导读:本文包含了紫杉醇生物合成论文开题报告文献综述、选题提纲参考文献及外文文献翻译，主要关键词:紫杉醇,生物,红豆杉,基因,生物学,细胞,途径。
紫杉醇生物合成论文文献综述
朱平[1]（2018）在《香菇糖基水解酶及其在紫杉醇生物合成研究中的应用》一文中研究指出紫杉醇(Taxol?,paclitaxel)于1966年首次分离自美国太平洋红豆杉(短叶红豆杉, Taxus brevifolia),1971年报道其结构,1992年被FDA批准上市。适应症:广泛用于治疗卵巢癌、乳腺癌、非小细胞肺癌、恶性黑色素瘤、大肠癌、淋巴瘤、脑瘤等十几种实体瘤。美国FDA于2007年批准其用于治疗类风湿性关节炎并可作为心脏冠状动脉药物洗脱支架涂层。抗肿瘤作用机制:促进微管蛋白聚合抑制其解聚,使细胞分裂停滞在G2/M期。近年来随着纳米等新剂型的应用,紫杉醇的疗效得到增加而毒、副作用则显着下降。在可预见的未来一段时间,紫杉醇仍将是重要的一线抗肿瘤药物。但是在紫杉醇开发初期即面临严峻的来源问题,由于紫杉醇的天然含量太低(约万分之二左右)且主要分布在树皮部位,从生长缓慢的野生红豆杉树皮中提取紫杉醇,破坏了红豆杉资源,因而相继被各国政府立法禁止。但面对市场的强大需求,世界各国也在寻求其他途径。目前,从苗圃栽培红豆杉中提取紫杉醇和以10-去乙酰巴卡亭III(10-DAB)为原料化学半合成紫杉醇是紫杉醇的两个主要来源。但在从红豆杉植物中提取紫杉醇时还会分离到大量紫杉醇类似物,其中,7-木糖-10-去乙酰紫杉醇(XDT)的含量异常地高,据文献报道,西藏红豆杉树皮中的XDT含量可高达0.5%,我国的南方红豆杉中XDT的含量也相对较高。与紫杉醇相比,XDT在C7位多了一个木糖基而在C10位少了一个乙酰基,因此,XDT去除木糖基再添加乙酰基后即生成紫杉醇。基于生物催化剂环境友好、反应条件温和、特异性强等优点,我们早期筛选到真菌香菇能够生物转化XDT为10-去乙酰紫杉醇(DT),但效率很低。我们采取活性跟踪手段从香菇中纯化到了目标蛋白,通过LC-MS/MS de Novo序列测定,获得5个寡肽序列。通过生物信息学分析预测了它们在目标蛋白上的相对位置,进而通过巢式PCR和RACE方法获得了2个全长c DNA(一致性97%以上)。比对分析结果显示它们属于糖基水解酶第叁家族。利用毕赤酵母系统进行了酶的表达与活性分析,发现LXYL-P1-1的活性低于LXYL-P1-2,两者都具有β-木糖苷酶和β-葡萄糖苷酶活性(双功能酶)且主要存在于重组酵母细胞内(利用分泌型表达载体亦如此)。利用LXYL-P1-2重组酵母冻干粉进行催化XDT为DT的研究,其催化效率远高于已有的报道。对工程酵母进行了如下高密度发酵条件优化:(1)升高罐压:从0.05 MPa提高到0.10 Mpa左右,省去向发酵罐补氧;(2)改进甲醇补加方式:Biomass-stat (本实验室新建方法);(3)进一步降低发酵液溶氧(DO):由5%降到1%;(4)进一步优化甲醇诱导时初始菌密度。放大试验从10 L、100 L到1吨发酵规模。优化后的重组细胞活性显着高于优化前,且1吨规模发酵罐的活性最高。利用优化前积累的LXYL-P1-2重组酵母冻干粉进行了生物催化优化与放大研究[优化后的条件:XDT或XDTex(XDT占71%):10或15 g/L,干细胞:80或128 g/L pH4.0;45?C;24 h;磁力搅拌]。反应体积2 m L与10 L的催化效率几无差异,底物投料10 g/L时转化率95%,底物投料15 g/L时转化率83%。上述研究为工业化酶法水解XDT进而半合成紫杉醇奠定了坚实的基础。紫杉醇的生物合成从GGPP开始至少有19步反应,其中由10-DAB到巴卡亭III(重要的中间体)是由10-DAB-10β-乙酰转移酶(DBAT)催化完成的。10-DAB与上述DT相比仅仅C13侧链不同。我们通过克隆和比较东北红豆杉(Taxus cuspidata)等6种红豆杉的DBAT活性,发现东北红豆杉与太平洋红豆杉的DBAT活性最高,而欧洲红豆杉(Taxus baccata)则几乎检测不到活性。但相同来源的DBAT催化10-DAB的效率是催化DT效率的900倍。我们通过同源模建、分子对接、丙氨酸扫描、半饱和突变等方法获得了催化DT的效率提高约6倍的双突变体DBATG38R/F301V。条件优化后与上述的LXYL-P1-2尝试了双酶促一锅法反应(one-pot reaction)。底物为XDT,反应体积分别为:1 m L、10 m L、50 m L;测得的紫杉醇产量分别为:657?g/mL、637?g/mL、635?g/mL。上述研究初步实现了由XDT起始全酶法合成紫杉醇,但酰基供体(乙酰辅酶A)来源、DBAT活性过低等成为需要克服的限制性因素。(本文来源于《中国菌物学会2018年学术年会论文汇编》期刊2018-08-11）
廖卫芳[2]（2018）在《紫杉醇生物合成相关P450羟化酶基因的挖掘及功能研究》一文中研究指出紫杉醇是临床上广泛使用的抗癌药物,主要从红豆杉植物中提取获得,但天然提取得到的紫杉醇远不能满足临床需求,寻求新的紫杉醇药源途径迫在眉睫,发展合成生物学技术是解决紫杉醇供需矛盾的重要途径。目前,紫杉醇生源路径中大部分酶的基因已被确认,但尚有母核上较多细胞色素P450羟化酶基因及其功能未被确认,尤其是母核上C1、C4和C9位对应的细胞色素P450羟化酶基因尚未发现,这是目前研究紫杉醇合成生物学技术的热点和难点。本课题基于中国红豆杉转录组数据,对红豆杉CYP450基因进行系统鉴定,通过功能注释及表达差异分析,挖掘紫杉醇生物合成相关的新的羟化酶候选基因,并通过基因克隆及功能研究进行候选基因的确认。取得的主要研究结果如下:1)中国红豆杉CYP450基因的系统鉴定基于中国红豆杉转录组数据,发现了118个全长和175个非全长的中国红豆杉CYP450基因。其中,除了5个基因(TcCYP725A1,TcCYP725A2,TcCYP725A4,TcCYP725A5,TcCYP725A6)被报道,以及另一个TcCYP725A3与已知的东北红豆杉的CYP725A3同源性达99%外,绝大多数CYP450基因都由本文首次发现。获得的118个中国红豆杉全长CYP450经国际标准化分类和命名,被分为8个聚类(clan)和29个家族,同时被分为两个类别:A-type和non-A-type。其中,52个基因(44.1%)属于A-type(71 clan),归属于11个家族,剩下的66个基因(55.9%)为non-A-type,分属于18个家族和7个clan。其中,在non-A-type中还发现两个新的CYP450家族,即CYP864和CYP947。进化分析表明,中国红豆杉CYP450的遗传组成与裸子植物云杉较为一致,而与被子植物拟南芥、苜蓿等有较大差异。中国红豆杉CYP450s虽然高度分化成多个家族,但仍然有着结构上的保守特征,包括PFG element,PERF motif,K-helix region和I-helix region。2)紫杉醇生物合成相关CYP450羟化酶候选基因的筛选对鉴定到的118个全长中国红豆杉CYP450序列进行了功能注释。在Blast2Go中,这些CYP450s被划分为叁大类:细胞组分(cellular component)、生物过程(biological process)与分子功能(molecular function),又具体分为21个功能组。将这118个CYP450s序列提交至Swissport,Nt,Nr,COG,GO,KEGG数据库中,使用BLASTX程序进行比对,阈值设为E<1e~(-5)。结果表明,绝大多数CYP450s都得到了注释,其中有15个新的CYP725家族基因(从CYP725A9至CYP725A23)被注释到与紫杉醇生物合成相关。对中国红豆杉CYP450s的表达差异分析发现,注释得到的15个新的CYP725家族基因中,TcCYP725A9,TcCYP725A11,TcCYP725A16,TcCYP725A20,TcCYP725A22和TcCYP725A23这6个基因的表达规律与已知紫杉醇合成羟化酶基因的表达规律一致且与紫杉醇合成量呈正相关,是最可能的与紫杉醇生物合成相关的候选羟化酶基因。3)中国红豆杉TcCYP725A22和TcCYP725A23的克隆与酵母异源表达功能研究选取两个候选羟化酶基因TcCYP725A22和TcCYP725A23进行克隆,同时克隆了已知的紫杉烷C2位羟化酶基因T2αH作为阳性对照。选用高拷贝、诱导型酿酒酵母表达载体pESC-TRP将这叁个基因分别在WAT11中异源表达,Western blot结果表明,这几个目的蛋白均成功表达。为了鉴定出紫杉醇母核上未知的羟化酶,以具有多个潜在羟化位点的紫杉素作为底物,与C2位羟化酶T2αH、候选羟化酶TcCYP725A22和TcCYP725A23分别进行反应。反应产物的HPLC检测结果表明,T2αH可以对紫杉素进行转化,结果与文献报道一致。候选羟化酶TcCYP725A22对底物紫杉素表现出催化活性,依据质谱结果及反应底物紫杉素的分子结构,判断催化产物很有可能为添加了两个羟基的紫杉烷新衍生物,而TcCYP725A23对紫杉素未见有明显的催化活性。4)TcCYP725A22在中国红豆杉细胞体内的功能研究鉴于体外反应进行羟化酶功能探究体系中的紫杉烷底物难以获得,将具有潜在羟化功能的候选基因TcCYP725A22在中国红豆杉细胞中进行过表达,分析转基因细胞中紫杉烷类代谢物指纹图谱的变化情况,确定候选羟化酶基因的催化位点。结果发现,当TcCYP725A22基因过表达时,几个已知的紫杉醇合成相关的酶基因表达量也都有不同程度的上调;且细胞中各紫杉烷的含量普遍提高,其中H3T;decinnamoyl taxinine J;TC和TPT这4种物质的含量变化最为显着。综合分析这些物质的结构特点及酵母异源表达体外反应结果,可以判断TcCYP725A22最可能是一个新的C2位羟化酶基因。以上研究为进一步确定紫杉醇生物合成路径中的未知羟化酶奠定了基础,有助于完全解析紫杉醇生源途径,促进紫杉醇合成生物学技术的全面创立。(本文来源于《华中科技大学》期刊2018-05-01）
匡雪君,王彩霞,邹丽秋,李滢,孙超[3]（2016）在《紫杉醇生物合成途径及合成生物学研究进展》一文中研究指出紫杉醇是一种从红豆杉植物中提取的具有显着抗癌效果的萜类次生代谢产物。作为有效的抗癌药物,目前生产主要依赖于红豆杉,供求矛盾十分突出。近年来,利用合成生物学技术建立新的紫杉醇来源途径已成为研究热点。目前,紫杉醇合成途径基本框架已经确定;参与紫杉醇合成相关酶基因大部分已被克隆和鉴定;已经在大肠杆菌和酿酒酵母中异源合成了紫杉醇的前体物质紫杉烯和5α-羟基紫杉烯。该研究对紫杉醇生物合成途径及紫杉醇药物中间体在大肠杆菌和酿酒酵母工程细胞中的合成进展进行了综述,以期为生物合成紫杉醇进一步研究提供参考。(本文来源于《中国中药杂志》期刊2016年22期）
陈清浦,廖卫芳,付春华,赵春芳,余龙江[4]（2016）在《紫杉醇生物合成途径中羟化酶的研究进展》一文中研究指出紫杉醇是一种从红豆杉植物中提取的具有显着抗癌效果的萜类化合物,但在红豆杉中含量很低,难以满足日益增长的临床需求。近年来,利用合成生物学技术建立新的紫杉醇来源途径已成为研究热点。目前,紫杉醇合成相关酶基因大部分已被克隆和鉴定,但其中羟化酶基因的发现与应用仍是目前研究的热点和难点。本文对紫杉醇生物合成途径研究进展进行了综述,对其中羟化酶的克隆及功能研究体系进行了重点深入分析,最后探讨了本领域未来的研究方向并对其前景进行展望,以期为紫杉醇合成途径中未知羟化步骤的羟化酶基因克隆,以及利用合成生物学技术实现紫杉醇的大量生产提供依据。(本文来源于《生物工程学报》期刊2016年05期）
赵凯,宇璐,金昱言,马学玲,刘丹[5]（2016）在《内生真菌紫杉醇生物合成的研究现状与展望（英文）》一文中研究指出紫杉醇是重要的抗癌药物之一,已经证明其对多种癌症具有显着疗效。目前,人们主要是从红豆杉的树皮中提取、分离和纯化紫杉醇,但由于红豆杉为生长缓慢、散生、濒危的珍稀植物,且随着紫杉醇临床用途的不断拓宽,市场需求的稳定增长,单纯依靠从红豆杉树皮中提取紫杉醇已经无法满足日益增长的市场需求。为了解决紫杉醇的药源不足,科学家已把目光从红豆杉树分离提取紫杉醇转向了其他替代方法,如化学全合成、半合成、组织培养与细胞培养、微生物发酵法生产紫杉醇等。因此,了解内生真菌紫杉醇生物合成的分子基础和遗传调控机制,对解析内生真菌紫杉醇生物合成机制、构建高产紫杉醇基因工程菌株和早日实现内生真菌紫杉醇工业化生产具有重要的科学意义和现实意义。结合本课题组多年来的科研工作,概述了红豆杉细胞紫杉醇生物合成途径、内生真菌发酵生产紫杉醇的优势、产紫杉醇内生菌的分离研究现状和生物多样性及紫杉醇生物合成相关基因的研究现状。内生真菌生物发酵合成紫杉醇是可以无限生产、大量获取紫杉醇、解决紫杉醇药源短缺问题的很有前景的方法之一。(本文来源于《生物工程学报》期刊2016年08期）
张蒙[6]（2016）在《中国红豆杉中JA信号调控紫杉醇生物合成模式研究》一文中研究指出茉莉酸(Jasmonate,JA)是植物体中广泛存在并且具有高效调节作用的内源激素之一,尤其对萜类、生物碱类和黄酮类的次级代谢产物的生物合成具有重要的调控作用。但由于JA信号激素能够同时引起细胞凋亡等一系列副反应,从而限制了其实际应用。因此,通过阐释JA信号通路调控植物次级代谢产物的模式,并以此为基础构建转基因细胞系,不仅能够提高目标产物的含量,而且能够有效地避免副反应损害。紫杉醇是中国红豆杉体内一类重要的二萜类物质,对于治疗乳腺癌和卵巢癌具有良好的疗效。但是,由于其生物体内含量低且合成步骤复杂,从而严重制约了其商业化生产。本文对中国红豆杉中JA信号调控紫杉醇生物合成模式进行研究,以期为构建紫杉醇高产细胞系奠定基础。本文首先通过对中国红豆杉中紫杉醇合成酶基因启动子上的顺式作用元件进行克隆和分析,然后以关键的JA信号响应元件为诱饵,筛选与其相互作用的转录因子,从而阐明JA信号通路调控紫杉醇合成的下游模式。同时,鉴定中国红豆杉中的JA信号通路中的关键节点JAZ(Jasmonate-ZIM domain)和MYC2因子,以研究中国红豆杉中JA信号通路上游响应的调控方式及其与下游响应之间的相互作用。结合以上结果,从而能够阐明JA信号调控紫杉醇生物合成的模式。取得的主要结果如下:(1)JA调控紫杉醇合成模式中的的靶点筛选。对TASY,T5H,T10H,T13H,TAT和T7H 6个紫杉醇合成酶基因的启动子进行了克隆和研究,发现E-box,G-box和T/G-box等JA-responsive顺式作用元件广泛存在于紫杉醇合成酶基因启动子上,表明MYC2是响应JA信号并调控紫杉醇生物合成的重要转录因子。其中,紫杉醇合成酶TASY基因启动子与PR(Pathogen-Related)、STR(Strictosidine synthase)、PMT2(putrescine N-methyltransferase 2)等JA响应基因的启动子具有相同结构,即近端分布的T/G-box及串联的G-box和GCC-box顺式作用元件,说明TASY是JA调控紫杉醇合成模式中的的重要靶点,同时也表明了ERF(Ethylene Responsive Factor)和MYC2转录因子在JA调控紫杉醇合成模式中具有重要作用。因此,本文以筛选调控tasy基因表达的erf和myc2为切入点,然后进一步揭示两类转录因子在ja信号调控紫杉醇合成模式中发挥的作用。(2)与jre元件相互作用的tcerfs的克隆与功能分析。启动子活性分析表明t/g-box、cgtca-motif和gcc-box是tasy基因响应ja的功能元件,其中gcc-box发挥了最关键作用。根据gcc-box能够特异与erf类转录因子相互作用的特性,从中国红豆杉转录组中筛选获得94个ap2/erebp转录因子。进一步研究发现其中23个蛋白序列具有erf的特征碱基。分析meja处理前后两个细胞系的转录组发现,表达量发生显着变化的有13个:其中4个表达量显着上升,9个表达量显着下调。利用序列分析等筛选得到两个erf类转录因子tcerf12和tcerf15,两者分别编码典型的b1和b3类gcc-box-bindingerf转录因子。酵母单杂交、红豆杉细胞体内共表达及超表达实验均表明,tcerf12和tcerf15能够通过结合gcc-box而分别抑制和激活tasy基因的表达。(3)ja信号途径上游基因tcmyc2的克隆及功能验证。在中国红豆杉转录组数据库中筛选得到具有完整的myc2转录因子特征结构的tcmyc2,其蛋白序列与atmyc2、ntmyc2和crmyc2具有极高的相似性,进化分析也表明它们具有极近的亲缘关系,意味着tcmyc2在红豆杉中有相似的作用。tcmyc2与tasy启动子顺式作用元件的相互作用实验证明,tcmyc2能够与t/g-box、g-box相互作用并进而激活tasy基因表达。而且,tcmyc2不仅能够激活tasy,t5h,tat,bapt,t13h等紫杉醇合成酶基因,还能够激活tcerf12和tcerf15的表达。以上结果表明,tcmyc2对于响应ja信号并调控植物次级代谢产物合成具有重要作用。(4)ja信号途径上游基因tcjaz的克隆及功能验证。通过对红豆杉中tcjaz基因的研究发现,除groupv亚家族外,其他的jaz蛋白在裸子植物与被子植物中具有不同的进化路径。因此,挑选groupv亚家族中的tcjaz3作为研究红豆杉中ja信号通路的目标因子。酵母双杂交实验证明,tcmyc2能够与tcjaz3相互作用,tcjaz3能够在红豆杉体内与tcmyc2结合从而抑制其活性。表明中国红豆杉体内同样存在jaz-myc沉默体的调控模式。综上,本文初步总结了以tcerf12/15、tcmyc2和tcjaz3为核心的ja信号调控中国红豆杉紫杉醇生物合成的模式,为构建高产转基因细胞系或植株奠定了基础。同时,本文初次报道了TcERF12响应JA信号并负调控植物次级代谢产物合成的现象,为完善JA信号调控网络奠定了基础。(本文来源于《华中科技大学》期刊2016-02-01）
彭富君,姚文兵,顾觉奋[7]（2015）在《紫杉醇药物中间体的微生物生物合成进展概述》一文中研究指出紫衫醇是一种高效、低毒、广谱的属于二萜类生物碱天然抗癌药物,通过抑制微管解聚和稳定微管的作用来抑制有丝分裂,已在临床上广泛使用,市场需求量大。由于其来源红豆杉生长缓慢,含量低,紫衫醇分子复杂,化学全合成虽已完成,但产量低,难以应用于工业生产,半合成方法虽较为成熟,但仍然依赖于红豆杉资源。合成生物学技术已被应用于紫衫醇的合成研究中,本文简要分析了紫杉醇药物中间体在大肠埃希菌和酵母菌工程细胞中异源生物合成途径的组建和代谢调控,概述了该技术的进展及所面临的问题。(本文来源于《国外医药(抗生素分册)》期刊2015年04期）
邱德有,张彬,杨艳芳,邵芬娟,滕文静[8]（2015）在《紫杉醇生物合成研究历史、现状及展望》一文中研究指出紫杉醇是从红豆杉中分离出来的一种二萜类化合物,是目前临床上使用最广泛的抗癌药物之一。回顾了紫杉醇生物合成的研究历史,主要包括参与红豆杉紫杉醇生物合成的结构基因、调控基因、红豆杉代谢组、内生真菌紫杉醇生物合成研究历史以及国际上紫杉醇生物合成专利情况等。介绍了近年来红豆杉和内生真菌紫杉醇生物合成研究的现状。最后探讨了本领域未来的研究方向并对其前景进行展望。(本文来源于《生物技术通报》期刊2015年04期）
彭涛,林军,胡海峰,朱宝泉[9]（2015）在《生物合成紫杉醇的研究进展》一文中研究指出紫杉醇是红豆杉及其内生真菌产生的萜类次级代谢产物,作为有效的抗癌药物,目前生产主要依赖于红豆杉,供求矛盾十分突出。为解决紫杉醇来源匮乏的问题,开展了多项代替红豆杉的研究。本文总结近年红豆杉细胞培养和微生物组合生物合成方面的研究进展,供生物合成紫杉醇的进一步研究参考。(本文来源于《世界临床药物》期刊2015年03期）
陈蕾[10]（2014）在《海南粗榧紫杉醇生物合成的研究》一文中研究指出海南粗榧(Cephalataxus mannii)属于国家二级重点保护植物,其枝叶、种子和树皮中都含有多种具有抗癌活性的次生代谢物质,具有极高的经济价值,一直以来都是研究的热点。本研究以紫杉醇作为切入点针对海南粗榧植株中次生代谢产物的生物合成开展了相关研究。利用转录组测序,通过基因克隆获得海南粗榧中紫杉醇合成相关基因,并通过茉莉酸甲酯(MeJA)诱导研究紫杉醇合成相关基因的表达、调控等特征。同时建立海南粗榧悬浮细胞系,通过茉莉酸甲酯诱导研究海南粗榧悬浮细胞紫杉醇合成的作用方式。主要结果如下：(1)成功对差异处理的海南粗榧叶片进行了转录组测序,并进一步对获得的基因片段信息、基因功能注释及基因差异性表达分别进行了分析。(2)根据转录组测序基因片段BLAST对比获得的紫杉醇合成相关酶基因片段,利用RACE技术,首次克隆出海南粗榧紫杉烷13α-羟化酶基因、海南粗榧紫杉烯5α-羟基化酶基因、海南粗榧紫杉二烯合成酶基因、海南粗榧CF943基因的cDNA序列。对这4个基因序列进行了生物信息学分析。(3)利用茉莉酸甲酯(MeJA)模拟逆境胁迫处理海南粗榧叶片,通过Real TimePCR技术对海南粗榧紫杉烷13a-羟化酶基因的表达水平进行检测分析。发现参与紫杉醇生物关键酶基因紫杉烷13α-羟化酶基表达量上调,且变化幅度较大。(4)成功建立了海南粗榧悬浮细胞系,并利用HPLC检测方法检测海南粗榧悬浮细胞中紫杉醇的含量。结果表明,细胞延迟期,紫杉醇含量较高；细胞分裂期,紫杉醇含量降低；细胞稳定期,紫杉醇含量升高。(5)利用茉莉酸甲酯(MeJA)对海南粗榧悬浮细胞进行人工诱导,结果表明茉莉酸甲酯处理能够促进海南粗榧悬浮细胞中紫杉醇的生物合成。(本文来源于《海南大学》期刊2014-05-01）
紫杉醇生物合成论文开题报告
（1）论文研究背景及目的
此处内容要求：
首先简单简介论文所研究问题的基本概念和背景，再而简单明了地指出论文所要研究解决的具体问题，并提出你的论文准备的观点或解决方法。
写法范例：
紫杉醇是临床上广泛使用的抗癌药物,主要从红豆杉植物中提取获得,但天然提取得到的紫杉醇远不能满足临床需求,寻求新的紫杉醇药源途径迫在眉睫,发展合成生物学技术是解决紫杉醇供需矛盾的重要途径。目前,紫杉醇生源路径中大部分酶的基因已被确认,但尚有母核上较多细胞色素P450羟化酶基因及其功能未被确认,尤其是母核上C1、C4和C9位对应的细胞色素P450羟化酶基因尚未发现,这是目前研究紫杉醇合成生物学技术的热点和难点。本课题基于中国红豆杉转录组数据,对红豆杉CYP450基因进行系统鉴定,通过功能注释及表达差异分析,挖掘紫杉醇生物合成相关的新的羟化酶候选基因,并通过基因克隆及功能研究进行候选基因的确认。取得的主要研究结果如下:1)中国红豆杉CYP450基因的系统鉴定基于中国红豆杉转录组数据,发现了118个全长和175个非全长的中国红豆杉CYP450基因。其中,除了5个基因(TcCYP725A1,TcCYP725A2,TcCYP725A4,TcCYP725A5,TcCYP725A6)被报道,以及另一个TcCYP725A3与已知的东北红豆杉的CYP725A3同源性达99%外,绝大多数CYP450基因都由本文首次发现。获得的118个中国红豆杉全长CYP450经国际标准化分类和命名,被分为8个聚类(clan)和29个家族,同时被分为两个类别:A-type和non-A-type。其中,52个基因(44.1%)属于A-type(71 clan),归属于11个家族,剩下的66个基因(55.9%)为non-A-type,分属于18个家族和7个clan。其中,在non-A-type中还发现两个新的CYP450家族,即CYP864和CYP947。进化分析表明,中国红豆杉CYP450的遗传组成与裸子植物云杉较为一致,而与被子植物拟南芥、苜蓿等有较大差异。中国红豆杉CYP450s虽然高度分化成多个家族,但仍然有着结构上的保守特征,包括PFG element,PERF motif,K-helix region和I-helix region。2)紫杉醇生物合成相关CYP450羟化酶候选基因的筛选对鉴定到的118个全长中国红豆杉CYP450序列进行了功能注释。在Blast2Go中,这些CYP450s被划分为叁大类:细胞组分(cellular component)、生物过程(biological process)与分子功能(molecular function),又具体分为21个功能组。将这118个CYP450s序列提交至Swissport,Nt,Nr,COG,GO,KEGG数据库中,使用BLASTX程序进行比对,阈值设为E<1e~(-5)。结果表明,绝大多数CYP450s都得到了注释,其中有15个新的CYP725家族基因(从CYP725A9至CYP725A23)被注释到与紫杉醇生物合成相关。对中国红豆杉CYP450s的表达差异分析发现,注释得到的15个新的CYP725家族基因中,TcCYP725A9,TcCYP725A11,TcCYP725A16,TcCYP725A20,TcCYP725A22和TcCYP725A23这6个基因的表达规律与已知紫杉醇合成羟化酶基因的表达规律一致且与紫杉醇合成量呈正相关,是最可能的与紫杉醇生物合成相关的候选羟化酶基因。3)中国红豆杉TcCYP725A22和TcCYP725A23的克隆与酵母异源表达功能研究选取两个候选羟化酶基因TcCYP725A22和TcCYP725A23进行克隆,同时克隆了已知的紫杉烷C2位羟化酶基因T2αH作为阳性对照。选用高拷贝、诱导型酿酒酵母表达载体pESC-TRP将这叁个基因分别在WAT11中异源表达,Western blot结果表明,这几个目的蛋白均成功表达。为了鉴定出紫杉醇母核上未知的羟化酶,以具有多个潜在羟化位点的紫杉素作为底物,与C2位羟化酶T2αH、候选羟化酶TcCYP725A22和TcCYP725A23分别进行反应。反应产物的HPLC检测结果表明,T2αH可以对紫杉素进行转化,结果与文献报道一致。候选羟化酶TcCYP725A22对底物紫杉素表现出催化活性,依据质谱结果及反应底物紫杉素的分子结构,判断催化产物很有可能为添加了两个羟基的紫杉烷新衍生物,而TcCYP725A23对紫杉素未见有明显的催化活性。4)TcCYP725A22在中国红豆杉细胞体内的功能研究鉴于体外反应进行羟化酶功能探究体系中的紫杉烷底物难以获得,将具有潜在羟化功能的候选基因TcCYP725A22在中国红豆杉细胞中进行过表达,分析转基因细胞中紫杉烷类代谢物指纹图谱的变化情况,确定候选羟化酶基因的催化位点。结果发现,当TcCYP725A22基因过表达时,几个已知的紫杉醇合成相关的酶基因表达量也都有不同程度的上调;且细胞中各紫杉烷的含量普遍提高,其中H3T;decinnamoyl taxinine J;TC和TPT这4种物质的含量变化最为显着。综合分析这些物质的结构特点及酵母异源表达体外反应结果,可以判断TcCYP725A22最可能是一个新的C2位羟化酶基因。以上研究为进一步确定紫杉醇生物合成路径中的未知羟化酶奠定了基础,有助于完全解析紫杉醇生源途径,促进紫杉醇合成生物学技术的全面创立。
（2）本文研究方法
调查法：该方法是有目的、有系统的搜集有关研究对象的具体信息。
观察法：用自己的感官和辅助工具直接观察研究对象从而得到有关信息。
实验法：通过主支变革、控制研究对象来发现与确认事物间的因果关系。
文献研究法：通过调查文献来获得资料，从而全面的、正确的了解掌握研究方法。
实证研究法：依据现有的科学理论和实践的需要提出设计。
定性分析法：对研究对象进行“质”的方面的研究，这个方法需要计算的数据较少。
定量分析法：通过具体的数字，使人们对研究对象的认识进一步精确化。
跨学科研究法：运用多学科的理论、方法和成果从整体上对某一课题进行研究。
功能分析法：这是社会科学用来分析社会现象的一种方法，从某一功能出发研究多个方面的影响。
模拟法：通过创设一个与原型相似的模型来间接研究原型某种特性的一种形容方法。
紫杉醇生物合成论文参考文献
[1].朱平.香菇糖基水解酶及其在紫杉醇生物合成研究中的应用[C].中国菌物学会2018年学术年会论文汇编.2018
[2].廖卫芳.紫杉醇生物合成相关P450羟化酶基因的挖掘及功能研究[D].华中科技大学.2018
[3].匡雪君,王彩霞,邹丽秋,李滢,孙超.紫杉醇生物合成途径及合成生物学研究进展[J].中国中药杂志.2016
[4].陈清浦,廖卫芳,付春华,赵春芳,余龙江.紫杉醇生物合成途径中羟化酶的研究进展[J].生物工程学报.2016
[5].赵凯,宇璐,金昱言,马学玲,刘丹.内生真菌紫杉醇生物合成的研究现状与展望（英文）[J].生物工程学报.2016
[6].张蒙.中国红豆杉中JA信号调控紫杉醇生物合成模式研究[D].华中科技大学.2016
[7].彭富君,姚文兵,顾觉奋.紫杉醇药物中间体的微生物生物合成进展概述[J].国外医药(抗生素分册).2015
[8].邱德有,张彬,杨艳芳,邵芬娟,滕文静.紫杉醇生物合成研究历史、现状及展望[J].生物技术通报.2015
[9].彭涛,林军,胡海峰,朱宝泉.生物合成紫杉醇的研究进展[J].世界临床药物.2015
[10].陈蕾.海南粗榧紫杉醇生物合成的研究[D].海南大学.2014
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