论文摘要
棉花细胞质雄性不育（Cytoplasmic Male Sterility,CMS）系已应用于棉花杂交育种的生产实践,但棉花CMS机理尚不清楚。之前研究发现,哈克尼西棉CMS系线粒体基因组中存在一个特有的开放阅读框（ORF）:orf160,该ORF在棉花CMS系中是转录的,但在棉花正常可育系中未检测到该ORF的表达,推测orf160可能与棉花CMS相关。但该ORF在蛋白水平表达情况如何尚不清楚,且缺乏相应的研究用抗体,所以有必要制备出ORF160蛋白的抗体,为后续进一步探究orf160在蛋白表达水平的差异、明确orf160与棉花CMS的相关性奠定基础。本文对orf160基因进行原核表达密码子优化,合成并分析,PCR扩增并引入Rsr II和Not I限制性酶切位点,双酶切法构建重组表达载体;利用E.Coli BL21（DE3）原核表达目的蛋白ORF160,确定表达形式,优化表达条件,Ni2+柱纯化,抗His-tag抗体的Western Blot检测;以ORF160为抗原腹腔免疫Balb/C鼠制备鼠单抗,测定效价,鉴定抗体特异性,初步建立检测ORF160的双抗体夹心法。结果表明目的基因orf160共480 bp,编码159个氨基酸,将orf160双酶切后连接表达载体pET-B2M,经鉴定成功构建重组表达载体orf160-pET-B2M。目的蛋白ORF160在E.Coli BL21（DE3）中表达为包涵体蛋白,符合预期蛋白分子量;0.1 mM的IPTG,30℃诱导表达4 h为目的蛋白最佳表达条件,经Ni2+柱纯化的蛋白浓度为1.1 mg/mL;Western Blot结果显示ORF160与抗His-tag抗体特异性结合,说明成功表达目的蛋白;以纯化ORF160制备鼠单抗,共筛选出三株稳定分泌抗体的杂交瘤细胞株:2B9（6 400×）、2G10（6 400×）和3E9（3 200×）;特异性实验表明,三种抗体对目的蛋白具有特异性,初步建立检测ORF160的免疫学方法,检测限不高于1.25μg/mL。本实验成功构建原核表达载体orf160-pET-B2M,表达纯化ORF160蛋白;成功制备出抗ORF160鼠单抗,初步建立能够用于检测ORF160的免疫学检测方法。本研究为探究orf160与棉花CMS的相关性奠定基础。
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摘要ABSTRACT英文缩略表第1章 绪论 1.1 植物细胞质雄性不育 1.2 植物线粒体基因组中的细胞质雄性不育相关基因 1.3 棉花细胞质雄性不育相关基因研究进展 1.4 外源基因的原核表达 1.4.1 载体和宿主的选择 1.4.2 外源基因的优化 1.4.3 包涵体的成因及对策 1.5 抗体制备技术研究进展 1.5.1 多克隆抗体技术 1.5.2 单克隆抗体技术 1.5.3 基因工程抗体技术 1.6 研究目的与意义第2章 orf160 原核表达载体的构建 2.1 材料 2.1.1 菌种、质粒及引物 2.1.2 实验仪器及试剂 2.1.3 溶液配制 2.2 方法 2.2.1 orf160 基因的优化及分析 2.2.2 orf160-pMD18-T的构建 2.2.3 orf160-pET-B2M的构建 2.2.4 orf160-pET-B2M的鉴定 2.3 结果 2.3.1 orf160 基因的分析 2.3.2 orf160 基因的获得 2.3.3 orf160 基因与pMD18-T载体连接 2.3.4 orf160-pET-B2M的构建及鉴定 2.4 讨论 2.4.1 orf160 基因的获得及分析 2.4.2 表达载体的选择 2.4.3 重组表达载体的构建 2.5 本章小结第3章 ORF160 蛋白的表达及纯化 3.1 材料 3.1.1 实验菌种 3.1.2 实验仪器及试剂 3.1.3 试剂和溶液 3.2 方法 3.2.1 ORF160 蛋白表达与可溶性分析 3.2.2 ORF160 蛋白表达条件优化 3.2.3 ORF160 蛋白纯化及浓度测定 3.3 结果 3.3.1 ORF160 蛋白表达与可溶性分析 3.3.2 ORF160 蛋白表达条件优化 3.3.3 ORF160 蛋白纯化及浓度测定 3.4 讨论 3.4.1 ORF160 蛋白的表达条件 3.4.2 包涵体蛋白的处理 3.4.3 蛋白的纯化及浓度测定 3.5 本章小结第4章 单克隆抗体的制备 4.1 材料 4.1.1 实验动物及细胞 4.1.2 实验仪器及试剂 4.1.3 培养液和溶液配制 4.2 方法 4.2.1 ELISA间接法的优化 4.2.2 动物免疫程序 4.2.3 饲养层细胞的制备 4.2.4 SP2/0 的复苏与准备 4.2.5 脾细胞的制备 4.2.6 细胞融合 4.2.7 杂交瘤细胞的筛选 4.2.8 杂交瘤细胞的亚克隆 4.2.9 单克隆抗体效价及特异性检测 4.2.10 杂交瘤细胞的扩大培养和冻存 4.2.11 初步建立检测ORF160 蛋白的方法 4.3 结果 4.3.1 ELISA间接法确定最佳抗原包被浓度 4.3.2 动物免疫及血清抗体测定 4.3.3 杂交瘤细胞株的筛选 4.3.4 抗体效价测定 4.3.5 单克隆抗体特异性检测 4.3.6 初步建立检测ORF160 蛋白的方法 4.4 讨论 4.4.1 ELISA间接法测定抗体效价 4.4.2 动物免疫 4.4.3 细胞融合及筛选 4.5 本章小结第5章 结论与展望 5.1 结论 5.2 展望致谢参考文献附录A附录B 攻读硕士学位期间的成果和获奖
文章来源
类型: 硕士论文
作者: 任伟
导师: 张晓
关键词: 棉花,细胞质雄性不育,原核表达,单克隆抗体
来源: 长春理工大学
年度: 2019
分类: 基础科学
专业: 生物学,生物学
单位: 长春理工大学
分类号: Q943.2
总页数: 72
文件大小: 1685K
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相关论文文献
- [1].orf160在不同棉花CMS胞质中的表达分析[J]. 新疆农业科学 2015(03)
- [2].哈克尼西棉细胞质陆地棉雄性不育系orf160的克隆及遗传转化[J]. 作物学报 2013(09)
标签：棉花论文; 细胞质雄性不育论文; 原核表达论文; 单克隆抗体论文;
棉花细胞质雄性不育相关基因orf160的原核表达与抗体制备
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