进化工程改造芽孢杆菌生产3-羟基丁酮

论文摘要

3-羟基丁酮是一种具有特殊的奶油香气的平台化学品,广泛应用于食品添加剂、制药和化工等领域。微生物发酵法生产3-羟基丁酮由于满足可持续发展理念而日益受到瞩目。多数芽孢杆菌作为一般认为安全的（GRAS）菌株具有天然合成3-羟基丁酮的代谢路径,但其产量由于菌株耐受性等因素的限制还不能达到工业化制备的要求。本研究通过结合进化工程策略和代谢工程方法,对解淀粉芽孢杆菌（Bacillus amyloliquefaciens）和枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）进行传统复合诱变、自主适应性进化,强化了3-羟基丁酮的耐受表型,提高了工程菌株3-羟基丁酮的生产性能。主要研究内容如下:1.高产3-羟基丁酮芽孢杆菌的传统突变选育。采用常压室温等离子体（ARTP）和60Coγ射线对B.amyloliquefaciens FMME088进行复合诱变,以3-羟基丁酮产量为分析指标,通过摇瓶水平的两轮筛选获得最优突变株B.amyloliquefaciens H-5,3-羟基丁酮产量为68.2 g·L-1。为实现3-羟基丁酮的高效生产,进一步对此突变株进行5-L发酵罐水平的培养条件优化,并于30-L发酵罐上进行放大培养,最终3-羟基丁酮产量达85.2 g·L-1,较出发菌株B.amyloliquefaciens FMME088提高了26.8%。2.自主进化突变系统（AEMS）的设计与构建。首先,为了确定启动子PsrfA是否满足群体感应（quorum sensing,QS）的自诱导性能,在B.subtilis 168中表达了由PsrfA启动的增强型绿色荧光蛋白（EGFP）,其荧光表达强度随细胞生长状态的变化而变化,并在细胞生长至对数中后期（812 h）,OD600为1.02.2时表达显著增加。其次,为了提高启动子PsrfA的转录活性,使用保守序列TTGACA和TATAAT替换PsrfA的-35区和-10区,通过检测荧光表达强度发现,由-35区被替换的启动子PTH11启动的EGFP荧光强度提高了40%。另外,对PTH11的上游序列进行不同长度的截断,其中PJD15（-136+291）启动的EGFP荧光强度最大,提高了48%。第三,为了实现对启动子PJD15的精细调控以及减轻泄漏表达,将启动子PJD15和木糖操纵子相结合,设计了由细胞密度和木糖共同诱导的杂合启动子PsrfAxylOm。为了扩展其调控范围,结合由IPTG诱导的杂合启动子PgraclacO,构建了分层动态调控系统,并借助蛋白酶降解过程的SspB连接蛋白和ssrA标签,实现单一层级的自我调控和双层级间的转换调控。第四,以3-羟基丁酮的耐受性为检验指标,研究损伤修复基因（mutL、alkA、mutS和mutH）的缺失和重组修复基因（recA、ssbA、bstG、polY1）的过表达对B.subtilis 168在适应性进化中突变频率的影响。结果表明,双基因mutL、alkA敲除菌株B.subtilis HS114和双基因ssbA、bstG过表达菌株B.subtilis HS119突变频率较B.subtilis 168分别提高了14.6倍和26.5倍。因此,选择mutL和alkA作为高保真模块（HFM）,选择ssbA和bstG作为突变模块（MUM）。最后,将HFM和MUM与分层动态调控系统相结合,借助启动子PgraclacO调控HFM和PsrfAxylOm调控MUM,构建自主进化突变系统（AEMS）。3.自主进化突变系统（AEMS）的应用。首先,将AEMS应用于适应性进化筛选3-羟基丁酮耐受性表型,以60 g·L-1 3-羟基丁酮作为筛选压力,细胞存活率作为筛选指标,正突变率达到了44.8%,获得最优耐受性突变株HS013。其次,将AEMS应用于适应性进化筛选3-羟基丁酮高产菌株。在HS013中过表达3-羟基丁酮生物合成路径上的三个关键酶——6-磷酸果糖激酶（PFKA）、α-乙酰乳酸合成酶（ALS）和α-乙酰乳酸脱羧酶（ALDC）,获得重组菌株B.subtilis HS014。在此基础上,利用AEMS对HS014进行适应性进化,以3-羟基丁酮产量作为筛选指标,筛选获得最优突变株B.subtilis HS016,3-羟基丁酮产量达到64.5 g·L-1。再次在HS016中,进一步过表达正向调控3-羟基丁酮合成的转录调控子CcpA和AlsR,并利用AEMS进行自主进化,筛选获得3-羟基丁酮高产菌株B.subtilis HS019,3-羟基丁酮产量达到76.3 g·L-1。最后,在5-L发酵罐中对突变株HS019进行分批补料培养,3-羟基丁酮的产量、产率和生产强度分别为69.2 g·L-1、0.39 g·g-1和1.33 g·（L·h）-1。另外,将HS019进行30-L发酵罐的扩大培养,3-羟基丁酮的产量、产率和生产强度分别达到82.5 g·L-1,0.46 g·g-1和1.59 g·（L·h）-1,与5-L发酵罐水平相比,分别增加了19.2%,17.5%和19.3%。

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第一章绪论

1.1 3-羟基丁酮概况

1.1.1 3-羟基丁酮的理化性质

1.1.2 3-羟基丁酮的应用领域

1.2 微生物生产3-羟基丁酮的改造策略

1.2.1 3-羟基丁酮的生化工程策略

1.2.2 3-羟基丁酮的代谢工程策略

1.3 优良表型选育的进化工程策略

1.3.1 传统诱变育种策略

1.3.2 适应性进化育种策略

1.3.3 基因组进化育种策略

1.4 本研究的目的与意义

1.5 本论文的研究内容

第二章材料和方法

2.1 菌株和质粒

2.2 仪器与试剂

2.2.1 仪器

2.2.2 试剂

2.2.3 培养基

2.3 培养条件

60Coγ 射线复合诱变'> 2.4 ARTP和⁶⁰Coγ 射线复合诱变

2.4.1 菌悬液的制备

60Coγ 射线复合诱变方法'> 2.4.2 ARTP和⁶⁰Coγ 射线复合诱变方法

2.4.3 高产3-羟基丁酮芽孢杆菌突变株的筛选方法

2.4.4 遗传稳定性分析

2.5 分子生物学技术

2.5.1 细菌基因组DNA的提取

2.5.2 PCR反应及其产物回收

2.5.3 感受态细胞的制备与转化

2.5.4 质粒提取

2.5.5 基因敲除

2.6 杂合启动子PsrfAxylOm的构建

2.6.1 荧光蛋白的表达检测

srfA的理性改造'> 2.6.2 启动子P_srfA的理性改造

2.6.3 SDS-PAGE电泳检测方法

srfAxylO^m的构建方法'> 2.6.4 杂合启动子P_srfAxylO^m的构建方法

2.7 自主进化突变系统（AEMS）的构建

2.7.1 高保真模块（HFM）和突变模块（MUM）的表达

2.7.2 蛋白降解标签的融合

2.7.3 突变频率的检测

2.7.4 自主进化突变系统（AEMS）的评估

2.8 自主进化

2.8.1 3-羟基丁酮耐受性检验

2.8.2 3-羟基丁酮合成路径的构建

2.8.3 自主进化方法

2.8.4 细胞存活率检测

2.9 分析测定方法

2.9.1 细胞浓度检测

2.9.2 葡萄糖检测

2.9.3 高效液相色谱（HPLC）法检测3-羟基丁酮

第三章结果与讨论

3.1 高产3-羟基丁酮芽孢杆菌的传统突变选育

3.1.1 ARTP诱变筛选3-羟基丁酮高产菌株

60Coγ 射线诱变强化3-羟基丁酮产量'> 3.1.2⁶⁰Coγ 射线诱变强化3-羟基丁酮产量

3.1.3 突变株B.amyloliquefaciens H-5 发酵条件优化

3.1.4 突变株B.amyloliquefaciens H-530-L发酵罐扩大培养

3.1.5 小结

3.2 自主进化突变系统（AEMS）的设计与构建

srfAxylO^m的设计与构建'> 3.2.1 杂合启动子P_srfAxylO^m的设计与构建

3.2.2 分层动态调控系统的设计与构建

3.2.3 自主进化突变模块基因的筛选

3.2.4 自主进化突变系统（AEMS）的构建

3.2.5 小结

3.3 自主进化突变系统（AEMS）的应用

3.3.1 自主进化突变系统（AEMS）强化3-羟基丁酮耐受性

3.3.2 自主进化突变系统（AEMS）提高3-羟基丁酮产量

3.3.3 高产菌株的扩大培养

3.3.4 小结

主要结论与展望

致谢

参考文献

附录：作者在攻读硕士学位期间发表的论文

文章来源

类型: 硕士论文

作者: 王诗卉

导师: 刘立明

关键词: 芽孢杆菌,羟基丁酮,自主进化突变系统,进化工程,代谢工程

来源: 江南大学

年度: 2019

分类: 基础科学,工程科技Ⅰ辑

专业: 生物学,一般化学工业

单位: 江南大学

分类号: TQ929

总页数: 62

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