘤细胞和肿瘤干细胞在裸鼠体内生长加快。CD31免疫组化结果显示,过表达Rab27A组中血管生成高于对照组,可能与Rab27A促进VEGF分泌有关。6)RT-PCR和Westernblot结果显示,HT29 sphere中p65表达高于正常HT29细胞。双荧光素酶报告实验显示,HT29 sphere细胞中NF-κB信号通路活性高于正常HT29细胞。此外,RT-PCR结果显示NF-κB下游靶基因IL-6的表达在传代的HT29sphere中升高。7)RT-PCR和Western blot结果显示,过表达p65后Rab27A表达升高,而NF-κB信号通路抑制剂PDTC和BAY-11-7082使Rab27A表达降低。双荧光素酶报告结果表明,p65使Rab27A启动子转录活性升高,而PDTC和BAY-11-7082使p65介导的Rab27A启动子转录活性降低。8)HT29肿瘤干细胞经TNFα处理后,球体生长速度加快;流式结果显示CD44+和PKH26high细胞比例升高;双荧光素酶报告结果显示HT29 sphere中NF-κB信号通路活性升高,同时RT-PCR和Western blot结果显示p65和Rab27A的表达升高。【结论】本课题首次确定了Rab27A促进了结肠癌干细胞的干性和增殖,并促进了结肠癌肿瘤细胞的生长。同时我们发现TNFα介导的NF-κB信号通路活化使HT29 sphere中p65表达升高,从而使Rab27A的表达升高,促进了VEGF和TGF-β的分泌,最终使HT29肿瘤干细胞的干性增加,增殖加快。本课题首次阐明炎症通过促进细胞分泌蛋白Rab27A的表达来增强细胞因子的分泌参与调控结肠肿瘤细胞的干性,为肿瘤干细胞的研究开拓了新的角度。
晏阳[9]（2014）在《E2F-1启动子并表达IL-15溶瘤腺病毒联合免疫细胞治疗结直肠癌的实验研究》文中研究表明研究背景：溶瘤病毒是一类天然存在或经过人工改造后能够选择性感染并裂解肿瘤细胞的病毒，对正常组织细胞影响很小。利用细胞周期相关转录因子E2F-1在多数实体瘤中高表达的特点，设计构建靶向该基因的溶瘤病毒在膀胱癌、胃癌、肝癌等动物模型中得到验证，这也为结直肠癌基因治疗开拓了思路。然而，最早被应用于临床试验的溶瘤病毒ONYX-015的试验结果表明，其作为单一疗法治疗肿瘤抑瘤作用并不明显，需要联合辅助疗法提高抗肿瘤作用。近些年利用细胞过继免疫细胞治疗肿瘤取得长足进展，被视为可与溶瘤病毒结合使用的安全有效的方法。另一方面，研究者在病毒基因组中插入免疫调节基因使得病毒在直接杀伤肿瘤细胞的同时释放免疫调节因子，优化抗肿瘤免疫反应，这成为抗肿瘤“病毒-基因”策略新方向。IL-15作为非常具有潜力的用于肿瘤治疗的细胞因子并未在溶瘤病毒构建中得到充分认识，利用其正向免疫调节作用，同时或序贯给予表达IL-15溶瘤病毒联合过继免疫细胞治疗或可进一步提高抗肿瘤作用。研究目的：研究E2F-1在结直肠癌中表达情况，构建靶向E2F-1基因和同时表达IL-15基因溶瘤腺病毒，探讨新型溶瘤病毒联合过继免疫细胞（CIK、CTL）治疗结直肠癌的可行性和有效性。研究方法：1)利用Western blot方法检测结直肠癌细胞系SW620、SW480、LS174T中E2F-1表达情况；收集28例直肠癌、32例结肠癌、24例胃癌和正常黏膜组织，免疫组化法检测组织中E2F-1表达情况。2)通过质粒重组、病毒包装构建E2F-1启动子溶瘤病毒Ad-E2F，同时表达IL-15基因的Ad-E2F/IL15病毒以及CMV启动子调控下的复制缺陷性腺病毒Ad-EGFP作对照病毒。3)取健康志愿者外周血PBMC，分别扩增培养CIK和CTL细胞，流式细胞术测定细胞表型。4)荧光显微镜观察Ad-EGFP感染细胞的能力；MTT法检测重组腺病毒Ad-E2F感染对细胞增殖的影响；流式细胞术检Ad-EGFP感染对肿瘤细胞周期的影响；乳酸脱氢酶（LDH）释放法检测Ad-E2F联合CIK细胞的体外杀伤作用；构建裸鼠原位直肠癌动物模型；体内实验观察Ad-E2F联合CIK细胞的抗肿瘤作用。5)MTT法比较Ad-EGFP、Ad-E2F和Ad-E2F/IL15感染对细胞增殖的影响；ELISA检测细胞上清IL-15表达量；利用裸鼠皮下瘤动物模型比较不同腺病毒的体内抗肿瘤作用；小鼠PET扫描观察病毒抗肿瘤作用；LDH法检测Ad-E2F/IL15联合CTL细胞的体外杀伤作用；体内实验观察Ad-E2F/IL15联合CTL的抗肿瘤作用。研究结果：1)Western blot检测结果显示SW620、SW480、LS174T细胞系中E2F-1均阳性表达；直肠癌、结肠癌和胃癌组织中E2F-1基因阳性率分别为67.9%（19/28）、53.1%（17/32）和83.3%（20/24），均高于正常黏膜组织（p＜0.01）。2)经过多次酶切和PCR鉴定，重组腺病毒Ad-EGFP、Ad-E2F和Ad-E2F/IL15构建成功且达到实验用滴度。3)CIK和CTL细胞表型鉴定符合要求。4)5型腺病毒Ad-EGFP能高效感染肿瘤细胞而对CIK细胞影响较小；Ad-E2F能明显抑制高表达E2F-1基因肿瘤细胞系SW620的增殖，并存在明显的量效关系，而对正常细胞系Wi38和CIK细胞无明显影响；Ad-E2F杀伤肿瘤细胞后，剩余细胞G1期比例减少，S期比例明显增加；Ad-E2F联合CIK细胞较二者单独应用对SW620细胞有更强的杀伤作用（p＜0.01）。成功构建裸鼠原位直肠癌动物模型，成瘤率80%；体内实验显示Ad-E2F局部注射联合CIK细胞尾静脉注射抗肿瘤作用最强，t检验结果显示CIK联合Ad-E2F治疗组与PBS组（p＜0.0001），CIK组（p=0.0002）和Ad-E2F组（p＜0.0001）差异有统计学意义。5)Ad-E2F/IL15也能靶向杀伤肿瘤，同时高效表达IL-15，而对正常细胞系和CTL细胞增殖无明显影响；不同病毒的体内实验比较显示Ad-E2F/IL15治疗组抑瘤作用最强，治疗效果显着优于其他治疗组（PBS&Ad-E2F/IL15, p=0.0002; Ad-EGFP&Ad-E2F/IL15, p=0.0008; Ad-E2F&Ad-E2F/IL15, p=0.0054）；Ad-E2F/IL15联合CTL细胞的体外杀伤作用较单独应用明显提高；体内实验也证实联合Ad-E2F/IL15瘤内注射和CTL静脉注射较之二者单独应用能更显着地抑制肿瘤生长（p＜0.001）。研究结论：1)E2F-1基因在结直肠癌中高表达，可以作为肿瘤基因治疗靶点；2)E2F-1启动子溶瘤病毒能够靶向杀伤肿瘤细胞，而对正常细胞少有影响；3)5型重组腺病毒对过继免疫细胞感染能力弱，且不影响其增值，二者可以联合应用；4)Ad-E2F联合CIK细胞，Ad-E2F/IL15联合CTL细胞能分别提高抗肿瘤作用。
赵正飞[10]（2014）在《AIF、P27与结肠癌细胞凋亡的关系及相关性探讨》文中研究表明目的：线粒体作为细胞凋亡的控制中心已越来越受到人们的重视，线粒体中释放的凋亡诱导因子（Apoptosis-inducingfactor： AIF）被证实与凋亡密切相关。AIF是不依赖含半胱氨酸的天冬氨酸水解酶（cysteinyl aspartate specific proteinase:caspases）的细胞凋亡途径的关键因子。AIF在人体的正常细胞及各种癌细胞均广泛表达，正常生理状况下AIF位于线粒体,凋亡信号可以引起线粒体膜完整性的破坏，AIF从线粒体内异位至细胞核内，导致染色体破裂为片段引起细胞凋亡。P27与细胞凋亡周期依赖蛋白（Cyclin dependent kinases:CDK）或者cyclin-CDK复合物（Cyclin：细胞周期蛋白）结合并抑制其活性、阻止细胞从G1到S期的转换、抑制细胞的增殖、促进细胞间的粘附及诱导细胞的凋亡。细胞内P27蛋白低表达或缺乏将可能促使细胞进入S期，导致凋亡、增殖的异常，引起肿瘤的发生和发展。本实验通过免疫组化的方法，检测结肠癌组织、结肠腺瘤组织及结肠正常粘膜组织中AIF、P27的表达情况，分析其与结肠癌临床病理特征的关系、二者间的相互关系及在细胞内表达位置之间的关系等，探讨两者在结肠癌细胞凋亡的表达及相关性。方法：收集泸州医学院附属医院胃肠外科从2013年1月至2013年8月的结肠癌的外科手术切除标本105例术后存档的石蜡标本，同时选取相应的正常粘膜组织105例,另选取经手术或者消化道内镜切取的结肠腺瘤标本30例作为研究对象。采用免疫组化SP法，联合检测AIF与P27两种蛋白在结肠各组织中的表达情况，分析癌组织中两者的表达情况与临床病理特征的关系。结果：1.AIF在结肠癌、结肠腺瘤、正常结肠粘膜组织的表达阳性率分别为57.1％、28.5％、7.6％，两两比较，三者之间差异有统计学意义。AIF在结肠癌组织表达的阳性率与结肠癌患者的年龄、性别、肿瘤部位、侵润深度等临床病理特征之间无明显相关性；AIF胞核表达与结肠癌肿瘤分化程度之间呈负相关，与淋巴结转移呈正相关。2.P27在结肠癌、结肠腺瘤、正常结肠粘膜组织的表达阳性率分别为41.9％、62.8％、78.1％，结肠癌组织与正常结肠粘膜组织及腺瘤组织之间差异有统计学意义，腺瘤与正常粘膜组织差异无统计学意义，结肠癌组织与腺瘤组织之间差异无统计学意义；P27在结肠癌组织表达的阳性率与患者的年龄、性别、肿瘤部位、侵润深度、肿瘤大小无明显相关性，而与分化程度、Duckes分期及淋巴转移有相关性；P27在胞浆的阳性表达与肿瘤的分化程度成负相关，与淋巴转移成正相关。3.AIF与P27在结肠癌的阳性表达成负相关，而AIF在胞核的阳性表达与P27在胞浆的阳性表达成正相关。结论：1.结肠癌组织中AIF的阳性表达高于腺瘤及正常粘膜组织，AIF的阳性表达水平与结肠癌的性别、年龄、肿瘤直径、分化程度、侵润深度、Duckes分期、有无淋巴结转移之间均无相关性。2. P27在结肠癌中的表达低于腺瘤及正常粘膜组织，P27在结肠癌组织的表达水平与肿瘤分化程度、Duckes分期及有无淋巴结转移相关，而与性别、年龄、肿瘤直径、侵润深度之间无相关性。3.在结肠癌中，AIF胞核的表达水平与肿瘤的分化程度及淋巴结转移相关，P27在胞浆的表达水平与肿瘤的分化程度及淋巴结转移相关，AIF与P27在结肠癌的表达呈负相关，AIF在胞核的表达与P27在胞浆的表达呈正相关，二者在结肠癌的发生发展密切相关。4.AIF及P27是结肠癌的早期生物学指标，调节两者在细胞内的表达水平及改变两者在细胞内的位置变化，可能为结肠癌的生物治疗提供新的理论依据和靶点。
二、人突变p27重组腺病毒的构建及其在结肠癌细胞SW480中的表达（论文开题报告）
（1）论文研究背景及目的
此处内容要求：
首先简单简介论文所研究问题的基本概念和背景，再而简单明了地指出论文所要研究解决的具体问题，并提出你的论文准备的观点或解决方法。
写法范例：
本文主要提出一款精简64位RISC处理器存储管理单元结构并详细分析其设计过程。在该MMU结构中,TLB采用叁个分离的TLB,TLB采用基于内容查找的相联存储器并行查找,支持粗粒度为64KB和细粒度为4KB两种页面大小,采用多级分层页表结构映射地址空间,并详细论述了四级页表转换过程,TLB结构组织等。该MMU结构将作为该处理器存储系统实现的一个重要组成部分。
（2）本文研究方法
调查法：该方法是有目的、有系统的搜集有关研究对象的具体信息。
观察法：用自己的感官和辅助工具直接观察研究对象从而得到有关信息。
实验法：通过主支变革、控制研究对象来发现与确认事物间的因果关系。
文献研究法：通过调查文献来获得资料，从而全面的、正确的了解掌握研究方法。
实证研究法：依据现有的科学理论和实践的需要提出设计。
定性分析法：对研究对象进行“质”的方面的研究，这个方法需要计算的数据较少。
定量分析法：通过具体的数字，使人们对研究对象的认识进一步精确化。
跨学科研究法：运用多学科的理论、方法和成果从整体上对某一课题进行研究。
功能分析法：这是社会科学用来分析社会现象的一种方法，从某一功能出发研究多个方面的影响。
模拟法：通过创设一个与原型相似的模型来间接研究原型某种特性的一种形容方法。
三、人突变p27重组腺病毒的构建及其在结肠癌细胞SW480中的表达（论文提纲范文）
（1）Tenovin-6抑制结肠癌细胞增殖的作用及机制研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 第1章 文献综述 |
| 1.1 结肠癌 |
| 1.2 肿瘤细胞葡萄糖吸收及其调控机制 |
| 1.2.1 GLUT 家族 |
| 1.2.2 PGC-1 家族 |
| 1.2.3 Sirtuins家族 |
| 1.3 Tenovin-6 在肿瘤中的作用 |
| 1.3.1 Tenovin-6 的结构和功能 |
| 1.3.2 Tenovin-6 在肿瘤中的抑制作用 |
| 第2章 引言 |
| 2.1 研究背景及意义 |
| 2.2 主要研究内容 |
| 2.3 技术路线 |
| 第3章 Tenovin-6 对结肠癌细胞增殖的影响 |
| 3.1 实验材料、试剂和仪器 |
| 3.1.1 实验材料 |
| 3.1.2 实验试剂和仪器 |
| 3.1.3 溶液的配置 |
| 3.2 实验方法 |
| 3.2.1 细胞培养 |
| 3.2.2 MTT法测IC50值 |
| 3.2.3 iCELLigence 法测生长曲线 |
| 3.2.4 软琼脂单克隆形成实验 |
| 3.2.5 Brd U荧光标记染色实验 |
| 3.2.6 平板克隆实验 |
| 3.2.7 裸鼠皮下成瘤实验 |
| 3.2.8 免疫组织化学实验 |
| 3.3 实验结果 |
| 3.3.1 SIRT1 在结肠癌组织中的表达以及预后 |
| 3.3.2 Tenovin-6 对结肠癌细胞增殖能力的影响 |
| 3.3.3 Tenovin-6 对结肠癌细胞克隆形成能力的影响 |
| 3.4 分析与讨论 |
| 第4章 Tenovin-6 对结肠癌细胞周期和凋亡的影响 |
| 4.1 实验材料,仪器和试剂 |
| 4.1.1 实验材料 |
| 4.1.2 实验仪器及试剂 |
| 4.1.3 实验溶液配制 |
| 4.2 实验方法 |
| 4.2.1 细胞周期检测 |
| 4.2.2 Western blot实验 |
| 4.2.3 细胞凋亡检测 |
| 4.2.4 线粒体膜电位检测(JC-1 试剂) |
| 4.3 实验结果 |
| 4.3.1 Tenovin-6 对结肠癌细胞周期的影响 |
| 4.3.2 Tenovin-6 对结肠癌细胞凋亡的影响 |
| 4.4 分析和讨论 |
| 第5章 Tenovin-6 抑制结肠癌细胞的代谢水平 |
| 5.1 实验材料,仪器和试剂 |
| 5.1.1 实验材料 |
| 5.1.2 实验仪器和试剂 |
| 5.1.3 实验溶液配制 |
| 5.2 实验方法 |
| 5.2.1 荧光定量PCR实验 |
| 5.2.2 Western blot实验 |
| 5.2.3 ATP检测 |
| 5.2.4 葡萄糖吸收实验 |
| 5.2.5 提取质粒 |
| 5.2.6 瞬时转染 |
| 5.2.7 反转录 |
| 5.3 实验结果 |
| 5.3.1 Tenovin-6抑制细胞内能量代谢水平 |
| 5.3.2 Tenovin-6 引起的转录水平以及蛋白水平的变化 |
| 5.4 分析与讨论 |
| 第6章 Tenovin-6 抑制结肠癌细胞增殖的机制研究 |
| 6.1 实验材料,仪器和试剂 |
| 6.1.1 实验材料 |
| 6.1.2 实验仪器和试剂 |
| 6.1.3 实验溶液配制 |
| 6.2 实验方法 |
| 6.2.1 荧光定量PCR实验 |
| 6.2.2 Western blot实验 |
| 6.2.3 ATP检测 |
| 6.2.4 葡萄糖吸收实验 |
| 6.2.5 提取质粒 |
| 6.2.6 瞬时转染 |
| 6.2.7 反转录 |
| 6.3 实验结果 |
| 6.3.1 激活PGC-1α对结肠癌细胞增殖和代谢的影响 |
| 6.3.2 过表达PGC-1α对结肠癌细胞增殖和代谢的影响 |
| 6.3.3 Tenovin-6 对结肠癌体内成瘤能力的影响 |
| 6.4 分析和讨论 |
| 第7章 综合与讨论 |
| 参考文献 |
| 硕士在读期间发表的文章及参研课题情况 |
| 致谢 |
（2）苦豆碱通过调节miR-296-5p/STAT3轴抑制结直肠癌细胞的增殖和转移及其机制研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 前言 |
| 第一章 文献研究 |
| 祖国医学部分 |
| 1. 祖国医学对肿瘤的认识(历史沿革) |
| 2. 祖国医学对结直肠癌的认识 |
| 2.1 祖国医学对结直肠癌疾病的认识 |
| 2.2 祖国医学对结直肠癌病因病机的认识 |
| 2.3 祖国医学对结直肠癌证型的认识 |
| 2.4 祖国医学对结直肠癌辨病、辩证治疗的认识 |
| 2.5 祖国医药抗结直肠肿瘤的优势 |
| 2.6 中药治疗结直肠癌的研究进展 |
| 3. 中药苦豆子及其成分苦豆碱的研究进展 |
| 3.1 中药苦豆子的研究进展 |
| 3.2 苦豆碱的药理学作用及其机制研究进展 |
| 现代医学部分 |
| 1 现代医学对结直肠癌病因及机制的研究 |
| 1.1 结直肠癌分子标志物 |
| 1.2 结直肠癌相关信号通路 |
| 2 microRNAs与结直肠癌的研究进展 |
| 2.1 microRNAs与结直肠癌相关机制研究 |
| 2.2 microRNAs在结直肠癌临床应用 |
| 3 结直肠癌EMT的研究进展 |
| 第二章 实验研究 |
| 第一部分 ALO抑制结直肠癌细胞增殖 |
| 1. 实验材料 |
| 1.1 实验细胞株 |
| 1.2 实验主要试剂和耗材 |
| 1.3 实验主要仪器设备 |
| 1.4 实验常用试剂配制 |
| 2. 实验方法 |
| 2.1 细胞株的培养 |
| 2.2 ALO处理结直肠癌细胞 |
| 2.3 MTT实验 |
| 2.4 统计学方法 |
| 3. 结果 |
| 3.1 不同浓度ALO对不同结直肠癌细胞增殖的抑制作用 |
| 3.2 ALO对不同结直肠癌细胞的IC50 |
| 4. 总结 |
| 第二部分 ALO对miR-296-5p在结直肠癌细胞中表达的影响 |
| 1. 实验材料 |
| 1.1 实验细胞株 |
| 1.2 实验主要试剂和耗材 |
| 1.3 实验主要仪器设备 |
| 1.4 实验常用试剂配制 |
| 2. 实验方法 |
| 2.1 细胞培养 |
| 2.2 利用生物信息网站StarBasev3.0分析miR-296-5p的表达 |
| 2.3 qRT-PCR检测miR-296-5p在不同人结直肠癌细胞及人肠上皮细胞中的表达 |
| 2.4 qRT-PCR检测ALO处理后SW480和HCT116细胞miR-296-5p的表达 |
| 2.5 统计学方法 |
| 3. 结果 |
| 3.1 StarBasev3.0分析miR-296-5p的表达 |
| 3.2 qRT-PCR检测miR-296-5p在不同人结直肠癌细胞及人肠上皮细胞中的表达 |
| 3.3 qRT-PCR检测ALO处理后SW480和HCT116细胞miR-296-5p的表达 |
| 4. 总结 |
| 第三部分 STAT3和miR-296-5p存在结合位点 |
| 1. 实验材料 |
| 1.1 实验细胞株 |
| 1.2 实验主要试剂和耗材 |
| 1.3 实验主要仪器设备 |
| 1.4 实验常用试剂配制 |
| 2. 实验方法 |
| 2.1 结直肠癌细胞(SW480、HCT116)的培养 |
| 2.2 TargetScan V7.2靶基因预测 |
| 2.3 野生型(WT)和突变型(MUT)-STAT3 3'UTR片段设计和合成 |
| 2.4 质粒的建立、提取及鉴定 |
| 2.5 细胞转染 |
| 2.6 双荧光素酶报告基因分析 |
| 2.7 统计学方法 |
| 3. 结果 |
| 3.1 生物信息学网站TargetScan V7.2显示STAT3是miR-296-5p的靶基因 |
| 3.2 miR-296-5p mimics能够抑制STAT3-荧光素酶活性 |
| 3.3 miR-296-5p inhibitor增强STAT3-荧光素酶活性 |
| 4. 总结 |
| 第四部分 ALO和miR-296-5p对结直肠癌细胞STAT3表达的影响 |
| 1. 实验材料 |
| 1.1 实验细胞株 |
| 1.2 实验主要试剂和耗材 |
| 1.3 实验主要仪器设备 |
| 1.4 实验常用试剂配制 |
| 2. 实验方法 |
| 2.1 结直肠癌细胞(SW480、HCT116)的培养 |
| 2.2 细胞转染 |
| 2.3 ALO处理结直肠癌细胞 |
| 2.4 qRT-PCR实验 |
| 2.5 Western blot实验 |
| 2.6 统计学方法 |
| 3. 结果 |
| 3.1 qRT-PCR检测miR-296-5p mimics、STAT3过表达、ALO等不同处理后HCT116细胞中miR-296-5p的表达 |
| 3.2 qRT-PCR检测miR-296-5p inhibitor、siSTAT3、ALO等处理后SW480细胞中miR-296-5p的表达 |
| 3.3 Western blot检测miR-296-5p mimics、STAT3过表达、ALO等处理后HCT116细胞中STAT3的表达 |
| 3.4 Western blot检测miR-296-5p inhibitor、siSTAT3、ALO等不同处理后SW480细胞STAT3的表达 |
| 4. 总结 |
| 第五部分 ALO通过调节miR-296-5p/STAT3通路调控结直肠癌细胞增殖和凋亡 |
| 1. 实验材料 |
| 1.1 实验细胞株 |
| 1.2 实验主要试剂和耗材 |
| 1.3 实验主要仪器设备 |
| 1.4 实验常用试剂配制 |
| 2. 实验方法 |
| 2.1 结直肠癌细胞(SW480、HCT116)的培养 |
| 2.2 细胞转染 |
| 2.3 细胞克隆形成实验(Clone formation assay) |
| 2.4 细胞凋亡检测(Cell apoptosis detection) |
| 2.5 Western-blot检测细胞凋亡相关蛋白 |
| 2.6 统计学方法 |
| 3. 结果 |
| 3.1 克隆形成实验验证ALO通过调节miR-296-5p/STAT3通路调控HCT116细胞增殖 |
| 3.2 克隆形成实验验证ALO通过调节miR-296-5p/STAT3通路调控SW480细胞增殖 |
| 3.3 细胞凋亡实验验证ALO通过调节miR-296-5p/STAT3通路调控HCT116细胞凋亡 |
| 3.4 细胞凋亡实验验证ALO通过调节miR-296-5p/STAT3通路调控SW480细胞增殖 |
| 3.5 HCT116细胞凋亡相关蛋白的检测 |
| 3.6 SW480细胞凋亡相关蛋白的检测 |
| 4. 总结 |
| 第六部分 ALO通过调节miR-296-5p/STAT3通路调控结直肠癌细胞迁移和侵袭 |
| 1. 实验材料 |
| 1.1 实验细胞株 |
| 1.2 实验主要试剂和耗材 |
| 1.3 实验主要仪器设备 |
| 1.4 实验常用试剂配制 |
| 2. 实验方法 |
| 2.1 结直肠癌细胞(SW480、HCT116)的培养 |
| 2.2 细胞转染 |
| 2.3 划痕愈合实验 |
| 2.4 Transwell细胞侵袭实验 |
| 3. 结果 |
| 3.1 划痕愈合实验验证ALO通过调节miR-296-5p/STAT3通路调控HCT116细胞迁移 |
| 3.2 划痕愈合实验验证ALO通过调节miR-296-5p/STAT3通路调控SW480细胞迁移 |
| 3.3 Transwell细胞侵袭实验验证ALO通过调节miR-296-5p/STAT3通路调控HCT116细胞侵袭 |
| 3.4 Transwell细胞侵袭实验验证ALO通过调节miR-296-5p/STAT3通路调控SW480细胞侵袭 |
| 4. 总结 |
| 第七部分 ALO通过调节miR-296-5p/STAT3通路调控EMT相关蛋白的表达 |
| 1. 实验材料 |
| 1.1 实验细胞株 |
| 1.2 实验主要试剂和耗材 |
| 1.3 实验主要仪器设备 |
| 1.4 实验常用试剂配制 |
| 2. 实验方法 |
| 2.1 结直肠癌细胞(SW480、 HCT116)的培养 |
| 2.2 细胞转染 |
| 2.3 Western blot实验 |
| 3. 结果 |
| 3.1 Western blot检测HCT116细胞EMT相关蛋白N-cadherin(N-cad)和E-cadherin(E-cad)的表达 |
| 3.2 Western blot检测SW480细胞EMT相关蛋白N-cadherin (N-cad)和E-cadherin (E-cad)的表达 |
| 4. 总结 |
| 第三章 讨论 |
| 参考文献 |
| 攻读博士学位期间取得的研究成果 |
| 致谢 |
| 作者简介 |
（3）Wnt6对结肠癌发生和发展的影响（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| Abstract |
| 英文缩略词表 |
| 引言 |
| 第一部分 结肠癌组织Wnt6的表达量 |
| 前言 |
| 材料 |
| 方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 结论 |
| 第二部分 shRNA干扰和过表达Wnt 6载体的构建和结肠癌细胞系的选择 |
| 前言 |
| 材料 |
| 方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 结论 |
| 第三部分 Wnt6对HCT116和SW480两种结肠癌细胞系生长的影响 |
| 前言 |
| 材料 |
| 方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 结论 |
| 全文总结 |
| 参考文献 |
| 综述 |
| 参考文献 |
| 攻博期间发表的论文 |
| 致谢 |
（4）芒柄花黄素对结肠癌影响及机制的实验研究（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| 英文摘要 |
| 英文缩写 |
| 引言 |
| 第一部分 芒柄花黄素对结肠癌细胞SW1116和HCT116生长、增殖及侵袭影响的研究 |
| 前言 |
| 材料与方法 |
| 结果 |
| 附图 |
| 附表 |
| 讨论 |
| 小结 |
| 参考文献 |
| 第二部分 芒柄花黄素对结肠癌细胞作用机制研究 |
| 前言 |
| 材料与方法 |
| 结果 |
| 附图 |
| 附表 |
| 讨论 |
| 小结 |
| 参考文献 |
| 第三部分 芒柄花黄素对裸鼠结肠癌移植瘤生长的影响及机制研究 |
| 前言 |
| 材料与方法 |
| 结果 |
| 附图 |
| 附表 |
| 讨论 |
| 小结 |
| 参考文献 |
| 结论 |
| 综述 天然化合物在结直肠癌治疗中的应用 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 个人简历 |
（5）PTEN调控p66shc表达影响结肠癌侵袭转移的机制研究（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| 英文摘要 |
| 英文缩略语注释 |
| 引言 |
| 第一部分 PTEN、p66shc基因在结肠癌中的表达及其调控关系研究 |
| 实验材料 |
| 实验方法 |
| 统计学分析 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 结论 |
| 附图表 |
| 第二部分 PTEN基因通过p66shc调控结肠癌细胞侵袭和转移研究 |
| 实验材料 |
| 实验方法 |
| 统计学分析 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 结论 |
| 附图 |
| 第三部分 PTEN调控p66shc转录的机制研究 |
| 实验材料 |
| 实验方法 |
| 统计学分析 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 结论 |
| 附图表 |
| 参考文献 |
| 综述一 |
| 参考文献 |
| 综述二 |
| 参考文献 |
| 攻博期间科研成果 |
| 致谢 |
（6）沉默Musashi1基因对结肠癌细胞生物学特性及放疗敏感性的影响（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| 英文摘要 |
| 英文缩写 |
| 引言 |
| 第一部分 结肠癌组织和细胞中Musashi1蛋白表达及Musashi1稳定低表达结肠癌细胞系构建 |
| 前言 |
| 材料与方法 |
| 结果 |
| 附图 |
| 讨论 |
| 小结 |
| 参考文献 |
| 第二部分 沉默Musashi1对结肠癌HCT116细胞生物学特性的影响 |
| 前言 |
| 材料与方法 |
| 结果 |
| 附图 |
| 讨论 |
| 小结 |
| 参考文献 |
| 第三部分 沉默Musashi1对结肠癌HCT116细胞生长抑制的分子机制 |
| 前言 |
| 材料与方法 |
| 结果 |
| 附图 |
| 讨论 |
| 小结 |
| 参考文献 |
| 第四部分 沉默Musashi1对结肠癌HCT116细胞放疗敏感性的影响 |
| 前言 |
| 材料与方法 |
| 结果 |
| 附图 |
| 附表 |
| 讨论 |
| 小结 |
| 参考文献 |
| 结论 |
| 综述一 RNA结合蛋白Musashi1与肠上皮细胞更新和结肠癌 |
| 参考文献 |
| 综述二 结直肠癌干细胞表面标志物和信号通路研究进展 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 个人简历 |
（7）CCND1在结肠癌中受microRNA-340调控而增加细胞对5-Fu的耐药（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 前言 |
| 第一章 CCND1在结肠癌组织中的表达情况鉴定 |
| 1 材料与方法 |
| 2 结果 |
| 3 小结和讨论 |
| 第二章 干扰CCND1可增加结肠癌细胞对5-Fu的敏感性 |
| 1 材料、方法 |
| 2 结果 |
| 3 小结和讨论 |
| 第三章 miR-340对结肠癌细胞株5-Fu耐药的影响 |
| 1 资料与方法 |
| 2 结果 |
| 3 小结和讨论 |
| 第四章 miR340可直接靶向CCND1 |
| 1 材料与方法 |
| 2 结果 |
| 3 讨论 |
| References |
| 文献综述 |
| 参考文献 |
| 缩写词简表 |
| 成果 |
| 致谢 |
（8）NF-κB介导的Rab27A表达上调促进结肠癌干细胞的干性（论文提纲范文）
| 缩略语表 |
| 中文摘要 |
| Abstract |
| 前言 |
| 文献回顾 |
| 1 结肠和结肠癌 |
| 1.1 结肠组织结构和结肠干细胞 |
| 1.2 肠上皮分化发育调节 |
| 1.3 结肠癌 |
| 1.3.1 结肠癌的发病率 |
| 1.3.2 结肠癌的分子异常 |
| 1.3.3 炎症微环境与结肠癌 |
| 2 肿瘤干细胞 |
| 2.1 肿瘤干细胞生物学特性 |
| 2.2 肿瘤干细胞的起源 |
| 2.2.1 成体干细胞来源 |
| 2.2.2 定向祖细胞的转化 |
| 2.3 肿瘤干细胞表面标志分子 |
| 2.4 肿瘤干细胞的分离鉴定 |
| 2.4.1 肿瘤干细胞的分选 |
| 2.4.2 肿瘤干细胞的鉴定 |
| 2.5 肿瘤干细胞的信号转导通路 |
| 2.5.1 Wnt信号通路 |
| 2.5.2 Notch信号通路 |
| 2.5.3 Hedgehog信号通路 |
| 2.5.4 TGFβ/BMP信号通路 |
| 2.5.5 PTEN |
| 2.5.6 JAK-STAT信号通路 |
| 2.5.7 NF-κB和STAT3信号通路 |
| 2.6 肿瘤干细胞微环境 |
| 2.6.1 缺氧微环境 |
| 2.6.2 血管微环境 |
| 2.6.3 炎性微环境 |
| 2.7 肿瘤干细胞治疗 |
| 2.8 肿瘤干细胞研究中存在的问题及展望 |
| 3 结肠癌干细胞 |
| 3.1 结肠癌干细胞标志分子 |
| 3.2 结肠癌干细胞分子异常 |
| 3.3 肿瘤微环境与肿瘤干细胞的异质性 |
| 3.4 炎症微环境与结肠癌干细胞 |
| 4 Rab蛋白家族 |
| 4.1 Rab蛋白家族简介 |
| 4.2 Rab GTPase活性调节 |
| 4.3 Rab蛋白与囊泡定位的关系 |
| 4.4 Rab蛋白与疾病的关系 |
| 4.5 Rab蛋白与肿瘤的关系 |
| 5 Rab27A |
| 5.1 Rab27A蛋白简介 |
| 5.2 Rab27A蛋白与疾病 |
| 5.3 Rab27A蛋白与肿瘤 |
| 实验一 Rab27A在结肠癌和结肠癌干细胞中的表达变化 |
| 引言 |
| 1 材料 |
| 1.1 实验材料 |
| 1.2 主要试剂 |
| 1.3 主要仪器 |
| 2 方法 |
| 2.1 免疫组化染色 |
| 2.2 细胞培养 |
| 2.3 Real Time-PCR |
| 2.4 免疫印迹 |
| 2.5 免疫荧光染色和流式细胞术（FCM）分析 |
| 2.6 PKH26染色和流式检测 |
| 3 结果 |
| 3.1 Rab27A在人结肠癌组织和细胞系中的差异表达 |
| 3.2 6 株不同结肠癌细胞系干性分析 |
| 3.3 HT29结肠癌干细胞干性分析 |
| 3.4 HT29结肠癌传代干细胞干性分析 |
| 3.5 Rab27A在HT29结肠癌干细胞中的表达变化 |
| 4 讨论 |
| 实验二 Rab27A表达异常对结肠肿瘤干细胞干性的影响 |
| 引言 |
| 1 材料 |
| 1.1 实验材料 |
| 1.2 主要试剂 |
| 1.3 主要仪器 |
| 2 方法 |
| 2.1 载体构建 |
| 2.2 慢病毒包装 |
| 2.3 慢病毒感染和稳转细胞系的建立 |
| 2.4 细胞周期检测 |
| 2.5 PKH26染色和检测 |
| 2.6 si RNA转染 |
| 3 结果 |
| 3.1 Rab27A促进结肠癌干细胞球体的形成数目和体积 |
| 3.2 Rab27A促进结肠癌传代干细胞的增殖 |
| 3.3 Rab27A增加结肠癌细胞中CD44+细胞比例 |
| 3.4 Rab27A增加结肠癌细胞中PKH26high细胞比例 |
| 3.5 Rab27A提高结肠癌干细胞中S期细胞比例 |
| 4 讨论 |
| 实验三 Rab27A表达异常对结肠癌干细胞的细胞因子分泌的影响 |
| 引言 |
| 1 材料 |
| 1.1 实验材料 |
| 1.2 主要试剂 |
| 2 方法 |
| 2.1 载体构建 |
| 2.2 结肠癌干细胞条件培养 |
| 2.3 ELISA |
| 3 结果 |
| 3.1 Rab27A过表达sphere培养上清促进结肠癌干细胞的增殖 |
| 3.2 Rab27A促进结肠癌干细胞VEGF和TGF-β 的分泌 |
| 3.3 Rab27A在结肠癌HT29细胞中的定位 |
| 3.4 Rab27A与结肠肿瘤干细胞的定位 |
| 4 讨论 |
| 实验四 Rab27A表达异常对结肠肿瘤干细胞在免疫缺陷小鼠体内生长的影响 |
| 引言 |
| 1 材料 |
| 1.1 实验材料 |
| 1.2 主要试剂 |
| 1.3 主要仪器 |
| 2 方法 |
| 2.1 HT29结肠癌荷瘤小鼠模型的建立 |
| 2.2 生物标本的制备 |
| 2.3 CD31免疫组化染色及血管计数 |
| 3 结果 |
| 3.1 Rab27A促进结肠癌肿瘤干细胞在裸鼠体内的生长 |
| 3.2 Rab27A促进结肠癌肿瘤血管生成 |
| 4 讨论 |
| 实验五 Rab27A的表达受转录因子NF-κB调控 |
| 引言 |
| 1 材料 |
| 1.1 实验材料 |
| 1.2 主要试剂 |
| 1.3 主要仪器 |
| 2 方法 |
| 2.1 载体构建 |
| 2.2 NF-κB双荧光素酶报告系统 |
| 2.3 Rab27A启动子双荧光素酶报告系统 |
| 3 结果 |
| 3.1 HT29结肠癌干细胞中NF-κB信号通路活性升高 |
| 3.2 p65上调Rab27A的表达 |
| 3.3 p65调控Rab27A启动子转录活性 |
| 3.4 TNFα 促进HT29结肠肿瘤干细胞的生长 |
| 3.5 TNFα 促进HT29结肠肿瘤干细胞的干性 |
| 3.6 TNFα 介导的NF-κB信号通路活化使Rab27A表达升高 |
| 4 讨论 |
| 小结 |
| 参考文献 |
| 附件 |
| 致谢 |
（9）E2F-1启动子并表达IL-15溶瘤腺病毒联合免疫细胞治疗结直肠癌的实验研究（论文提纲范文）
| 缩略词表 |
| 中文摘要 |
| Abstract |
| 前言 |
| 参考文献 |
| 第一章 E2F-1 在胃肠道肿瘤中表达情况 |
| 一、引言 |
| 二、材料和方法 |
| 三、结果 |
| 四、讨论 |
| 五、小结 |
| 参考文献 |
| 第二章 溶瘤腺病毒 Ad-E2F 和 Ad-E2F/IL15 的构建 |
| 一、 引言 |
| 二、材料和方法 |
| 三、结果 |
| 四、讨论 |
| 五、小结 |
| 参考文献 |
| 第三章 多种过继免疫细胞的制备 |
| 一、引言 |
| 二、材料和方法 |
| 三、结果 |
| 四、讨论 |
| 五、小结 |
| 参考文献 |
| 第四章 溶瘤腺病毒 Ad-E2F 联合 CIK 细胞治疗直肠癌的实验研究 |
| 一、引言 |
| 二、材料和方法 |
| 三、结果 |
| 四、讨论 |
| 五、小结 |
| 参考文献 |
| 第五章 溶瘤腺病毒 Ad-E2F/IL15 联合 CTL 细胞治疗结肠癌实验研究 |
| 一、引言 |
| 二、材料和方法 |
| 三、结果 |
| 四、讨论 |
| 五、小结 |
| 参考文献 |
| 全文结论 |
| 文献综述 |
| 参考文献 |
| 攻读学位期间发表文章情况 |
| 致谢 |
（10）AIF、P27与结肠癌细胞凋亡的关系及相关性探讨（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 前言 |
| 材料与方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 英汉缩略词对照表 |
| 致谢 |
| 综述 |
| 参考文献 |
四、人突变p27重组腺病毒的构建及其在结肠癌细胞SW480中的表达（论文参考文献）
- [1]Tenovin-6抑制结肠癌细胞增殖的作用及机制研究[D]. 谭丽. 西南大学, 2021(01)
- [2]苦豆碱通过调节miR-296-5p/STAT3轴抑制结直肠癌细胞的增殖和转移及其机制研究[D]. 韩玮. 南京中医药大学, 2021(01)
- [3]Wnt6对结肠癌发生和发展的影响[D]. 郑晓丽. 武汉大学, 2018(01)
- [4]芒柄花黄素对结肠癌影响及机制的实验研究[D]. 王爱磊. 河北医科大学, 2018(12)
- [5]PTEN调控p66shc表达影响结肠癌侵袭转移的机制研究[D]. 王政强. 武汉大学, 2017(06)
- [6]沉默Musashi1基因对结肠癌细胞生物学特性及放疗敏感性的影响[D]. 高超. 河北医科大学, 2016(08)
- [7]CCND1在结肠癌中受microRNA-340调控而增加细胞对5-Fu的耐药[D]. 姜靖雯. 南方医科大学, 2016(02)
- [8]NF-κB介导的Rab27A表达上调促进结肠癌干细胞的干性[D]. 冯飞雪. 第四军医大学, 2014(08)
- [9]E2F-1启动子并表达IL-15溶瘤腺病毒联合免疫细胞治疗结直肠癌的实验研究[D]. 晏阳. 中国人民解放军医学院, 2014(03)
- [10]AIF、P27与结肠癌细胞凋亡的关系及相关性探讨[D]. 赵正飞. 泸州医学院, 2014(03)