基于纳米材料质谱法对人乳头瘤状病毒分型及检测方法研究

论文摘要

宫颈癌是全球女性中第四大常见的癌症,已有研究表明持续性感染高危型人乳头瘤状病毒（HPV）病毒是宫颈病变的必要条件。早期感染HPV不会产生任何症状,这是因为HPV L1蛋白是保护性抗原,可激发人自身的免疫系统而清除病毒,又因为HPV L1蛋白是晚期产生的蛋白,主要存在病毒复制期,所以检测HPV L1蛋白能反应患者的免疫状态和HPV DNA是否整合到宿主基因组,从而判断病情发展趋势以及是否能引起恶性病变。不同宫颈癌变的级别与HPV感染型别存在一定差异,人们常常根据患者携带病毒的量来辨别病情,预测宫颈恶性病变的风险,因此当已经确证持续感染HPV后,我们既要根据感染HPV的型别,又要根据患者携带病毒的量,来评判和预测与HPV病毒有关疾病的发展趋势,做到早预防早治疗,降低发病率和死亡率。综上HPV分型检测对早期宫颈癌的筛查起着重要作用,而检测HPV L1蛋白对宫颈疾病发展趋势的预测和HPV感染治疗的预后都具有很大的参考意义,二者结合起来对临床诊断更具实用价值。同时进行HPV分型和HPV L1蛋白检测可弥补彼此的缺点,临床上可极大降低漏诊误诊率,提高恶性病变诊断和预测的准确性,最大程度减少患者的损失。本论文基于纳米材料特性采用基质辅助激光解吸飞行时间质谱（MALDI TOF MS）建立高危HPV16、18分型检测方法及HPV16 L1蛋白检测方法,方法具有较高的灵敏度,并且分析速度快,经济高效,应用于临床样本的检测取得良好的结果。1.通过1-（3-二甲氨基丙基）-3-乙基碳二亚胺盐酸盐（EDC）偶联反应成功将精胺（SP）修饰到纳米金刚石（NDs）上。通过比较修饰后100 nm和5 nm两种纳米金刚石,发现5 nm的纳米金刚石具有更大的比表面积,修饰效果较好。SP-NDs由于表面覆有大量精胺,精胺在酸性条件显现多胺的特性可带正电,可以通过静电有效地吸引带负电荷的DNA磷酸骨架,研究发现SP-NDs对寡核苷酸具有优异的吸附效果（184 mg/g）,研究还发现SP-NDs不仅可以在稀溶液中提取和富集寡核苷酸,而且可以从复杂基体中,如十二烷基苯磺酸钠和尿素溶液中提取寡核苷酸,是寡核苷酸的优异固体吸附剂。2.聚合酶链式反应（PCR）产物直接用MALDITOF MS检测受限于两个方面,一是寡核苷酸的分子量太大MALDI检测不到,二是PCR缓冲溶液中含有酶和盐,抑制寡核苷酸的电离,需要复杂的除盐纯化过程。针对第一个问题,我们采用巢式PCR扩增嵌入内切酶位点,通过限制性内切酶酶切成短的寡核苷酸片段,每种HPV型别可酶切出六种不同小分子量的DNA片段,这不但能让MALDI检测到而且对检测结果的分析判断增加了可靠性。针对第二个问题,我们采用第一章合成的纳米材料SP-NDs提取酶切的HPV六种小分子量DNA片段,我们研究发现,SP-NDs不仅可以直接从PCR酶切产物中提取寡核苷酸,还可以从聚合酶链式反应-限制性片段质量多态性（PCR-RFMP）的酶消化产物中选择性地提取HPV特异性DNA片段,提取后的基因片段用MALDI TOF MS检测可区别HPV的型别,该方法成功地应用于临床样品分析并取得了良好的结果。SP-NDs作为固相吸附剂,用于MALDI分析前提取纯化寡核苷酸,替代电泳或液相色谱的纯化方法,避免了传统的纯化步骤,简化了分析过程且提高了灵敏度。基于PCR-RFMP方法,用SP-NDs富集、提取和分离寡核苷酸后,MALDI MS还能够分析DNA甲基化、单核苷酸多态性和其他病毒分型。3.基于金纳米颗粒（AuNPs）上的HPV16 L1核酸适配体（APTHPV16 L1）和质量标签（三聚氰胺）之间的非共价竞争吸附,建立了激光解吸电离质谱（LDI MS）检测HPV16 L1蛋白的新方法。在我们的设计中,APTHPV16 L1与三聚氰胺竞争占据AuNPs表面的非共价作用位点,当APTHPV16 L1存在时,会优先占据AuNPs表面的非共价作用位点,检测不到AuNPs表面存在三聚氰胺。随着HPV16 L1蛋白的加入,HPV16 L1蛋白与APTHPV16 L1之间存在特异性更强的相互作用,导致APTHPV16 L1从AuNPs的表面脱落,暴露出的反应位点被三聚氰胺所占据,经离心洗涤后采用LDI-TOF MS直接检测三聚氰胺信号,AuNPs表面三聚氰胺的质谱信号强弱反映了HPV16 L1蛋白含量的多少。采用内标法定量,HPV16 L1蛋白在2～80 ng/mL的范围内成线性关系,相关系数0.998,检出限（LOD=3SD空白/斜率）为58.8 pg/mL,该方法成功用于检测临床和疫苗样本中HPV16 L1蛋白,具有高灵敏度、高通量的优点,有望应用于宫颈癌的早期临床诊断和预后情况的判断。4.在高盐条件下氧化石墨烯（GO）吸附核酸适配体增强了 GO胶体溶液的稳定性,当溶液中加入目标物HPV16 L1蛋白后,核酸适配体与目标物特异性结合并从GO表面脱离,暴露的GO在高盐下聚集,导致230 nm处溶液吸光度发生变化。我们发现,吸光度与HPV16 L1蛋白浓度的对数成线性关系,以此建立了紫外吸光光度法定量检测HPV16 L1蛋白的方法。本方法耗时短,灵敏度高,试剂消耗少,具有较好特异性,方法回收率在87%～102%,检出限可达2 pg/mL,仅用简单的紫外分光光度计即可检测HPV16 L1蛋白浓度,其对临床样本的检测结果与用酶联免疫吸附测定（ELISA）以及第四章所述方法的检测结果完全一致。该研究的创新点是不用荧光标记的核酸适体,从而避免了荧光的漂白。我们根据GO本身的光学性质开发的灵敏、简单、快速、低成本的分析HPV16 L1蛋白方法,具有替代常规检测HPV16 L1蛋白方法的应用前景。

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摘要

Abstract

符号说明

第一章绪论

1.1 人乳头瘤状病毒（HPV）概述

1.1.1 人乳头瘤状病毒（HPV）结构

1.1.2 人乳头瘤状病毒（HPV）基因组与功能

1.1.3 HPV病毒分型

1.1.4 HPV与肿瘤的关系

1.1.5 HPV的致病机理

1.1.6 HPV病毒载量与宫颈癌的关系

1.1.7 HPV分型检测的意义

1.1.8 HPV L1蛋白检测的意义

1.1.9 HPV分型联合HPV L1蛋白检测的意义

1.1.10 HPV检测方法

1.1.10.1 细胞学检查

1.1.10.2 杂交捕获二代分析（HC2）

1.1.10.3 基于聚合酶链式反应（PCR）的检测方法

1.1.10.4 基因芯片技术

1.2 基质辅助激光解吸飞行时间质谱（MALDI TOF MS）

1.2.1 MALDI TOF MS基本原理

1.2.2 MALDI电离机理

1.2.3 MALDI TOF MS的应用

1.2.3.1 多肽与蛋白质分析

1.2.3.2 多磷酸化肽分析检测

1.2.3.3 寡核苷酸分析检测

1.2.3.4 MALDI定量分析

1.2.3.5 MALDI TOF MS对HPV检测

1.3 本论文研究的目的、意义和主要内容

1.3.1 本论文研究目的和意义

1.3.2 本论文研究内容

第二章高效富集寡核苷酸纳米材料的制备

2.1 引言

2.2 实验部分

2.2.1 试剂与仪器

2.2.2 精胺修饰纳米金刚石的制备

2.2.3 红外光谱和红外成像的表征

2.2.4 SP-NDs对寡核苷酸的吸附效果

2.2.5 SP-NDs富集稀溶液及复杂基质中的寡核苷酸

2.2.6 MADLI TOF MS分析

2.3 结果与讨论

2.3.1 SP-NDs的表征

2.3.2 SP-NDs对寡核苷酸的吸附

2.3.3 MALDI TOF MS分析稀溶液寡核苷酸

2.3.4 MALDI TOF MS分析复杂基体中的寡核苷酸

2.4 本章小结

第三章基于纳米材料高效富集质谱法对HPV病毒分型研究

3.1 引言

3.2 实验部分

3.2.1 试剂与仪器

3.2.2 HPV通用引物PCR扩增

3.2.3 巢式PCR-RFLP方法

3.2.4 临床样品DNA提取

3.2.5 MALDI TOF MS检测酶切产物

3.2.6 试剂盒检测临床样本

3.3 结果与讨论

3.3.1 HPV限制性片段长度多态性聚合酶链反应（PCR-RFMP）

3.3.2 MALDI TOF MS对HPV分型检测

3.3.3 临床样品验证结果

3.4 本章小结

第四章基于纳米金非共价键竞争吸附质谱法定量检测HPV16 L1蛋白

4.1 引言

4.2 实验部分

4.2.1 试剂与仪器

4.2.2 纳米金的合成

4.2.3 纳米金表征

4.2.4 纳米金聚集盐的浓度

4.2.5 HPV16 L1核酸适配体与AuNPs结合

4.2.5.1 溶液配制

4.2.5.2 pH值的影响

4.2.5.3 盐的影响

4.2.5.4 吸附时间

4.2.5.5 AuNPs与核酸适配体比例

4.2.5.6 HPV16 L1核酸适配体与AuNPs结合物稳定性

4.2.5.7 HPV16 L1核酸适配体与AuNPs结合物的表征

4.2.7 Mass Tag的筛选

4.2.7.1 确定Mass tag与AuNPs的亲和力

4.2.7.2 Mass Tag和HPV16 L1核酸适配体竞争吸附

4.2.8 HPV16 L1蛋白的检测

4.2.9 HPV16 L1蛋白的检测特异性

4.2.10 样本检测

4.2.10.1 标准曲线的建立

4.2.10.2 样本前处理和检测

4.2.11 方法学验证

4.2.11.1 方法重现性

4.2.11.2 方法回收率

4.2.12 酶联免疫（ELISA）试剂盒检测样本

4.3 结果与讨论

4.3.1 纳米金的表征

4.3.2 纳米金聚集盐的浓度

4.3.3 AuNPs吸附Aptamer条件

4.3.3.1 pH的影响

4.3.3.2 盐的影响

4.3.3.3 吸附时间的影响

4.3.3.4 AuNPs与核酸适配体比例

HPV16 L1稳定性研究'> 4.3.3.5 AuNPs-APT_{HPV16 L1}稳定性研究

4.3.4 HPV16 L1核酸适配体与AuNPs结合物的表征

4.3.5 质量标签（Tag）的筛选

4.3.6 MALDI TOF MS条件

4.3.6.1 检测模式

4.3.6.2 基质的选择

4.3.7 HPV16 L1蛋白的检测

4.3.8 方法分析表现

4.3.9 实际样品的定量分析

4.3.10 ELISA实验验证

4.4 本章小结

第五章基于氧化石墨烯和核酸适配体竞争吸附检测HPV 16 L1蛋白

5.1 引言

5.2 实验部分

5.2.1 试剂与仪器

5.2.2 离心时间

5.2.3 氯化钠浓度

5.2.4 HPV16 L1核酸适配体浓度

5.2.5 HPV16 L1蛋白检测

5.2.6 临床样本检测

5.2.7 特异性实验

5.2.8 基于核酸适配体与GO检测体系Zeta电势和颗粒尺寸分布研究

5.3 结果与讨论

5.3.1 离心时间的影响

5.3.2 氯化钠浓度的影响

5.3.3 HPV16 L1核酸适配体的浓度

5.3.4 HPV 16 L1蛋白检测

5.3.5 实际临床样本检测

5.3.6 回收率

5.3.7 特异性实验

5.3.8 GO/HPV 16 L1核酸适配体检测体系颗粒尺寸的分布研究

5.3.9 HPV 16 L1核酸适配体和GO检测体系Zeta电势分布

5.3.10 与第四章所建立的方法比较

5.4 本章小结

第六章结论与展望

参考文献

致谢

研究成果及发表的学术论文

作者和导师简介

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文章来源

类型: 博士论文

作者: 朱俐

导师: 王志华

关键词: 人乳头瘤状病毒,检测,纳米金刚石,精胺,基质辅助激光解析质谱,核酸适配体

来源: 北京化工大学

年度: 2019

分类: 工程科技Ⅰ辑,医药卫生科技

专业: 化学,妇产科学,肿瘤学

单位: 北京化工大学

分类号: R737.33;O657.63

DOI: 10.26939/d.cnki.gbhgu.2019.001802

总页数: 125

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