论文摘要
目的本研究将LMP1与人IL-2基因融合后构建重组质粒,并将构建的重组质粒载体通过电转导入感受态卡介苗（BCG）,获得能够稳定表达融合蛋白的重组BCG（rBCG）,通过对构建的EB病毒阳性鼻咽癌动物模型肿瘤生长的抑制情况检测rBCG的免疫效果,为研发既能抗结核病又能对EB病毒阳性肿瘤产生免疫的双价疫苗奠定了基础。方法从EB病毒阳性的B95-8细胞中提取总RNA,通过RT-PCR获得cDNA,以此为模板扩增获得LMP1,以IL-2 pMalLP质粒为模板扩增获得IL-2,利用重叠PCR（overlap-PCR）将两段基因进行融合获得融合基因,将酶切后的融合基因与酶切的穿梭表达质粒pMV261进行连接,对获得的重组质粒进行酶切、PCR、测序鉴定,将鉴定正确的重组质粒通过电转导入BCG感受态细胞。通过温度诱导促进融合基因的表达,利用western-blot检测目的蛋白的表达。构建EB病毒阳性鼻咽癌动物模型,利用获得的rBCG对实验动物进行免疫,定期测量肿瘤组织长径和短径并计算其体积。一段时间后将实验动物处死,获取肿瘤组织,称重并计算肿瘤组织抑制率,HE染色观察炎性细胞浸润情况。结果从B95-8细胞中提取的总RNA经琼脂糖凝胶电泳检测条带清晰,明暗分明,质量较好,利用PT-PCR获得了LMP1全长cDNA,并以cDNA为模板设计特引物扩增获得了1225 bp的LMP1。以含目的基因IL-2的质粒为模板扩增获得453 bp IL-2,利用overlap-PCR扩增获得1623bp IL-2-LMP1融合基因。将融合基因连接到质粒pMV261,经筛选、克隆后进行PCR、酶切、测序鉴定。PCR扩增获得1600bp左右的片段,与融合基因大小基本一致,酶切获得1600bp与4500bp左右两条片段,大小与预期一致,测序结果显示该融合基因序列与已知序列一致性为100%。利用电转仪将构建好的重组质粒导入BCG感受态细胞,经温度诱导后利用western-blot可以检测到外源基因融合蛋白的表达。在动物实验中rBCG组、BCG组、PBS组成瘤时间无明显差异,各组肿瘤体积无明显差异。免疫接种后同一时间rBCG组肿瘤体积小于PBS组和BCG组,BCG组小于PBS组。rBCG组平均瘤重小于BCG组、PBS组,BCG组与PBS组之间无明显差异,rBCG组肿瘤抑制率38.00%高于BCG组11.91%。肿瘤组织HE染色结果显示,rBCG组肿瘤组织有明显的淋巴细胞、中性粒细胞浸润。结论构建获得了pMV261-IL-2-LMP1重组质粒,并成功将重组质粒导入BCG,获得了能够稳定表达融合蛋白的rBCG,构建的rBCG对EB病毒阳性鼻咽癌肿瘤具有抑制作用。
论文目录
文章来源
类型: 硕士论文
作者: 裴杰
导师: 陈廷,薛庆节
关键词: 病毒,肿瘤免疫,疫苗
来源: 济南大学
年度: 2019
分类: 基础科学,医药卫生科技
专业: 生物学,基础医学
单位: 济南大学
分类号: R392
总页数: 69
文件大小: 3388K
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相关论文文献
- [1].人IL-2与EB病毒LMP1融合基因重组BCG的构建与表达[J]. 中国病原生物学杂志 2018(12)